Проведение ПЦР с детекцией продуктов амплификации в режиме реального времени при помощи прибора «Rotor-Gene 3000» (Corbett Research) 1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ.


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте файл и откройте на своем компьютере.
Рспгжежойж РЦС т ежужлчйжк рспефлупг бнрмйхйлбчйй г сжзйнж сжбмэопдп гсжнжой рсй рпнпъй В поле (1) выбрать использующийся тип ротора и В поле (1) задается оператор, в поле (2) при необходимости можно ввести комментарий к протоколу. В ReactionVolume реакционной смеси –25 профиля амплификации нажать кнопку EditProfile… (1). Программа проведения любых тестов при данном 40 times 15 secs Выбратьв поле (5) Указать параметры шага Изсписка Normal Speed нужное число шагов внутри цикла (см. таблицу и поле (12) выбрать из списка (11) , задать параметры шага (13) и (14) согласно таблице. Флажки для параметров Long Для определения каналов считывания нажать кнопку (14). Программа выдаст Для всех шагов в цикле, кроме последнего, Don’tAcure Для последнего шага в цикле, необходимо поместить в список AcquiringChannels: FAM/SYBR незадействованные каналы выбираются из списка (18) и перемещаются кнопками (19). По завершении выбора нажать кнопку После завершения создания протокола нажать кнопку Нажатькнопку Calibrate Acquiring Поставить флажок (23). Флажка (24) стоять не должно! В списке 25 выбрать канал FAM/SYBR и нажать кнопку (26). Выставить настройки согласно рисунку ниже: Повторить предыдущий п.п. для канала Закрытьокно . Если такая кнопка отсутствует, закройте окно мастера и в главном окне программы выберите SaveAs… 3. РПТУБОПВЛБ СЕБЛЦИИ БНРМИФИЛБЦИИ Лпнрмжлубчйё «Ожсбтлбрбооьк» Приготовить и промаркировать (маркировка наносится на крышку) пробирки для проведения амплификации, соответствующие рекомендациям производителя прибора, включая пробиркидля положительного контрольного образца ДНК и отрицательного контрольного образца. За 20 30 мин до приготовления амплификационной смеси извлечь комплект реагентов для амплификации из морозильника, разморозить содержимое. Пробирку с реакционной смесью тщательно встряхнуть для перемешивания содержимого. Приприготовлении амплификационной смеси необходимо все компоненты добавлять отдельными Приготовить рабочую смесь, смешав нужные количества разбавителя, реакционной смеси и полимеразы согласно таблице и тщательно перемешать пипетированием (если объем смеси <200 мкл) или полимеразу следует добавлять в последнюю очередь. Лпмйшжтугп рспвйспл (15 мкл/ пробирка 5ц сжблчйпообё тнжтэ, нлм рпмйнжсбиб, нлм (0,2 мкл/пробирка) Внести в приготовленные пробирки, по 20 мкл полученной рабочей смеси. Добавить во все пробирки по 15 20 мкл минерального масла. Добавить во все пробирки индивидуальными наконечниками с аэрозольными фильтрами по 5 мкл: г рспвйслф пусйчбужмэопдп лпоуспмэопдп пвсбичб г рспвйслй йттмжефжньц пвсбичпг исследуемые образцы ДНК; (дляколичественного анализа) в пробирки стандартных образцов стандартные образцы с известной концентрацией ДНК (в состав набора не входят). г рспвйслф рпмпзйужмэопдп лпоуспмэопдп пвсбичб положительный контрольный образец ДНК Дляснижения риска контаминации образцы следует добавлять в указанном порядке. Пробирку, в которую был внесен образец, следует по возможности немедленно закрывать крышкой. Пробирки закрыть и установить в прибор, уравновесив ротор (если уравновешивание одними лишь амплификационными пробирками невозможно, следует использовать аналогичные пробирки с водой). Прижать крышки пробирок прижимным кольцом. OneStep» Достать пробирки с амплификационной смесью, положительным контролем и разбавителем из холодильника в соответствии с количеством анализируемых образцов. При необходимости, если часть раствора находится на внутренней стороне крышки пробирки, отцентрифугировать пробирки 3 5 сек на микроцентрифуге Расставить пробирки в указанном в протоколе измерений порядке Добавить во все пробирки индивидуальными наконечниками с аэрозольными фильтрами по 5 мкл: б) г рспвйслф пусйчбужмэопдп лпоуспмэопдп пвсбичб в) г рспвйслй йттмжефжньц пвсбичпг исследуемые образцы ДНК; (опциально; необходимо для количественного анализа) в пробирки стандартных образцов стандартные образцы с известной концентрацией ДНК (в состав набора не входят). д) г рспвйслф рпмпзйужмэопдп лпоуспмэопдп пвсбичб положительный контрольный образец ДНК Для снижения риска контаминации образцы следует добавлять в указанном порядке. Пробирку, в которую был внесен образец, следует по возможности немедленно закрывать крышкой. Пробирки плотно закрытьиперенести в прибор. В 1 гнезде ротора обязательно следует установить пробирку с положительным контрольным это необходимо для калибровки прибора. Если в барабане установлены пробирки относящиеся к разным тестам, выбор устанавливаемого в 1 гнездо положительного контрольного образца не имеет значения и остается на выбор пользователя. Открыть окно NewRun запускается при старте программы, либо вызывается из основной панели инструментов главного окна программы На вкладке (1) выбрать созданный ранее протокол (2) и дважды кликнуть по нему. В списке (1) проверить тип ротора. При использовании 200 мкл пробирок с плоскими крышками поставить флажок (2). Нажать на кнопку Пропустить все последующие последнего Убедиться, что все соответствуют заданным и нажать кнопку (1). Программа запросит имя файла, в котором будет сохранён . Тпиебойж й сжеблуйспгбойжрспуплпмб сбтрпмпзжойё пвсбичпг С началом прогона программа выведет окно мастера редактирования расположения образцов в роторе: Расположение и описание образцов можно полностью задать в предложенном окне мастера. Однако, эту операцию можно и отложить, проведя позже в любой момент прогона, после его окончания или при анализе полученных результатов. Для этого окно мастера следует закрыть нажатием на кнопку Закрытие окна мастера нажатием кнопки FinishandLockSamples приведет к фиксированию введенной информации и невозможности ее дальнейшей корректировки. Использование этой кнопки допустимо только в том случае, если есть полная уверенность, что введенную информацию далее корректировать не придется! Продолжить редактирование расположения и описания образцов можно из главного окна программы, когда ни один из мастеров не является активным. Для этого в правой части окна следует нажать кнопку EditSamples… Выдаваемое при этом окно является полным функциональным аналогом окна мастера. Види функциональное назначение поля (2) может значительно меняться в зависимости от того, для редактирования какого столбца оно используется. Выделить в столбце (3) клетку, соответствующую положению редактируемого образца. В строке (2) задать название пробы. Выделить в столбце (4) клетку, соответствующую положению редактируемого образца. Из выпадающего списка (2) выбрать тип образца: отсутствие пробирки в гнезде исследуемый образец стандартный образец с известной положительный контрольный образец отрицательныйконтрольный образец Если в постановке присутствуют стандартные образцы, то необходимо выполнить следующие действия: (5) выбрать единицы измерения концентрации стандартов; GivenConc. Format: (6) выбрать предпочтительный формат задания концентрации; GivenConc. (7) ввести концентрации для каждого стандартного образца. Сгруппировать пробирки согласно проводимым в них тестам. Для этого: More Options Samples –More Options Define Groups В появившемся окне DefineGroups В появившемся окне EditGroup задать в поле обозначение теста, в поле можно указать полное Закрыть последовательно окна Samples –More Options Рсй пуожтжойй рспвйспл л дсфррж, рспдсбннб бгупнбуйшжтлй фебмёжу йи трйтлб уж дсфррь, л лпупсьн ож пуожтжоб ой пеоб рспвйслб. Рпюупнф пеопгсжнжоопж ибебойж ожтлпмэлйц дсфрр ёгмёжутё ожчжмжтппвсбиоьн. В столбце (9) выделить ячейки, соответствующие образцам, для которых была создана группа. В появившемся окне поставить флажок для выбранного Повторить все описанные в п. действия для остальных проводимых в рамках сессии тестов. ЕЕУЕЛЦИа РСПЕФЛУПВ БНРМИФИЛБЦИИ Детекция продуктов амплификации осуществляется прибором автоматически в каждом цикле амплификации. На основании этих данных управляющая программа строит кривые накопления флуоресцентного сигнала по каждому из заданных для образцов каналов. 5. БОБМИИИ ИОУЕСРСЕУБЦИа СЕИФМЬУБУПВ По окончании амплификации нажать в главном окне кнопку В появившемся окне выбрать вкладку (2), выделить надпись CyclingA. FAM/Sybr (3) и нажать кнопку В окне на вкладке (2), выделить надпись CyclingA. JOE (3) и В главном окне программы появится 6 окон: Сделать активными в поле (1) все образцы, относящиеся к одному тесту. Максимизироватьокно Quantitation Analysis –Cycling A. FAM/Sybr Установить следующие параметры обработки (см. рис.): –Log Scale; Eliminate Cycles before (10) –10; нажать кнопку IgnoreFirst (8) и установить в поле IgnoreFirst Нажать кнопку Нажать кнопку Лпожшоьк чйлм (ЛЦ) Вофусжоойк лпоуспмэ 35 Chlamydia trachomatis Herpes simplex virus 1* Herpes simplex virus 1+2 Herpes simplex virus 2* papilloma virus 16+18 papilloma virus 6+11 Mycoplasma genitalium Mycoplasma hominis faecium Enterobacter spp., Klebsiella spp. Streptococcus pyogenes Corynebacterium diphteriae Mycobacterium (tuberculosis+bovis) Enterobacteriaceae л чжхбмптрпсйобн Staphylococcus aureus лчжхбмптрпсйобн Типоспецифичные наборы Наборы без дифференцировки типа. значение из таблицы, соответствующее выбранному каналу и тесту. Вернуть окну обычный размер кнопкой (12). Quantitation Analysis –Cycling A. JOE Поскольку во всех тестах используется единая система внутреннего контроля, то задаются 1 раз за сессию. Нажать на панели инструментов главного окна кнопку В появившемся окне следует выбрать тип обработки и канал, по которым будет создаваться CyclingA.FAM/Sybr а также тип отчета (17). Нажать Программа выведет окно , в котором осуществляется просмотр отчета, а также все операции по его сохранению, экспорту в другие программы и печати. Отчет следует сохранить в наиболее удобном форматеи, при необходимости, распечатать. JOE(19). ReportBrowser для остальных тестов, проводившихся в рамкахданной сессии. Иоужсрсжубчйё сжифмэубупг лбшжтугжоопдп бобмйиб производится согласно таблице (значения конечных циклов КЦ для каждого возбудителя и внутреннего контроля приведены выше): Интерпретация результатов: В таблице использованы следующие обозначения: tFAM цикл пересечения кривой накопления специфического флуоресцентного сигнала образца с пороговой CtJOE(HEX) цикл пересечения кривой накопления флуоресцентного сигнала внутреннего контроля образца с пересечение кривой накопления флуоресцентного сигнала с пороговой линией не зарегистрировано; конечный цикл пересечения кривой накопления флуоресцентного сигнала с пороговой линией после него полностью аналогично ситуации, когда пересечение не зарегистрировано вовсе. Специфическая реакция прошла Специфическая реакция не прошла. повтор постановки. Контаминация геномной ДНК человека. Повтор постановки НЕ ТРЕБУЕТСЯ. Специфическая контаминация отсутств Специфическая контаминация. Контаминация геномной ДНК человека. Повтор постановки НЕ ТРЕБУЕТСЯ. ПРИСУТСТВИЕ ДНК возбудителя. ОТСУТСТВИЕ ДНК возбудителя. Ингибирование или недостаточное выделение ДНК анализа данного образца. Иоужсрсжубчйё сжифмэубупг лпмйшжтугжоопдп бобмйиб (чувствительность наборов см. в основной части инструкции, КЦ для внутреннего контроля составляет 35 циклов): Интерпретация результатов: В таблице использованы следующие обозначения: tFAM цикл пересечения кривой накопления специфического флуоресцентного сигнала образца с пороговой CtJOE(HEX) цикл пересечения кривой накопления флуоресцентного сигнала внутреннего контроля образца с пересечение кривой накопления флуоресцентного сигнала с пороговой линией не зарегистрировано; конечныйцикл пересечения кривой накопления флуоресцентного сигнала с пороговой линией после него полностью аналогично ситуации, когда пересечение не зарегистрировано вовсе. Специфическая реакция прошла Специфическая реакция не прошла. повтор постановки. Контаминация геномной ДНК человека.Повтор постановки НЕ ТРЕБУЕТСЯ. Специфическая контаминация отсутствует. Специфическая контаминация. Контаминация геномной ДНК человека.Повтор постановки НЕ ТРЕБУЕТСЯ. ПРИСУТСТВИЕ ДНК возбудителя. ОТСУТСТВИЕ ДНК возбудителя. Ингибирование или недостаточное выделение ДНК анализа данного образца. Надежными можно считать численные значения только для тех образцов, значения которых лежат между максимальным и минимальным значениями для стандартных образцов!

Приложенные файлы

  • pdf 7103703
    Размер файла: 2 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий