Гомология между протеинами 48,92%, в связывании кризотиниба участвуют 22 аминокислоты ALK и 18 аминокислот ROS1CONFIDENTIAL – FOR TRAINING PURPOSES ONLY.


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
20.04.2017

1

ALK

и

ROS1
-
тестирование у
пациентов с
немелкоклеточным

раком легкого

Зав лабораторией ГБУЗ «МГОБ №62 ДЗМ» Демидова И.А.

CONFIDENTIAL



Потенциальные цели для таргетной
терапии аденокарциномы
легкого

Savas

P, et al. J
Thorac

Dis 2013;5:S579

S592.

20.04.2017

2

CONFIDENTIAL


FOR TRAINING PURPOSES ONLY. DO NOT COPY, DETAIL, OR DISSEMINATE.

Тирозинкиназы

ALK,


CONFIDENTIAL


FOR TRAINING PURPOSES ONLY. DO NOT COPY, DETAIL, OR DISSEMINATE.

Гомология между протеинами
ALK
и
ROS1

Гомология между протеинами = 48,92%, в связывании
кризотиниба


участвуют 22 аминокислоты
ALK

и 18 аминокислот
ROS1

Ou et al, Expert Rev. Anticancer Ther. 2012

20.04.2017

3

CONFIDENTIAL



ALK+

ROS1+

Идентичность клинического
эффекта терапии кризотинибом

Перестройки гена
ALK

при
злокачественных опухолях

Нозология

Гены
-
партнеры

Частота встречаемости

Анапластическая Т
-
клеточная

лимфома

9 партнеров, самый частый

-

NPM

Около

30%

у взрослых, от 50
до 9
0%
у

детей

Воспалительная

миофибробластическая

опухоль

7 партнеров, самый частый


TPM3

36
-

50% случаев

НМРЛ

Более

10

партнеров, самый
частый



EML4

2
-
5% случаев

ДБККЛ

NPM,

CLTC1, SQSTM1, SEC31A

Не установлена

РМЖ

EML4

5% (?)

Колоректальный

рак

EML4, C2orf44

5%

Плоскоклеточный рак
пищевода

TPM4

Не установлена

(1%)

Рак

почки

VCL, EML4, TPM3

Не установлена

(1%)


Palmer RH,
Vernersson

E. et al. B.
Biochem

J. 2009
:
Roskoski

R, Pharm Research 2013

20.04.2017

4

Реарранжировки

гена
ALK

при НМРЛ


При НМРЛ обнаружены в 2007 г
(
Soda et al)



Наиболее частый механизм
образования

(95%)



парацентрическая инверсия 2р
и образование химерного
онкогена
EML4/ALK
, часто


с
частичной
делецией

5


последовательностей

ALK



Межхромосомные

перестройки
с участием других генов
регистрируются все чаще в связи
с развитием
NGS

и других новых
технологий

Soda et al, Nature 2007, Cheng et al, Modern
Pathol

2012

Химерные онкогены с участием
ALK

при НМРЛ


Известно

как

минимум

13

типов

химерного

транскрипта

EML
4
/ALK



Во

всех

случаях

в

транслокации

участвует

тирозинкиназный

домен

ALK

(
экзоны

20
(
19
)



29
)



Химерные

протеины

экспрессируются

с

различной

интенсивностью,

отличаются

конформационными

особенностями

и

скоростью

распада

Show and
Engelman
, J
Clin

Oncol

2013;
Heuckmann

et al,
Clin

Cancer Res 2012

20.04.2017

5

Метод
FISH

для определения
перестроек
ALK


FDA

рекомендует
Vysis

LSI ALK Break Apart
Rearrangement Probe
Kit




Кроме того,
существуют пробы
Dako
,
Metasystems
,
Abnova
,
Createch
(
тот
же принцип),

а также

Createch

и
ZytoCell

для
определения слитного
сигнала
EML4/ALK


Собственные данные лаборатории МГОБ 62

Современный подход
-
использование ИГХ

как
скринингового

метода для выявления химерных
протеинов
ALK

при НМРЛ


Используются коммерчески
доступные антитела (

5A4 Leica,
ALK
Ventana

)
, причем
реагентика

компании
Ventana

обладает
более высокой
чувствительностью и
специфичностью, что позволило
FDA

зарегистрировать в 2015
году этот тест как
диагностический


Однако, в связи с высокой
частотой артефактов при
нарушениях
преаналитики

рекомендовано подтверждение

FISH
всех сложных и позитивных
случаев

5ALK4 (
Lieca
)

D5F3 (
Ventana
)

Mino
-
Kenudson

Clin

Cancer Res 2010, c
обственные

данные лаборатории МГОБ 62

20.04.2017

6

CONFIDENTIAL



Определение

мутаций

гена

EGFR


(региональные
лаборатории)

Определение перестроек гена
ALK
(ИГХ)

(
референсные

лаборатории)

Прекращение
тестирования

Образец НМРЛ,
идентифицирован как
неплоскоклеточный

Собственные данные лаборатории МГОБ 62

(
-
)

Подтверждение
FISH

(+)
или
сомн
.

(+)

(
-
)

Прекращение
тестирования

(+)

Прекращение
тестирования

(
ALK

ингибитор)

(
-
)

Альтернативный
метод


Алгоритм RUSS/O для
определения перестроек !LK

CONFIDENTIAL



Данные

RUSSCO
;

www
.
rosoncoweb
.
ru
;

www
.
cancergenome
.
ru




ALK

абс.

%

Да
-

мутация
выявлена

500

6.9%

Нет
-

мутация
отсутствует

6010

82,9%

Не определен

740

10,21%

Всего

7250

100,00%

500; 7%

6010; 83%

740; 10%

ALK

Да
-

мутация
выявлена

Нет
-

мутация
отсутствует

Не
определен

Результаты определения
перестроек гена !LK (02.12
-
12.16)

20.04.2017

7

CONFIDENTIAL


FOR TRAINING PURPOSES ONLY. DO NOT COPY, DETAIL, OR DISSEMINATE.

Одобрение
XALCORI FDA
для
ROS1

Mar 17, 2016

FDA Approves New
ROS1 Indication for
Xalkori With Post
-
Marketing CDx
Commitment

Genomeweb
. com 2015

CONFIDENTIAL


FOR TRAINING PURPOSES ONLY. DO NOT COPY, DETAIL, OR DISSEMINATE.

ROS1


Открыт более 20 лет назад, но
структура описана полностью в 2003


Лиганд до сих пор не известен,
основной механизм активации


димеризация, хотя признаки
существования лиганда есть


До сих пор не удается воссоздать
полноразмерный протеин в клетках
млекопитающих


Вирусный протоонкоген
v
-
ROS
,
окногенного эффект которого


мембранная фиксация
-

реализуется некоторыми химерными
ROS
-
протеинами


Активирует типичные для
рецепторной тирозинкиназы пути
через
STAT3, PI3K, AKT

J. Acquaviva et al. / Biochimica et Biophysica Acta 1795
(2009) 37

52

20.04.2017

8

Перестройки гена
ROS1

при
злокачественных опухолях

Нозология

Гены
-
партнеры

Частота встречаемости

Глиобластома

FIG,

CEP85L

Около 3%

Воспалительная

миофибробластическая

опухоль

TFG, YWHAE

Около

10%
случаев (у детей)

НМРЛ

SLC34A2,

CD74, EZR, TPM3,

SDC4,
FIG, CCDC6

Около

2% случаев

Холангиокарцинома

FIG

9
-
16%

(?)

Серозный

рак яичников

FIG

Не установлена

Колоректальный

рак

SLC34A2

Не установлена

Рак

желудка

SLC34A2

Не установлена

Ангиосаркома

CEP85L

Не установлена


Doebele

Clin

Cancer Res 2013,
Dorta

Antonescu

Am J
Surg

Pat 2015, Al
-
Sanea

Curr

Med
Chem

2016

CONFIDENTIAL


FOR TRAINING PURPOSES ONLY. DO NOT COPY, DETAIL, OR DISSEMINATE.

Реарранжировки

гена
ROS1

при
НМРЛ



При НМРЛ впервые
описаны в 2007 г (
Rikova

et al)


Механизм образования,
как правило


интерхромосомные

реарранжировки
, редко


интрахромосомная

микроделеция

с
образованием химерного
гена FIG/ROS1
(GOPC/ROS1)
, более
характерная для
глиобластомы

и
холангиокарциномы

Gu L and Guo A, Cell Signalling, patent AU2008314567

20.04.2017

9

CONFIDENTIAL


FOR TRAINING PURPOSES ONLY. DO NOT COPY, DETAIL, OR DISSEMINATE.

Химерные онкогены с участием
ROS1




Известно не менее 10
генов
-
партнеров и 16
видов химерных
транскриптов




Наиболее частые гены
-
партнеры:
SLC34A2,
CD74, SDC4


Влияние типов
транскриптов

на ответ
на терапию неизвестно

Stumpfova M, Janne P, Clin Cancer Res 2012

CONFIDENTIAL


FOR TRAINING PURPOSES ONLY. DO NOT COPY, DETAIL, OR DISSEMINATE.

Основные
харатеристики

перестроек с участием
ROS1


Частота встречаемости


0,6
-
3%
среди больных с
аденокарциномами



Классический метод

детекции

-

FISH


Наиболее частый
гистологический тип


пока не
охарактеризован


Характерны для некурящих,
молодых больных


Появилась адекватная ИГХ и
NGS
диагностика, однако, пока
не зарегистрированная для
диагностических целей


Bergeton K, JCO 2012
, собственные данные лаборатории МГОБ 62

20.04.2017

10

CONFIDENTIAL


FOR TRAINING PURPOSES ONLY. DO NOT COPY, DETAIL, OR DISSEMINATE.

Реагенты и методики для
ROS1

тестирования


Метод

Производитель

Реагент

Статус

регистрации

FISH

Cytocell

ROS1 Dual Color Break Apart Probe

CE
-
IVD

Zytovision
/
Zytomed

ZytoLight

Spec ROS1 Dual Color Break
Apart Probe

CE
-
IVD

Abbott

ROS 1 Break
-
Apart FISH

RUO

IHC

Cell Signaling
Technologies

ROS1 D4D6 rabbit monoclonal antibody

RUO

RT
-
PCR

AmoyDx


ALK and ROS1 gene fusion detection kit

CE
-
IVD

NGS

Thermo Fisher

Oncomine

Fusion panel (ALK, ROS1, RET
and NTRK1)

CE
-
IVD

ArcherDx

FusionPlex
™ !LK, RET, ROS1 v2 Panel

RUO

Bubbendorf et al, Virchows Arch, August 2016

CONFIDENTIAL


FOR TRAINING PURPOSES ONLY. DO NOT COPY, DETAIL, OR DISSEMINATE.

Возможно ли использование ИГХ для
первичной диагностики перестроек
ROS1?


Антитело (
D4D6)
, по данным
последних исследований
обладает достаточно высокой
чувствительностью, и
специфичностью от, однако, в
связи с специфическими
артефактами позитивные и
сомнительные случаи требуют
дополнительного исследования
методом
FISH
.


Кроме того, пока не до конца
отработана система оценки
позитивности

Тем не менее,
скрининговое

определение
ROS1

методом
ИГХ вполне возможно



Cha et al, PlOS ONE^, 2014

20.04.2017

11

CONFIDENTIAL


FOR TRAINING PURPOSES ONLY. DO NOT COPY, DETAIL, OR DISSEMINATE.

Варианты позитивного
окрашивания


a,b


типичное диффузное
или гранулярное
цитоплазматическое
окрашивание


с


цитоплазматическое +
membrane
-
attenuated
окрашивание


d


гетерогенное
окрашивание

Bubbendorf et al, Virchows Arch, August 2016

CONFIDENTIAL



Результаты сравнительного
исследования ИГХ и
FISH


Одновременно исследовано 37 образцов:


6


неудача одним из методов (5
-
FISH, 1
-
ИГХ),


1


оба метода были неэффективны




По данным ИГХ
и
з 30 случаев:


14 негативных


11позитивных


5 сомнительных


FISH
подтвердил все негативные случаи и 9 из 11 позитивных.

(Все сомнительные случаи по результатам ИГХ оказались негативными
по данным
FISH
)



Чувствительность и специфичность методов будет определена по достижении
более статистически значимого количества исследований


в целом, число расхождений не превышает 5%


Особую настороженность
в
ызывает качество образцов


в 17% случаев не
удалось выполнить подтверждающее исследование из
-
за их низкого качества


Данные ПАО и лаборатории
молбиологии

МГОБ 62

20.04.2017

12

CONFIDENTIAL



Алгоритм

RUSS/O для определения
перестроек !LK
/ROS1

20.04.2017

13

CONFIDENTIAL



Результаты определения
перестроек гена
ROS1

(
0
9
.1
6
-
04
.1
7
)


Всего протестировано 293 образца (в 10 случаев
выявлена
перестройка)


Из них методом ИГХ


258


ИГХ+
FISH


30


Толь
к
о
FISH


5

275; 94%

10; 3%

8; 3%

Статус мутации
ROS
-
1

Мутация

отсутствует

Мутация

выявлена

Не определен

CONFIDENTIAL


FOR TRAINING PURPOSES ONLY. DO NOT COPY, DETAIL, OR DISSEMINATE.

Процент необходимых для подтверждения
FISH
случаев ИГХ
-
позитивных
ALK+

-

около 10%

Процент необходимых для подтверждения
FISH
случаев ИГХ
-
позитивных
ROS1+

-

около
1
5%
(
по данным литературы)

Часто это связано с неадекватной первичной обработкой
препаратов,

1)
Пребыванием вне фиксатора более 1 часа

2)
Фиксацией в
незабуференном

формалине

3)
Фиксацией менее 6 и более 72 часов


И, конечно, неадекватным взятием материала




НО на что следует обратить
особое внимание!

20.04.2017

14

CONFIDENTIAL


FOR TRAINING PURPOSES ONLY. DO NOT COPY, DETAIL, OR DISSEMINATE.

Памятка для врачей


УСЛОВИЯ ОТПРАВКИ МАТЕРИАЛА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МУТАЦИИ
ROS
1
:



Обращаем Ваше внимание, что
тестирование
ROS
1 будет

проводиться
пациентам
ТОЛЬКО

с
ОТРИЦАТЕЛЬНЫМ РЕЗУЛЬТАТОМ
ALK
.


Для отправки материала на тестирование на наличие мутаций гена
ROS
1
при регистрации больных с диагнозом НМРЛ (гистологический тип
-

аденокарцинома
) в системе необходимо будет выбрать одну из опций из
выпадающего списка в разделе «Какие гены исследовать?»
:


-

EGFR+ALK+ROS1


или


-
ALK+ROS1


или


-
Только
ROS
1 ( в случае, если ранее получен результат
ALK
отрицательный
)



Обращаем Ваше внимание, что отправка на тестирование !LK и ROS1
возможны при выборе только одной опции из выпадающего списка в
разделе «гистологический тип», а именно
:


-
«
аденокарцинома
»


Подробную информацию Вы найдете на главной странице сайта


www.cancergenome.ru


Данные

RUSSCO
;

www
.
rosoncoweb
.
ru
;

www
.
cancergenome
.
ru


CONFIDENTIAL


FOR TRAINING PURPOSES ONLY. DO NOT COPY, DETAIL, OR DISSEMINATE.

Спасибо за внимание!


Приложенные файлы

  • pdf 7055409
    Размер файла: 2 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий