Подробный механизм действия эндотоксина представлен в обзорах А. Браво с соавторами [Bravo et al., 2007, 2013]. 333p. Furuya S, Mochizuki M, Aoki Y et al. Isolation and characterization of Bacillus subtilis KS1 for the

НОВОСИБИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ АГРАРНЫЙ УНИВЕРСИТЕТ






М.В. Штерншис, А.А. Беляев, В.П. Цветкова, Т.В.Шпатова, А.А. Леляк, С.А. Бахвалов

БИОПРЕПАРАТЫ НА ОСНОВЕ БАКТЕРИЙ РОДА BACILLUS ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ ЗДОРОВЬЕМ РАСТЕНИЙ











НОВОСИБИРСК
ИЗДАТЕЛЬСТВО СИБИРСКОГО ОТДЕЛЕНИЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК
2016


УДК 632.937:579.26

Рекомендовано к печати Ученым советом Новосибирского государственного аграрного университета
Рецензенты:
Доктор биологических наук Л.А. Осинцева
Доктор биологических наук И.Г. Воробьева
Издание осуществлено при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект 14-16-00101)

В монографии изложены результаты исследований, проведенных в регионе Западной Сибири, климатические условия которого определяют достаточно сильное влияние абиотических факторов на взаимодействия в системе триотрофа (растение – повреждающий организм – полезная бактерия). Результаты многолетней работы коллектива авторов обсуждены в рамках концепции управления здоровьем растений в контексте с данными отечественных и зарубежных авторов. Основное внимание уделено возможностям разработки и использования полифункциональных биопрепаратов на основе антагонистических и энтомопатогенных бактерий рода Bacillus, в максимальной степени отвечающим концепции управления здоровьем растений.
Книга предназначена для широкого круга читателей - специалистов в области биотехнологии, защиты растений и экологии, а также на преподавателей и студентов вузов биологического и сельскохозяйственного профиля.




ВВЕДЕНИЕ
Микробные препараты, основой которых являются природные микроорганизмы, включая бактерии рода Bacillus, многие годы производятся во всем мире и используются в рамках интегрированной защиты растений для микробиологического контроля вредных организмов, повреждающих растения. В XXI веке в литературе все чаще в качестве синонима «интегрированная защита растений» стали употреблять термин «управление здоровьем растений» [Cook, 2000; Sharma, Singh, 2007; Berg, 2009]. В то же время некоторые авторы указывали на отличие этих двух понятий, например, по мнению Р. Кука [Cook, 2000], последнему термину более всего соответствует биологический контроль болезней растений, включая индукцию болезнеустойчивости. В настоящее время под управлением здоровьем растений подразумевают биологический контроль повреждающих их болезней и вредителей, связанные с этим эффекты колонизации корневой системы и надземной части растений микробными агентами биоконтроля, последующее усиление роста и развития растений, индукцию системной устойчивости, повышение сопротивляемости растений неблагоприятному влиянию абиотических факторов, усилению поглощения из почвы питательных веществ (микро- и макро-нутриентов), что в конечном счете ведет к увеличению продуктивности культур [Aroca, Ruiz-Lozanni, 2009; Yang et al., 2009; Verma et al., 2010]. Управление здоровьем растений предполагает знание факторов, влияющих на вредителей, болезни и физиологию растений, что зависит от их вида или сорта, а также от климатических особенностей региона произрастания. Понимание и преодоление негативного влияния биотических и абиотических факторов, лимитирующих растение в плане полной реализации его генетического потенциала, отвечает требованиям управления здоровьем растений. При этом биологический контроль фитопатогенных микроорганизмов и насекомых-фитофагов является наиболее значимым подходом к управлению здоровьем растений, способным учитывать влияние факторов окружающей среды при сохранении биоразнообразия в экосистемах.
Во всем мире, в том числе в России, в последние годы усилились исследования по разработке биологических препаратов на основе таких природных полезных организмов как бактерии рода Bacillus. Изучены, например, многочисленные штаммы B. subtilis, отличающиеся природным источником выделения и географическим происхождением [Пашкевич, 2009]. Важна селекция выделенных из природы полезных штаммов и дальнейшие исследования по выявлению оптимальных условий их культивирования для получения препаративных форм биопестицидов. Биологические препараты на основе полезных бацилл для защиты растений от вредителей и болезней являются экологически безопасной альтернативой химическим (синтетическим) пестицидам. Однако в сельском и лесном хозяйстве замещение химических пестицидов биопрепаратами для улучшения здоровья растений происходит не столь быстрыми темпами, как можно было бы ожидать. В частности, это связано с тем, что производителям растениеводческой продукции импонирует скорость и более широкий спектр действия химикатов. С этой точки зрения следует искать подходы к усилению роли микробных агентов биоконтроля в управлении здоровьем растений. Резервом такого подхода являются исследования по расширению функций микроорганизмов, составляющих основу потенциальных биопрепаратов. В России на примере разработки биопрепаратов гамаир (B. subtilis, штамм М-22 ВИЗР) и алирин-Б (B. subtilis, штамм В-10 ВИЗР) предложена концепция создания полифункциональных препаратов комплексного действия с фунгицидной, бактерицидной и фиторегуляторной активностью [Новикова, 2005]. Другим аспектом проблемы полифункционального действия биопрепаратов явилась демонстрация проявления штаммом энтомопатогенной бактерии Bacillus thuringiensis subsp. darmstadiensis одновременно инсектицидных и фунгицидных свойств наряду с ростостимулирующим эффектом [Гришечкина, Смирнов, 2010].
В развитие этих подходов вносят вклад исследования, показывающие, что при доминировании антагонизма одним штаммом бацилл дополнительно проявляются инсектицидные свойства, а в случае энтомопатогенных бактерий рода Bacillus наблюдают одновременное подавление фитопатогенных микроорганизмов с учетом взаимодействий в системе триотрофа наряду с ростостимулирующим эффектом, а также способностью повышать устойчивость растений к действию факторов окружающей среды. При включении бацилл в качестве основы биопрепаратов в ризосферную или эпифитную микрофлору растений происходит определенная модификация окружающей среды, полезная как для здоровья растений, так и для здоровья животных и человека, потребляющих растительную пищу.
В настоящем издании представлены результаты исследований авторов по многофункциональному действию бактерий рода Bacillus, участвующим в управлении здоровьем растений. Приведены данные по взаимодействию растений с фитопатогенами и фитофагами как основными повреждающими факторами для растения, с одной стороны, и объектами для действия биопрепаратов на основе Bacillus, с другой стороны. Обращено внимание на проблемы, возникающие при создании бактериальных препаратов для управления здоровьем растений. Подчеркнуты такие аспекты как проявление ростостимулирующих и инсекто-фунгицидных свойств бацилл - основы биопрепаратов, их способность индуцировать устойчивость растений к биотическим и абиотическим факторам среды в зависимости от вида или сорта культуры. В целом, проанализированы и обобщены многолетние данные лабораторных и полевых экспериментов, проведенных в сибирских условиях, в контексте с публикациями отечественных и зарубежных ученых.
Г л а в а 1
ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ МЕЖДУ РАСТЕНИЯМИ, ФИТОПАТОГЕНАМИ, ФИТОФАГАМИ И ПОЛЕЗНЫМИ БАЦИЛЛАМИ
1.1. Влияние фитопатогенных организмов на растения

Круг известных фитопатогенов (более 40000 видов) включает разнообразные группы организмов. Доминируют по количеству фитопатогенных видов и хозяйственному значению грибы (царство Mycota) (более 80% возбудителей наиболее вредоносных болезней основных сельскохозяйственных культур). Существенное значение имеют также фитопатогенные бактерии (Eubacteria) и вирусы (Vira). Известны фитопатогены среди вироидов (Viroids), слизевиков (Plasmodiophoromycota), микоплазм (Mollicutes), актиномицетов (Actinobacteria), риккетсий (Rickettsia) и цветковых растений (Magnoliophyta).
Инфекционные болезни растений – это болезни, которые имеют причиной взаимодействие растения с болезнетворными микроорганизмами и для которых общим признаком является передача от зараженного организма к здоровому. Характерная особенность инфекционных болезней – обязательное наличие чужеродного болезнетворного организма, который развивается на поверхности или внутри растения, извлекает из его клеток питательные вещества и приводит растение к заболеванию. Такой организм называют паразитом. Соответственно, паразитизм – это форма взаимоотношений двух организмов, принадлежащих к разным видам и носящая антагонистический характер, при которой один организм (паразит) использует другого (хозяина) в качестве источника пищи и среды обитания [Фундаментальная фитопатология..., 2012].
Как известно, основными свойствами паразитического организма являются: хемотропизм – привлечение выделениями хозяина; агрессивность – способность переходить на питание за счет хозяина; патогенность – способность вызывать болезнь хозяина, причинить вред [Гойман, 1954].
Микроорганизмы, использующие для питания мертвые органические вещества растительных и животных остатков называют сапротрофами. Если микроорганизм способен не только потреблять готовые мертвые органические вещества, но и убивать ещё живые, но ослабленные близлежащие клетки живых растений, выделяя токсины, а затем питаться этими мёртвыми тканями, такой организм является по образу жизни факультативным паразитом (а по способу питания некротрофом). К факультативным паразитам относятся, например, возбудители ризоктониоза картофеля, фузариоза малины, серой гнили и другие. Ряд микроорганизмов ведут паразитический образ жизни, но в определённых условиях могут развиваться и на мёртвом органическом субстрате. Их по образу жизни характеризуют как факультативных сапротрофов или полупаразитов, по способу питания они являются гемибиотрофами [Фундаментальная фитопатология..., 2012]. К этой группе, в частности, относятся возбудители антракноза и септориза смородины и крыжовника, рамуляриоза земляники, пурпуровой пятнистости малины. Паразиты, которые могут питаться исключительно за счёт живого хозяина, называются облигатными (по способу питания – биотрофами). Гибель хозяина приводит к гибели и облигатного паразита. К облигатным паразитам относятся вирусы и микоплазмы растений, грибы-возбудители ржавчины, настоящей и ложной мучнистой росы.
Фитопатогенные микроорганизмы характеризуются специализацией –способностью заражать определённый круг растений, вследствие приуроченности к ним как питательному субстрату. Растение-хозяин, во-первых, должно содержать питательные вещества в форме, доступной для метаболизма патогена; во-вторых, в растении-хозяине должны отсутствовать токсичные для патогена соединения, которые он не смог бы нейтрализовать.
Фитопатогены могут быть монофагами или полифагами, то есть быть приуроченными к определённой таксономической принадлежности хозяев –семействам, порядкам, классам (филогенетическая специализация); более узкая специализация – к определенным родам, видам и сортам рассматривается как физиологическая специализация (фитопатоген при этом внутри вида дифференцируется на специализированные формы, расы, биотипы и штаммы). Кроме того, фитопатогены могут быть приурочены к поражению растений в определённый период их развития (онтогенетическая или возрастно-физиологическая специализация), или к поражению определенных органов (органотропная специализация) или тканей (гистотропная специализация) [Шкаликов и др., 2005; Фундаментальная фитопатология..., 2012].
Наряду с инфекционными заболеваниями растения поражаются множеством неинфекционных болезней, которые имеют чрезвычайно разнообразную природу. Неинфекционными фитопатогенными факторами могут быть температурные колебания, засуха, избыточное увлажнение, дефициты питательных веществ, засоленность почвы и др. При воздействии на растение неблагоприятных факторов (стрессоров) в нем возникает напряженное состояние, отклонение от нормы – стресс. Стресс – это общая неспецифическая адаптационная реакция организма на действие любых неблагоприятных факторов. Выделяют три основные группы факторов, вызывающих стресс у растений: физические недостаточная или избыточная влажность, освещенность, температура, радиоактивное излучение, механические воздействия; химические – соли, газы, ксенобиотики (гербициды, инсектициды, фунгициды, промышленные отходы и др.); биологические – поражение возбудителями болезней или вредителями, конкуренция с другими растениями, влияние животных, цветение, созревание плодов [Чиркова, 2002].
Различные стрессоры вызывают у растений общие изменения процессов обмена веществ:
– торможение синтеза гормонов роста и усиление образования ингибиторов;
– подавление энергетических процессов;
– нарушение функционирования мембран, увеличение их проницаемости, деполяризацию плазмалеммы;
– активацию синтеза специальных стрессовых белков на фоне общего снижения синтетических процессов;
– усиление процессов гидролиза и закисление цитоплазмы.
Если интенсивность действия стресс-факторов не превышает адаптивных возможностей растения, то умеренные, повторяющиеся стрессы способствуют закаливанию организма. Наоборот, превышение в интенсивности и/или продолжительности воздействия стресс-факторов генетически обусловленных границ адаптации растений приводит к немедленной гибели организма растения, либо к развитию в организме патологических процессов [Шпаар и др., 2004]. Кроме того, последствия стрессового воздействия могут остаться в растении в латентном состоянии и оказать влияние на формирование его устойчивости к другим абиотическим стрессам или инфекционным заболеваниям. В этом отношении следует принимать во внимание роль стресс-факторов в формировании предрасположенности растений к инфекционным заболеваниям, и, с другой стороны, существенное значение сопряженности инфекционных заболеваний растений с неинфекционными стрессами и патологиями [Шкаликов и др., 2005].
Предрасположенность растений к заражению более четко проявляется по отношению к факультативным паразитам и факультативным сапротрофам, чем к облигатным паразитам. Предрасположенность к заболеванию возникает ещё до заражения фитопатогеном и затем отражается на уровне устойчивости растения в процессе фактического взаимодействия с фитопатогенным организмом. Она может быть обусловлена как генетическими факторами (отсутствие генов устойчивости), так и невозможностью или недостаточной реализацией генетического потенциала устойчивости, вследствие действия внешних стрессовых и патологических факторов.
Согласно сложившимся представлениям, у растений различают два основных типа иммунитета: врожденный (естественный, конституциональный) и приобретенный (искусственный). Врожденный иммунитет обусловлен факторами, действующими до заражения растения (пассивный иммунитет) и факторами, действующими в ответ на заражение (активный иммунитет). Приобретенный (или индуцированный) иммунитет возникает без изменения генома растения в результате перенесенного заболевания (инфекционный приобретенный иммунитет) или под влиянием внешних факторов, не связанных с данным возбудителем – абиотических и биотических индукторов (элиситоров), вызывающих фенотипическую иммунокоррекцию на основе изменения уровня экспрессии защитных генов растения [Шапиро и др., 1986; Озерецковская, 1994, 2002; Озерецковская, Васюкова, 2002; Тютерев, 2005; Шкаликов и др., 2005].
К пассивному иммунитету относится, в частности, система анатомо-морфологических барьеров, включающая такие факторы как габитус растения, наличие на поверхности органов волосков опушения, воскового и кутикулярного слоя, пробкового слоя, биохимические барьеры (химический состав тканей, наличие фитонцидов, алкалоидов, гликозидов), недоступность и пищевая неполноценность основных биополимеров растения, несоответствие ростовых процессов растения ритму развития вредного организмов и другие. К пассивному иммунитету относятся также компенсаторные реакции, обеспечивающие восстановление нарушенных функций, при сохранении благоприятных условий для развития вредного организма [Вилкова, Шапиро, 1984; Шапиро и др., 1986; Шкаликов и др., 2005].
Учитывая существенную роль экологических факторов в формировании предрасположенности растений к болезням необходимо целенаправленно формировать условия выращивания культурных растений, в которых происходит реализация генетического адаптивного потенциала устойчивости как к абиотическим, так и биотическим стрессам и патологиям, в том числе при помощи экологически безопасных средств путем воздействия на растения и среду их обитания биоагентами, обладающими полифункциональными свойствами.
С учетом обсуждения в последующих главах результатов наших исследований, касающихся подходов к биологическому контролю болезней растений на примере ягодных культур и картофеля, рассмотрим взаимодействие растений с основными фитопатогенными грибами, вызывающими болезни смородины, крыжовника, малины, земляники и картофеля.
Септориоз смородины и крыжовника (возбудитель – гриб Septoria ribis (Lib.) Desm., половая стадия Mycosphaerella ribis (Fuckel) Lindau (Ascomycota, Mycosphaerellaceae)
Симптомы и вредоносность. Возбудитель заражает крыжовник, черную, красную, белую смородину. На листьях в нижнем ярусе куста пятна появляются обычно в конце июня – начале июля, имеют светлую окраску, 2-3 мм в диаметре, расположены с обеих сторон листа и окружены неширокой бурой каймой. С верхней стороны листа в центре пятна располагаются немногочисленные черные пикниды в виде точек. В верхнем ярусе куста пятна бывают коричневые, мелкие, окруженные более широкой бурой каймой. На ягодах пятна единичные, вдавленные, бурого цвета, впоследствии растрескиваются. Наибольший вред от болезни проявляется в снижении продуктивности и зимостойкости кустов из-за массового преждевременного листопада в июле-августе. Снижение урожая ягод может достигать 40-50% [Беляев и др., 2013].
Биологическое описание. Пикниды коричневатые, в диаметре 100-120 мкм, приплюснуто-округлой формы. Образуются преимущественно с верхней стороны листа, а также на пораженных ягодах. Пикноспоры, размером 28-60Ч1,5-2,6 мкм, нитевидные, бесцветные, изогнутые, с 2-4 перегородками. В течение вегетации возбудитель распространяется пикноспорами воздушно-капельным путём.
Возбудитель зимует на опавших больных листьях и ягодах незрелыми псевдотециями. Псевдотеции имеют размеры до 100 мкм, созревают в мае-июне, формируя и рассеивая бесцветные, двуклеточные сумкоспоры, размером 26-35Ч3-3,5 мкм.
Факторы, способствующие развитию болезни
Повышенная влажность воздуха и почвы.
Загущенность насаждений.
Зимние, весенние (от резких перепадов t°) и летние (из-за засухи) стрессы растений.
Нарушения агротехники при обработке почвы.

Антракноз смородины (возбудитель – гриб Gloeosporium ribis (Lib.) Mont. et Desm., сумчатая стадия Pseudopeziza ribis Kleb. (Ascomycota, Dermateaceae))
Симптомы и вредоносность. Возбудитель узко специализирован к черной, красной смородине и крыжовнику.
Болезнь поражает преимущественно листья, особенно нижнего и среднего ярусов, намного реже – черешки, ягоды, плодоножки и зеленые побеги. На листьях в большом количестве образуются темно-бурые пятна, около 1 мм в диаметре, без окаймления. На поверхности пятна образуется черные, мелкие бугорки – плодоложа гриба. Ткань между пятнами желтеет, высыхает и лист преждевременно опадает.
На плодах пятна обычно одиночные, буроватые, со вздувшимся местом спороношения.
Массовый преждевременный листопад в июле-августе вследствие поражения антракнозом может приводить к вымерзанию 50% ветвей, снижению урожая на 30-75% в текущем и 50-80% в будущем году.
Биологическое описание.
Гриб зимует мицелием на опавших листьях в пораженных тканях. Апотеции образуются на опавших листьях весной. Сумки булавовидные, унитуникатные, сумкоспоры одноклеточные, бесцветные 12-17 Ч 7-8 мкм.
Конидии одноклеточные, бесцветные, серповидно изогнутые, размером 17,5-28,3 Ч 5,4-8,7 мкм. Инкубационный период составляет 6-15 суток. Возможно несколько генераций конидий вплоть до конца сентября.
Созревание аскоспор и их рассеивание приурочено к периоду цветения черной смородины. Аскоспоры и конидии в течение вегетации передаются на растения воздушно-капельным путем.
Факторы, способствующие развитию болезни:
Повышенная влажность воздуха и почвы.
Загущенность насаждений.
Массовое развитие сорняков.
Нарушения агротехники при обработке почвы.

Фузариоз малины (возбудители – грибы рода Fusarium, в том числе виды F. oxysporum Schlecht., F. avenaceum (Fr.) Sacc., F. sambucinum Fuck., F. sporotrichiella Bilai, F. culmorum (Sm.) Sacc., F. moniliforme Shled., F. argillaceum (Fr.) Sacc., F. semitectum var. majus Wr., F. lateritium Nees., и другие)
Симптомы и вредоносность. Фузариозная инфекция поражает однолетние побеги малины преимущественно в сопряженной форме, через повреждения тканей, вызванные питающимися в трещинах коры стеблей личинками малинной побеговой галлицы (Resseliella theobaldi Barn.). Грибная инфекция проявляется в виде разрастающихся пятен темной окраски. Места питания непосредственно под личинками, на сосудистом цилиндре слегка вдавлены и окрашены в темный, почти черный цвет. Через 2-3 недели вокруг некроза разрастается каллусный слой, на поверхности стебля образуются валики и вдавленности. Отмирают обширные участки тканей внутри стебля. Вред проявляется в ломкости больных стеблей при укладке их на зиму, вымерзании, или усыхании весной и летом 2-го года вегетации.
Гибель побегов на плантации может достигать 30-80%, снижение урожая – в 5-6 раз.
Биологическое описание. Грибы рода Fusarium зимуют в стеблях малины в виде мицелия, микросклероциев, хламидоспор в коре и глубоких тканях стеблей. Успешно зимуют также на отмерших побегах и опавших листьях малины и других растений. Ряд видов может длительно сохраняться в почве. Передача инокулюма на стебли происходит воздушными течениями, главным образом, в пределах малинной плантации.
Поражение обычно обусловлено предварительным повреждением стеблей личинками малинной побеговой галлицей, которая откладывает яйца в трещины коры стеблей. Растрескивание коры резко усиливается после сильных морозов в предшествующем ноябре-декабре. В годы с холодной погодой в апреле-мае заболевание бывает мало вредоносным из-за замедленного, равномерного отрастания побегов и слабого их растрескивания. Ранняя, теплая весна и достаточное увлажнение плантации в июне, способствует бурному отрастанию однолетних побегов, массовому их растрескиванию (до 3-10 трещин на 1 побеге), раннему заселению галлицей, развитию глубокого фузариозного поражения и, как следствие, преждевременному отмиранию побегов до плодоношения.
Факторы, способствующие развитию болезни:
Наличие трещин и повреждений коры побегов.
Низкие температуры в ноябре-декабре и ранняя, теплая весна.
Избыточное удобрение, вызывающее растрескивание коры.
Размещение малины на пониженных участках.

Пурпуровая пятнистость малины (возбудитель – гриб Didymella applanata (Niessl) Sacc. (Ascomycota, Didymellaceae), анаморфа – Phoma argillacea (Bres.) Aa & Boerema)
Симптомы и вредоносность. Возбудитель поражает только малину, культурную и дикорастущую. Поражает все надземные вегетативные органы и корневище. На стеблях пятна буро-фиолетовой окраски, вытянутые вдоль стебля, в основном находятся в зоне 0-50 см от основания побега. В течение лета пятна увеличиваются, осенью становятся серебристо-серыми, покрываются черными точками (незрелыми псевдотециями). На листьях буро-коричневые пятна в нижнем ярусе куста на затененных, ослабленных листьях в августе-сентябре.
Недобор урожая достигает 25%, главным образом, вследствие поражения побегов.
Биологическое описание. Возбудитель зимует в коре стеблей в виде незрелых псевдотециев и мицелия на побегах. Формирует сумчатое спороношение в апреле-мае. Пикниды появляются во 2-й половине вегетации на пораженных листьях малины и в небольшом количестве на однолетних стеблях. Осенью пикниды разрушаются, а весной, в апреле-мае вновь в небольшом количестве формируются в коре двухлетних побегов и образуют пикноспоры, участвующие в первичном заражении наряду с аскоспорами до середины июля. Инкубационный период 20-25 дней.
Заражению благоприятствует влажная, теплая погода, наличие капельно-жидкой влаги на поверхности растений и разнообразные повреждения покровных тканей.
Факторы, способствующие развитию болезни:
Повреждения коры побегов различной природы.
Загущение рядов вследствие нарушений в нормировании молодых и вырезке отплодоносивших побегов.
Размещение малины на сырых, плохо проветриваемых участках.

Серая гниль (ботритиоз) (возбудитель – гриб Botrytis cinerea Pers., телеоморфа Botryotinia fuckeliana (de Bary) Whetzel (Ascomycota, Sclerotiniaceae))
Симптомы и вредоносность. Возбудитель поражает многие культурные растения, из ягодных культур наибольший вред причиняет малине, землянике, винограду и черной смородине. Пораженные плоды покрываются серым, пылящим налетом спороношения возбудителя, становятся водянистыми, впоследствии усыхают и мумифицируются. В годы с сырой погодой в период плодоношения прямые потери урожая от серой гнили на землянике и малине могут достигать 50%. На малине через трещины и повреждения коры часто поражает молодые отрастающие побеги и вызывает их отмирание.
Биологическое описание. Гриб размножается преимущественно бесполым путем – конидиями. Спорообразование происходит на разнообразных растениях, на которых возбудитель питается.
Зимует на растительных остатках и в почве склероциями. Конидии в течение вегетации передаются воздушно-капельным путем.
Гриб нетребователен к температуре, для заражения растений и формирования спороношения пригоден интервал +5+30єС, оптимум +15+20єС. Более важен фактор увлажнения среды, особенно в сочетании с ослаблением устойчивости растения-хозяина. При этом имеет значение как локальная потеря устойчивости, отдельным органом (растрескивание тканей, механическое повреждение, повреждение насекомыми), так и общее ослабление растений.
Факторы, способствующие развитию болезни:
Снижение устойчивости растений вследствие стрессов в период зимовки и во время вегетации.
Загущение рядов из-за нарушений в нормировании молодых и вырезке отплодоносивших побегов.
Сырые, плохо проветриваемые участки плантаций.
Задержки в сборах урожая и перезревание ягод.

Белая пятнистость земляники (возбудитель – гриб Ramularia tulasnei Sacc., телеоморфа Mycosphaerella fragariae (Tul.) Lindau (Ascomycota, Mycosphaerellaceae))
Симптомы и вредоносность. Возбудитель болезни поражает только землянику и клубнику, культурную и дикорастущую.
Поражаются листья, черешки, цветоносы и плодоножки. Первоначально пятна имеют коричневую окраску, затем белеют и окружаются пурпуровой каймой. Со временем побелевшие ткани некроза могут выпадать. На листьях пятна обычно округлые, 1-3 мм в диаметре. На других органах – вытянутые продольно.
Вредоносность болезни обусловлена поражением до 70-80% листьев с отмиранием до половины листовой поверхности. Недобор урожая может достигать 15%.
Биологическое описание. Возбудитель зимует мицелием и склероциями в пораженных тканях живых и отмерших органов растения, а также незрелыми псевдотециями. Роль псевдотециев в цикле развития гриба незначительна.
Конидиальное спороношение формируется на пораженных пятнах в виде пучков конидиеносцев, выходящих обычно из устьиц. Конидии одноклеточные (реже с 1-2 перегородками), бесцветные, цилиндрические, размером 15-45 Ч 2,5-4,5 мкм. Первичное заражение листьев происходит в мае. Инкубационный период – 10-15 суток. Конидии на пораженных пятнах формируются через 7-9 суток после появления симптомов и продуцируются 2-3 недели, после чего пятно становится стерильным.
В течение вегетации гриб распространяется спорами с помощью воздушных течений. На новые участки фитопатоген передается обычно с зараженным посадочным материалом.
Факторы, способствующие развитию болезни:
Нарушения технологии в обработке почвы.
Ослабленное состояние растений вследствие стрессов при недостатке питания или неравномерном увлажнении.
Загущенность посадок.

Ризоктониоз картофеля (черная парша) (возбудитель – гриб Rhizoctonia solani J.G. Kuhn, телеоморфа Thanatephorus cucumeris (A.B. Frank) Donk (Basidiomycota, Ceratobasidiaceae)) [Ахатов, и др., 2013]
Симптомы и вредоносность
Заболевание распространено повсеместно в России и за рубежом. Поражает клубни, стебли, столоны и корни взрослых растений картофеля, а также ростки и всходы, вызывая их отмирание. Кроме картофеля поражает многие овощные, цветочные растения и сорняки (осот, хвощ, лебеда и др.).
Заболевание может проявляться в виде черной парши, углубленной (ямчатой) пятнистости, сетчатого некроза клубней, загнивания глазков и ростков, отмирания столонов и корней, а также в виде "белой ножки" стеблей.
Черная парша проявляется в виде расположенных на поверхности клубней черных коростинок (склероциев) различного размера, похожих на прилипшие комочки почвы. Склероции на поверхности практически не причиняют вреда клубню.
Отмирание ростков и корней происходит чаще в сырую и прохладную погоду, при температуре менее 8(С. Склероции на посаженных клубнях или из почвы прорастают мицелием, который проникает в ростки и корни и приводит к образованию на них темных вдавленных пятен, часто сливающихся и охватывающих ростки кольцом. Больные ростки погибают иногда еще до выхода на поверхность.
Углубленная (ямчатая) пятнистость проявляется в фазу бутонизации, при этом язвы на клубнях иногда могут иметь глубину более 2 см.
Сетчатый некроз на клубнях проявляется в сухую и жаркую погоду, которая устанавливается в фазе цветения картофеля (в период массового завязывания клубней), и когда они достигают диаметра 2-3 см. В ходе дальнейшего роста, при увеличении поверхности клубней пятна растрескиваются, образуя сетку.
Симптомы «белой ножки» формируются на стеблях, выживших после поражения всходов в фенофазу цветения – основание стебля загнивает, покрывается беловато-сероватой пленкой, образованной базидиальной стадией гриба. При этом затрудняется сокодвижение в стебле. Базидиоспоры со стебля могут смываться дождем в почву и заражать новые молодые клубни, образуя на них черные плотные склероции различного размера.
Потери и недобор урожая картофеля от ризоктониоза может достигать 20-25%.
Биологическое описание. Возбудитель зимует мицелием и склероциями на клубнях картофеля. На растительных остатках и в почве может сохраняться в течение 3-4 лет.
Грибница возбудителя из почвы проникает в растение через механические повреждения или в ослабленную ткань, а также через чечевички клубней. Базидиальная стадия не является обязательной для жизненного цикла возбудителя.
В течение вегетации гриб распространяется базидиоспорами с помощью воздушных течений. На новые участки фитопатоген передается обычно с зараженным посадочным материалом.
Факторы, способствующие развитию болезни:
Высокая влажность и умеренная температура внешней среды (оптимум 18(С).
Почвы, тяжелого механического состава, бедные питательными веществами.
Таким образом, на ягодных культурах и картофеле среди возбудителей болезней по количеству вызываемых заболеваний и вредоносному значению практически повсеместно доминируют грибы [Ахатов и др., 2013; Беляев и др., 2013]. Поэтому актуальной является задача экологического обоснования и практической разработки комплексных, экологически безопасных методов управления фитосанитарной ситуацией на этих культурах, направленных на укрепление здоровья растений.

1.2. Взаимодействие насекомых-фитофагов с растениями
Основу взаимоотношений насекомых с растениями составляют пищевые, или трофические, связи. Насекомое потребитель пищи, или консумент, тесно связано с другим организмом поставщиком пищи, или продуцентом (растением). По избирательному отношению отдельных видов и групп насекомых к различным источникам органического вещества насекомых, питающихся растениями, относят к фитофагам, или растительноядным насекомым. Они составляют свыше половины видов класса насекомых и широко представлены в отрядах чешуекрылых, жуков, двукрылых и др. [Бей-Биенко, 2008]. [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], которые наносят фитофаги растениям, можно отнести к 3 категориям: 1) поедание растительных тканей при помощи грызущих ротовых аппаратов (гусеницы чешуекрылых, имаго и личинки жесткокрылых); 2) питание растительными соками (тли, клопы); 3) [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ] опухолей, наростов или галлов как изменение нормального вида частей растений. Самое большое значение для растениеводства имеет первая категория фитофагов, поскольку эти насекомые наносят наиболее существенный вред растению-хозяину. У поврежденных растений нарушаются процессы обмена веществ, ослабляется рост, уменьшается накопление запасных питательных веществ, снижается качество плодов и семян. Взаимоотношения «фитофаг – растение» – это первое звено пищевой цепи, в котором вещество и энергия, накопленные продуцентами, передаются консументам.
Фитофагия занимает особое место среди многообразия взаимоотношений между растениями и насекомыми [Чернышев, 1996; Замотайлов и др., 2009]. Растение способно удовлетворить потребность насекомых в воде, аминокислотах, углеводах, липидах, витаминах и т.д. Пища может оказывать воздействие на плодовитость насекомого, быстроту его развития, подвижность, диапаузу, смертность насекомых (а, следовательно, и их численность), на характер группировок (внутривидовых популяций и биоценотических связей) на территории, на их географическое распространение, на строение органов и величину тела [Яхонтов, 1969]. Кроме того, кормовое растение в значительной степени влияет на трофическую специализацию насекомых [Баранчиков, 1987]. Разная степень пригодности пищи для насекомых-фитофагов, как правило, связывается с биохимическим составом кормовых растений, в первую очередь веществами первичного и вторичного метаболизма [Эдельман, 1962; Heil, 2008; Dick, Baldwin, 2010].
В настоящее время накопилось огромное число данных, свидетельствующих о существенном влиянии на жизнеспособность насекомых не только первичных, но и вторичных метаболитов растений-хозяев. Количественный и качественный состав метаболитов может существенно меняться в зависимости от действия различных факторов, в том числе и от уровня повреждения кормовых растений насекомыми [Бахвалов и др., 2010]. Как известно, растения сформировали ряд механизмов прямой защиты от атак насекомых-фитофагов. Одним из наиболее важных механизмов является производство вторичных метаболитов или аллелохемиков [Шапиро и др., 1986; Мартемьянов, Бахвалов, 2007; Rosental, Berenbaum, 1992, Karban, Baldwin, 1997; Agrawal et al., 1999; Haukiojа, 2005; Khan, Mohammed, 2011]. Аллелохемики являются частью конституционного иммунитета растений и поддерживаются на достаточно постоянном уровне в тканях растения. Кроме того, они являются частью индуцированного иммунитета и вырабатываются в ответ на повреждения фитофагом.
Питательные качества растительной ткани могут меняться в зависимости от пространственного местонахождения в пределах ареала, стадии развития растения (онтогенетической фазы), видов и генотипов растений и внешними факторами, связанными с географическим местоположением и сезоном [Chen et. al., 2010]. Фитофаги, которые питаются растениями с низкими питательными качествами, обычно проявляют более низкие темпы роста, снижение эффективности переваривания пищи и плодовитости [Awmack, Leather, 2002; Chen et. al., 2010; Rios et. al., 2013].
Растение-хозяин, являясь основанием трофической пирамиды, влияет на следующее ее звено – фитофага, определяя его функциональное состояние, с которым связана резистентность насекомого в отношении неблагоприятных факторов среды. В основе влияния растений на насекомых лежит качество кормового ресурса, определяемое содержанием первичных и вторичных метаболитов. Таким образам, индукция резистентности в растениях носит специфический характер и, по-видимому, процесс распознавания повреждающего агента растением играет одну из ключевых ролей при формировании индуцированной резистентности.
Одной из характеристик резистентности кормовых растений к фитофагам является качественный состав пластических веществ и других биологически активных химических соединений. К ним относятся как вещества первичного обмена, так и вещества вторичного метаболизма. Соединения первичного обмена – белки, жиры и углеводы, а также аминокислоты, азот, вода, являются необходимыми для насекомых-фитофагов в качестве источника энергии и незаменимых соединений [Чернышев, 1996; Haukioja, 2005; Haukioja et al., 2005]. Существует масса примеров, показывающих, что при питании фитофагов на растении с пониженным содержанием этих соединений отмечается снижение жизнеспособности насекомых [Schwenke, 1968; Scriber, Fenny, 1979; Scriber, Slansky, 1981; Haukioja, 2003]. В результате недостаточного количества потребляемой энергии происходит задержка развития личиночной стадии, снижение репродуктивной способности и увеличение гибели насекомых [Kaitaniemi et al., 1998; Awmack, Leather, 2002]. Воздействие растений на насекомых обусловлено не только веществами первичного обмена, но и вторичными метаболитами растения [Feeny, 1968]. В результате антифидантного действия растения на фитофага происходит подавление процессов питания фитофага. Накопление вторичных метаболитов в листьях растений является энергетически затратным процессом и требует оптимального содержания в окружающей среде углерода и азота [Bryant et al., 1983]. В связи с этим в процессе эволюции у растений сформировалась индуцированная резистентность, т.е. запуск иммунных реакций растения осуществляется только после взаимодействия с раздражителем. К настоящему времени накопилось достаточное количество примеров, отображающих наличие индуцированной резистентности в различных видах растений, как однолетних, так и многолетних [Walling, 2000; Gatehouse, 2002, Haukioja, 2005; Haukioja et al., 2005]. Токсичными свойствами для насекомых обладают многие фенольные соединения, терпеноиды, алколоиды и т.д. [Запрометов, 1993; Schoonhoven et al., 1998]. В большинстве случаев вторичные метаболиты растений оказывают антагонистическое воздействие на организм фитофагов, которое может быть токсическим, антифидантным и антинутриентным [Запрометов, 1993; Чернышев, 1996; Felton, Gatehouse, 1996; Marquis, 1996; Kaitaniemi, et al., 1998; Bernays, Chapman, 2000].
Многочисленные примеры влияния факторов окружающей среды на кормовое растение свидетельствует, что в основном эти факторы действуют на питание фитофагов через изменение качества корма и условий его потребления. Действие таких факторов, как почвенно-растительные условия, солнечная инсоляция и концентрация углекислого газа в атмосфере на физиолого-биохимические реакции растения изложены в гипотезе углерод-азотного баланса [Bryant et al., 1983; Price, 1997]. Данная гипотеза постулирует, что в процессе эволюции в зависимости от условий произрастания в растениях сформировались различные типы защитных реакций. Если растение произрастает в условиях низкой освещенности, но в то же время в почве содержится достаточное количество минеральных и органических веществ, то в растении доминирует синтез азотпроизводных соединений, т.е. алкалоидов и цианопроизводных гликозидов. Если растения произрастают в условиях достаточной освещенности и низкого содержания питательных элементов в почве, то в растении доминирует синтез углеродпроизводных соединений, таких как фенолы и терпеноиды. Следовательно, при увеличении содержания питательных элементов в почве листья растений первой группы будут более резистентными к фитофагам вследствие параллельного увеличения питательной ценности листьев и увеличения их защитных свойств за счет повышения концентрации азотсодержащих аллелохемиков. Для растений, защита которых основана на синтезе углеродсодержащих соединений наоборот, повышение содержания питательных элементов в почве приводит к увеличению потребления листвы фитофагами за счет повышения питательной ценности корма при неизменном содержании углеродпроизводных соединений.
Абиотические и биотические факторы среды в значительной степени определяют жизнеспособность насекомых, их поведение и уровень активности, ход обменных процессов, морфогенез и развитие [Чернышев, 1996; Замотайлов и др., 2009]. Их действие отражается на таких важнейших характеристиках популяции, как плодовитость, смертность, возрастной состав, соотношение полов, уровень стремления к миграции. Среди абиотических факторов, оказывающих существенное влияние на насекомых-фитофагов можно выделить температуру, влажность, солнечную активность, т.е. факторы, которые определяют погоду или влияют на нее. Необходимо отметить что, в силу небольших размеров насекомых огромную роль играют микроклиматические условия, которые могут существенно отличаться в рамках небольшой области пространства. Среди биотических факторов, важное значение имеют качество и количество корма. Практически все абиотические факторы обладают модифицирующим воздействием на популяцию фитофагов (плотность-независимые факторы), т.е. создают условия, определяющие степень реализации биотического потенциала независимо от исходной численности популяции. Биотические факторы обладают в основном регулирующим воздействием на динамику численности фитофагов (плотность-зависимые факторы), сила воздействия этих факторов и их «направленность» в значительной степени зависят от плотности насекомых [Чернышев, 1996]. Трофический фактор в его количественном аспекте может быть модифицирующим на низких уровнях плотности и регулирующим при достижении популяциями критических уровней плотности [Исаев и др., 1984].
Поскольку для фитофагов кормовое растение является единственным источником энергии, то в процессе эволюции насекомые выработали целый ряд приспособлений, позволяющих избегать воздействия защитных реакций кормового растения. Адаптации узкоспециализированных монофагов и олигофагов, и широкоспециализированных полифагов имеют ряд особенностей. Так же, как и у растений, в насекомых выделяют конститутивную и индуцированную резистентность. Выделяют два типа адаптаций у насекомых: пассивные – присутствующие независимо от действия раздражителя, и активные – проявляющиеся при действии раздражителя, т.е. изменении резистентности растения [Gatehouse, 2002].
В значительной степени активность фитофагов определяет влияние погодных условий. С увеличением температуры, как правило, в организме насекомых увеличивается активность физиологических процессов, что приводит к ускорению развития особей от яйца до имаго. В то же время при увеличении или уменьшении температуры за пределы оптимальной, отмечается замедление развития насекомых, а при ее экстремальных значениях – их гибель [Чернышев, 1996]. Немаловажным показателем является экстремальная температура в зимний период, особенно в сочетании с количеством выпавших осадков. В частности, при малоснежной зиме с низкими температурами может значительно снижаться выход диапаузирующих фитофагов [Tenow, Holmgren, 1987; Price, 1997; Virtanen et al. 1998].
Поскольку погода оказывает влияние не только на насекомых-фитофагов, но и на весь биоценоз в целом, то необходимо отметить и косвенное влияние климатических условий на насекомых через другие компоненты биоценоза. Например, изменение температуры и количества осадков может воздействовать на физиологическое состояние кормового растения или на популяции конкурентов. Так, засушливая и жаркая погода является стрессирующей для кормового растения и это зачастую способствует массовому размножению фитофагов, что показано на примере непарного и сибирского шелкопрядов и ряда других насекомых [Чернышев, 1996; Price, 1997].
Изложенные подходы определяют взаимоотношения растения-хозяина с фитофагом в различных климатических условиях. В свете этих представлений приведем результаты наших исследований по взаимодействию колорадского жука с растением картофеля в сибирских условиях.
Чрезвычайная экологическая пластичность супердоминантного вредителя – колорадского жука позволила ему охватить все основные зоны картофелеводства и овощеводства государств Северной Америки, Европы, Передней и Средней Азии, а в России – территории от Балтики до Енисея с изолированным очагом в Приморье [Васютин и др., 2000; Вилкова и др., 2001; Павлюшин и др., 2009; Фасулати, Иванова, 2015]. Оптимальной температурой для размножения жука считается 20-25°С и относительная влажность воздуха 60-85% [Богданов-Катьков, 1947; Головин, 1956; Бирман, 1969; Санин, 1976]. Для полного развития колорадского жука от момента яйцекладки до выхода из почвы молодых жуков требуется сумма эффективных температур 360°С (при пороге +11,5°С), т. е. около 30-60 дней [Калинина, 2007; Мацишина, 2011, 2012].
Нами установлено [Цветкова, Чуликова, 2012], что благоприятные для развития колорадского жука показатели температуры, влажности и СЭТ в сибирском регионе отличаются от таковых в европейской зоне России. Весенний выход имаго колорадского жука в условиях Новосибирской области лимитируют такие абиотические факторы, как глубина промерзания почвы и высота снега в конце ноября – начале декабря и марте (r=0,84-0,98), температура почвы (r=0,98) и воздуха (r=0,54), количество осадков (r=-0,86) на момент появления имаго. Начало выхода колорадского жука из почвы отмечается при средней температуре воздуха +14,5°С и почвы – +14,7°С, при среднем количестве осадков около 102 мм и ГТК=1,8, САТ и СЭТ не менее +500°С и +88°С, соответственно. При избытке (ГТК>1,8) и недостатке (ГТК<1) влаги в почве выход насекомых затягивается.
Колорадский жук успешно адаптировался к погодно-климатическим условиям региона. Развитие фитофага происходит при температуре воздуха от +8,6 до +23,4°С и влажности воздуха от 55 до 89%, наиболее благоприятными условиями являются температура воздуха +12,8+21°С и относительная влажность воздуха 7178%.
Формирование одного поколения колорадского жука проходит при накоплении СЭТ, равной +253,6±108°С за 34±3 дня, при средней температуре воздуха +14,8±6,2°С. Второе поколение вредителя развивается на 70% при накоплении к моменту скашивания растений СЭТ, равной +391,6±92°С.
Таким образом, для сибирской популяции вредителя температурный оптимум воздуха находится ниже на 4-9°С, чем для европейской, а относительная влажность воздуха несколько выше (различия составляют 89%).
Жук адаптировался к местным природно-климатическим условиям Западно-Сибирского региона [Цветкова, Чуликова, 2012; Чуликова и др., 2012; Цветкова, 2013], численность и вредоносность его стабильно высокие, поэтому территория лесостепи Приобья в настоящее время относится к зоне натурализации фитофага [Гербер, Цветкова, 2007; Малюга и др., 2011].
По нашим наблюдениям [Цветкова, Чуликова, 2012; Чуликова и др., 2012; Цветкова, 2013] на протяжении 4-х вегетационных периодов колорадский жук присутствовал на посадках картофеля от всходов до скашивания надземной части. Однако, заселение разных сортов вредителем было различно. Первые имаго фитофага были обнаружены на растених разных сортов во 2-й декаде июня. Максимальное количество особей присутствовало на сорте Луговской – 0,12 экз./куст, минимальное на сорте Хозяюшка – 0,03 экз./куст. В дальнейшем, количество фитофага начинает увеличиваться за счёт отрождающихся личинок, и к началу 1-й декады июля на растениях присутствуют имаго и личинки всех возрастов (рис. 1.1). На среднеспелых сортах пик численности фитофага наблюдали в 1-ю декаду июля (Луговской – 2,1 экз./куст, Югана – 1,76 и Хозяюшка – 1,40 экз./куст).


Рис. 1.1. Динамика численности колорадского жука на посадках разных сортов картофеля (2007-2010 гг.) НСР05 по сорту 0,52
На среднераннем сорте Сафо максимальная численность вредителя приходилась на 2-ю декаду июля (1,19 экз./куст). Нарастание количества фитофага на раннем сорте Любава имело продолжительный характер, и пик численности наблюдался в 3-й декаде июля (0,58 экз./куст). Это объясняется некоторыми особенностями органогенеза растений, в данном случае, коротким периодом между цветением и отмиранием ботвы и коротким периодом вегетации в целом. Поэтому, к моменту появления личинок младшего возраста листья ранних и среднеранних сортов были уже менее питательными и не обеспечивали полноценного накопления жирового тела в организме листоеда.
С конца 3-й декады июля на всех сортах начинался выход жуков нового поколения. Массовое появление имаго наблюдали в 1-й декаде августа на среднеспелых сортах (Луговской – 0,83 экз./куст, Югана – 0,45 и Хозяюшка – 0,52 экз./куст), на ранних и среднеранних сортах во 2-й декаде августа (Любава – 0,81 и Сафо – 0,87 экз./куст). В течение вегетации максимальная численность фитофага отмечалась на сорте Луговской – 6,6 экз./куст, что превышало этот показатель на сорте Югана в 1,2 раза, а на сорте Любава – в 2,5 раз.
Таким образом, сорт Луговской оказался самым заселяемым, а наменее заселяемым – сорт Любава. На сортах среднеспелой группы (Луговской, Югана, Хозяюшка) увеличение численности вредителя шло более интенсивно, чем на сортах ранней и среднеранней групп спелости (Любава и Сафо). Однако, плотность популяции колорадского жука, еще не в полной мере определяет его вредоносность на разных сортах картофеля, в большей степени, она зависит от пищевых достоинств листьев, что определяет разную степень привлекательности растений и интенсивности их заселения. Проявляется это в антибиотических, морфологических, органогенетических, атрептических, физиологических, ингибиторных, оксидативных, некротических и репарационних свойствах растений, которые обуславливают малую прожорливость насекомых на данных растения [Пайнтер, 1961, Шапиро, Вилкова, 1979;1986; Шапиро, 1985; 1991; Вилкова, 2004].
В настоящее время в мировом сортименте картофеля насчитывается более 4 тысяч сортов. В Российском «Государственном реестре селекционных достижений, допущенных к использованию», изданном в 2015 году, представлено 399 сортов картофеля [Госреестр, 2015]. По результатам проведенной оценки выделены устойчивые к колорадскому жуку сорта: в группе раннеспелых – Даная, Алый парус, Гала, Эл Мундо, Музыка, Реал; в группе среднепоздних – Янка, Сиреневый туман, Сифра, Дельфине. Все они имели низкий средний балл поврежденности ботвы по шкале ВИЗР (0,5-1,2 балла, т.е. обычно менее 10% уничтоженных листьев), низкую долю кустов (обычно менее 10%) со значительными повреждениями листьев, превышающими пороговый уровень в 20% их уничтоженной площади, и более низкий уровень средней численности личинок – в пределах 130-430 экз. на 100 кустов против 360-1600 экз./100 кустов на остальных сортах. Это указывает на то, что выделенные устойчивые сорта действительно обладают комплексом механизмов самозащиты от колорадского жука, являясь прежде всего неблагоприятным кормом для его развития, т.е. лимитирующим биоценотическим фактором. По данным С.Р. Фасулати и О.В. Ивановой [2015], выделены сорта картофеля, обладающие целым рядом признаков устойчивости к колорадскому жуку: Виктория, Искра, Криница, Ладожский, Ласунак, Лига, Наяда, Петербургский, Радонежский, Раменский, Свитанок киевский, Холмогорский, но многие сорта, включенные в Госреестр РФ, не оценивались на устойчивость к вредителям. Поэтому, в связи с изменчивостью колорадского жука и биологической разнокачественностью его экотипов очень важен зональный подход в оценке сортоустойчивости [Павлюшин и др., 2009].
В результате проведенных нами исследований на 22-х сортах картофеля разных групп спелости в условиях Новосибирской области установлено, что менее привлекательными были ранние сорта по сравнению со среднеранними и среднепозднеспелыми, за исключением сорта Хозяюшка (заселенность – по 60 личинок 2 и 3 возрастов на куст) [Цветкова, Штерншис, 2009]. Незаселенными колорадским жуком оказались сорта: Каменский, Серпанок и Явир. От 3 до 7 экземпляров на куст обнаружено на сортах Повинь и Якутянка; 13-18 экз. - на сортах Юбиляр и Любава.
На растениях среднеранних сортов высокая численность личинок (экз./куст) наблюдалась на сортах: Памяти Рогачева (86), Тулеевский (77) и Радонежский (71). В целом, только на сорте Чая было 28 личинок, в основном 2 возраста, а на остальных сортах – от 49 до 67 личинок на куст. Из среднепозднеспелых сортов наиболее заселенными были сорта Кетский и Луговской (96 и 73 экз. соответственно). На остальных сортах от 42 до 65 личинок на 1 куст картофеля.
Таким образом, из ранних устойчивыми были сорта: Каменский, Серпанок и Явир. Относительно устойчивыми – Повинь, Якутянка, Юбиляр и Любава. Из среднеранних сортов – Чая, Сафо, Рябинушка; из среднепозднеспелых – Симфония и Аврора.
Многообразие сортов картофеля создают для этого вида благоприятные условия в выборе тех растений, питание которыми способствуют реализации жизненного цикла (развитие, расселение, плодовитость, зимовка). Степень биологической вредоносности зависит от характера воздействия насекомых на растение и от устойчивости растений к насекомому. Сила воздействия жука на растения картофеля определяется его численностью и прожорливостью [Колорадский картофельный жук, 1981].
Личинки и имаго вредителя чрезвычайно прожорливы. Анализ полученных нами данных показал, что наиболее прожорливыми оказались имаго и личинки 4 возраста, прибавка в массе самой значительной была у личинок (24 мг) по сравнению с имаго (12 мг), однако съеденная листовая площадь оказалась на одном уровне. Значительную листовую поверхность (14,33 ммІ) уничтожили личинки 3 возраста, но с минимальным приростом в массе (8 мг). Личинки 2 возраста увеличили массу тела на 24 мг (при съеденной пищи 38 мг). И наименее прожорливыми оказались личинки 1 возраста. Они незначительно уменьшили площадь листа (1,55 ммІ), но и уменьшили свою массу тела, что можно связать со стрессом молодых личинок при сборе на растениях картофеля и проведении опыта. Наши данные подтверждаются результатами других исследователей [Бирман, 1969; Калинина, Николаева, 2007], где показано, что личинки старших возрастов колорадского жука наносят значительные повреждения картофелю и являются наиболее прожорливыми.
Более подробные исследования взаимодействия насекомых с растениями проведены на пяти различных по спелости сортах картофеля [Цветкова, Чуликова, 2012]. В результате было установлено, что в условиях региона на прожорливость вредителя влияют следующие факторы: морфологические признаки сорта – опушение и толщина листовой пластинки (доля влияния 92,7%), фаза развития колорадского жука (доля влияния 84,2%), возраст личинок (доля влияния 76,4%)
В среднем по сортам за сутки одним фитофагом съедалось 3,5 см2 листовой поверхности. Более прожорливыми были личинки 3 и 4 возрастов, съеденная ими площадь составляла 3,9 и 5,0 см2/ экз. в сутки, соответственно. Имаго колорадского жука съедало меньше корма – 3,0 см2, а одна личинка 2 возраста – 2,1 см2/ экз. в сутки (табл. 1. 1). Более высокая прожорливость личинок старшего возраста по сравнению с имаго обоснована необходимостью увеличения массы жирового тела для дальнейшего нормального прохождения онтогенеза – окукливания и выхода молодых имаго.






Таблица 1.1
Прожорливость колорадского жука на разных сортах картофеля
Сорт
Съеденная листовая поверхность, см2/экз. в сутки
Средние по сортам


Имаго летнего поколения
личинки, возраст




II
III
IV


Сафо
2,5±0,7
2,7±0,7
4,8±1,0
7,0±1,4
4,2±2,1

Луговской
3,4±1,3
3,1±1,0
4,0±1,3
4,9±1,0
3,8±0,8

Хозяюшка
2,8±0,7
1,8±0,6
3,5±1,3
4,5±0,6
3,2±1,1

Югана
3,2±0,7
1,3±0,5
4,1±1,3
4,1±1,3
3,2±1,3

Любава
3,0±0,7
1,6±0,6
3,2±0,7
4,5±0,6
3,1±1,2

Средние по фазам развития
3,0±0,3
2,1±0.8
3,9±0,6
5,0±1,1
3,5±0,5


Более привлекательными для питания личинок и имаго оказались листья сортов картофеля Сафо и Луговской, где в среднем за сутки имаго и личинки съедали 3,8-4,2 см2/ экз. в сутки, а менее – Хозяюшка, Югана и Любава, в этом случае данный показатель составил 3,1-3,2 см2/ экз. в сутки.
К сожалению, в настоящее время нет единого мнения о причинах различной прожорливости фитофага на разных сортах картофеля и других пасленовых. Чаще всего наблюдается лишь частичное отвержение насекомыми растений. Установлено, что меньше повреждаются сорта с плотными, грубыми листьями (толщина листа более 300 мкм) и с сильной опушённостью. Данные свойства растений вызывают затруднения процесса питания и пищеварения фитофага, ухудшение его физиологического состояния [Шапиро, Вилкова, 1979; Шапиро, 1985; Методы оценки , 2003].
Нами подтверждено, что на прожорливость колорадского жука оказывали влияние морфологические особенности строения растений, в частности, толщина листовой пластинки и её железистое опушение (табл. 1.2). Максимально прожорливыми личинки 2 возраста были на листьях сортов Сафо и Луговской (2,7-3,1 см2/ экз. в сутки), а минимально на Югане и Любаве (1,3-1,6 см2/ экз. в сутки) (табл. 1.2). В то же время личинки 3 возраста были более прожорливы при питании на сорте Сафо – 4,8 см2/ экз. в сутки, а менее на Любаве и Хозяюшке – 3,2-3,5 см2/ экз. в сутки. Для питания личинок 4 возраста также был более предпочтителен сорт Сафо, где вредитель съедал 7,0 см2/ экз. в сутки, а менее Югана – 4,1 см2/экз. в сутки. Имаго летнего поколения больше съедали листву сорта Луговской (3,4 см2/ экз. в сутки), а меньше – на Сафо (2,5 см2/экз. в сутки).
Таблица 1.2
Влияние опушённости и толщины листовой пластинки картофеля на прожорливость колорадского жука
Сорт
Количество волосков,
шт./ смІ листа
Толщина листовой пластинки, мкм
Прожорливость личинок,
смІ /экз. в сутки
Прожорливость имаго, смІ / экз. в сутки




2
3
4


Сафо
35,3
237,5
2,7
4,8
7,0
2,5

Луговской
38,0
304,0
3,1
4,0
4,9
3,4

Хозяюшка
39,8
301,7
1,8
3,5
4,5
2,8

Любава
81,7
385,5
1,6
3,2
4,5
3,0

Югана
126,0
302,0
1,3
4,1
4,1
3,2

НСР05 по факторам: сорт – 1,0; количество волосков – 4,2; толщина листа – 2,7;
фаза развития вредителя – 0,9.


Таким образом, прожорливость личинок 2 возраста ограничена таким фактором, как опушённость листа (r= – 0,74); для личинок 3 и 4 возраста – толщиной листа (r = – 0,91 и r = – 0,64, соответственно). На питание имаго данные показатели не влияли (r = 0,2 и r = 0,3, соответственно).
При изучении прожорливости колорадского жука была отмечена также зависимость массы насекомого от питания на разных сортах картофеля. В среднем по сортам прирост массы одного фитофага за сутки составил 0,025 г (табл. 1.3). Увеличение массы тела личинок зависело от фазы развития колорадского жука. Так, в среднем за сутки, для личинок 3 и 4 возраста данный показатель составлял 0,028-0,030 г/экз., а для имаго и личинок 2 возраста – 0,020-0,024 г/экз. У личинок 4 возраста возрастание массы тела мало отличается от таковой у 3 возраста, хотя их прожорливость самая высокая (5 см2/ экз. в сутки). Это объясняется возрастной гетерогенностью личинок и их подготовкой к дальнейшему окукливанию, так как перед каждой линькой и окукливанием насекомое прекращает питание, освобождает кишечник и становится неподвижным. Различия в приросте массы тела имаго и личинок старшего возраста объясняемы биологическими особенностями онтогенеза насекомого, которые уже рассматривались ранее.
Значительный прирост массы имаго и личинок наблюдали при питании на сортах Любава и Луговской (0,042-0,046 г/ экз. в сутки), и небольшой – на листьях растений сорта Югана (0,004 г/ экз. в сутки). Минимальный прирост массы был у имаго (0,020 г/ экз. в сутки), тогда как у личинок данный показатель увеличивался в соответствии с их возрастом от 0,024 до 0,030 г/ экз. в сутки (табл. 1.3).
Таблица 1.3
Прирост массы тела колорадского жука при питании на разных сортах картофеля
Сорт
Прирост массы фитофага, г/экз. в сутки
Средние по сорту


имаго летнего поколения
личинки, возраст




II
III
IV


Сафо
0,008
0,010
0,020
0,013
0,013

Луговской
0,038
0,039
0,050
0,056
0,046

Хозяюшка
0,012
0,020
0,028
0,030
0,023

Югана
0,006
0,002
0,004
0,004
0,004

Любава
0,034
0,048
0,050
0,035
0,042

Средние по фазе развития
0,020
0,024
0,030
0,028
0,025

НСР05 по факторам: сорт – 0,009; фаза развития – 0,008


Личинки 2 возраста максимально увеличивали массу тела при поедании листьев сорта Любава (0,048 г/ экз. в сутки), тогда как на сорте Югана – всего 0,002 г/ экз. в сутки. Наибольший прирост массы личинок старшего возраста наблюдали при питании их на сортах Луговской и Любава (0,05-0,056 г/ экз. в сутки), а наименьший – на Югане (0,004 г/ экз. в сутки). Значительную прибавку массы у имаго отмечали на Луговском – 0,038 г/ экз. в сутки, а минимальную на сорте Югана – 0,006 г/ экз. в сутки.
Увеличение массы тела насекомого зависит не только от количества съеденного корма, но и от биохимического состава растения. Поскольку фитофагом усваивается около 50% потреблённого корма, а оставшаяся часть теряется с экскрементами [Chlodny et al., 1967, Колорадский картофельный жук, 1981], ему необходимо употреблять более качественную пищу, но высокая концентрация сахарозы в листьях картофеля может приводить к снижению усвояемости потребляемого корма у фитофага.
Показано [Колорадский картофельный жук, 1981], что наиболее выраженную реакцию поедания листьев картофеля колорадским жуком, вызывает сахароза. На личинок сахароза действует более активно, чем другие углеводы – глюкоза, фруктоза и манноза. Также хорошими стимуляторами питания фитофага являются аминокислоты: L-аланин, L -аминомасляная кислота и L-серин, причём, молекулярный вес аминокислот, стимулирующих питание, не превышает 125. Из липидов достаточно заметную реакцию питания вызывают только лецитин и фосфатидил L-серин, хотя реакция личинок на эти вещества значительно слабее, чем на сахара и аминокислоты.
Исследованные нами сорта характеризовались высоким содержанием сахарозы – от 4,1% (Луговской) до 8,9% (Югана). Было установлено, что при питании фитофага листьями сортов с высокой концентрацией данного углевода в листьях, прирост массы вредителя снижался (r = – 0,9). Так, на сорте Югана, увеличение массы колорадского жука минимальное – 0,004 г/ экз. в сутки, тогда как на Луговском, этот показатель составляет 0,046 г/ экз. в сутки (табл. 1.4).



Таблица 1.4
Прирост массы фитофага в зависимости от количества и качества кормового растения
Сорт
Массовая доля сахарозы на сухое вещество, %
Съеденная площадь листа, см2/ экз. в сутки
Прирост массы тела,
г/ экз. в сутки

Югана
8,9
3,2
0,004

Сафо
7,7
4,2
0,013

Любава
5,9
3,1
0,042

Хозяюшка
5,8
3,2
0,023

Луговской
4,1
3,8
0,046

НСР05
0,1
0,1
0,001


Полученные нами данные подтверждают ранее установленные закономерности [Колорадский картофельный жук, 1981] снижения массы тела фитофага при питании картофеля с высоким содержанием углеводов.
Аналогичная зависимость прироста массы тела от содержания углеводов в растении прослеживается и по отдельным фазам развития колорадского жука. Исключение составляет имаго фитофага, где этот показатель зависит не только от качества (r = – 0,8), но и от количества потреблённого корма (r = 0,6). Следовательно, у личинок колорадского жука набор массы тела и соответственно роста, идет за счет потребленных углеводов, а не из-за количества съеденного корма, в отличие от имаго.
Таким образом, вне зависимости от сорта картофеля более прожорливыми являются личинки старших возрастов, а менее – имаго и личинки 1-2 возраста, что соответствует многочисленным данным других авторов. В настоящее время, колорадский жук адаптировался к местным природно-климатическим условиям Западно-Сибирского региона, численность и вредоносность его стабильно высокие, территория лесостепи Приобья в настоящее время, относится к зоне натурализации фитофага, поэтому возрастает необходимость регуляции численности и вредоносности этого опасного фитофага.

1.3. Действие антагонистов на фитопатогенные микроорганизмы
Аэробные спорообразующие бактерии рода Bacillus, благодаря присущему им природному антагонизму в отношении фитопатогенных грибов, а также достаточно высокой степени адаптивности к неблагоприятным факторам окружающей среды, являются распространенными агентами биологического контроля болезней растений. Для подавления возбудителей болезней пригодны различные штаммы бактерий рода Bacillus [Новикова, 2005; Мелентьев, 2007; Jamalizadeh et al., 2008; Ramarathnam et al., 2011], поэтому биологическое подавление патогенов растений как альтернатива применению химических фунгицидов заслуживает все большего внимания во всем мире [Gerbore et al. 2014; Heydari, Pessarakli, 2010]
Как известно, бактерии подразделяются на эпифитные, эндофитные и ризосферные. Эндофиты обитают внутри растения, в природе они поступают в растение через устьица, поранения, корневую систему. Существенную роль в формировании эндофитной микрофлоры играет передача микроорганизмов через семена, а также их интродукция векторными организмами беспозвоночными или грибами [Тихонович, Проворов, 2011, Hallmann et al., 1997].
Бактериальные эндофиты выполняют ряд функций, важных для растений [Pirttil et al., 2008]. Внимание к бактериальным эндофитам обусловлено также накоплением данных, указывающих на условность исторически сложившегося разделения микроорганизмов на фитопатогенные, патогенные для животных (человека) и непатогенные [Маркова и др., 2005]. Отмечено влияние абиотических факторов на жизнедеятельность эндофитных бактерий [Белимов, 2012].
Свойства, присущие эпифитным микроорганизмам и проявление их в вариативных условиях внешней среды, различны. Полагают, что наряду с другими факторами, обеспечивающими иммунитет у растений, эпифитная микрофлора служит первичным барьером для защиты растений от попадающих из окружающей среды сапрофитных, условно-патогенных и патогенных микроорганизмов [Делова, Кузнецова, 1973].
Ризобактерии таксономически чрезвычайно разнообразны [Кравченко и др., 2002; Bashan, De Bashan, 2002; Polyanskaya et al., 2002; Weller et al., 2002; Whipps et al., 2001]. Они обитают в ризосфере (зона почвы, непосредственно соприкасающаяся с корнями), которая служит их основной экологической нишей с наиболее благоприятными условиями [Kuiper et al., 2004; Thomashow, 1996] и на поверхности корней. В ризосферу из корней активно поступают сложные смеси легкодоступных органических источников энергии и углерода, что обусловливает ее высокую микробиологическую активность и образование отличающихся от почвенного микробоценоза специфических ризосферных микробных сообществ [Кравченко, 2000; Lynch, 1990]. Разнообразие таких сообществ во многом определяется количественным и качественным составом корневых выделений, зависящим от вида, возраста и условий выращивания растения, а также от влияния комплекса почвенно-климатических факторов [Lynch, 1990, Bais et al., 2006]. В свою очередь, микробиологическая активность в ризосфере приводит к существенному изменению химических и физических свойств этой зоны и накоплению продуктов жизнедеятельности микроорганизмов, биологически активных по отношению к растению. Для изучения взаимодействий растений с полезными формами бактерий в ризосфере продуктивна концепция, согласно которой ризобактерии образуют с растением единую растительно-микробную систему (ассоциацию) с новыми свойствами, детерминированными положительным взаимодействием партнеров [Bais et al., 2006; Siddiqui, 2005]. Нормальная жизнедеятельность высших растений происходит при их тесном взаимодействии с микроорганизмами, заселяющими ризосферу и составляющими ассоциацию: «микроорганизмы – корневая система растения» [Мелентьев, 2007].
В системе «почва – микроорганизмы – растения» основой физиолого-биохимического воздействия являются консортивные взаимодействия, а центральным фактором ризосферного эффекта служит метаболическая активность корне. За счет этой активности обитающие в прикорневой зоне микроорганизмы получают доступные источники питания (моносахара, органические кислоты, аминокислоты, белки, вещества фенольной природы, антибиотики, липиды и ряд других) [Звягинцев и др., 1993].
Бациллы-антагонисты относятся как к ризосферным [Кузьмина, 1998; Алексеева, Потатуркина-Нестерова, 2014], так и к эндофитным [Чеботарь и др.2011; Курамшина и др., 2014; Chebotar et al., 2009], и эпифитным [Коптева, Ерина, 2015] бактериям. Спектр антагонистической активности у бактерий рода Bacillus широкий: их метаболиты, по большей части, представлены антибиотиками полипептидного и аминогликозидного ряда [Воронкович, 2011], которые обладают способностью подавлять как рост, так и развитие большого числа вредных объектов. В зависимости от штамма бактерии рода Bacillus могут быть продуцентами от 50 до 200 различных биологически активных веществ [Котляров, Седынина, 2013]. В частности, B. subtilis синтезирует более 70 антибиотиков, а также протеолитические, амилолитические и пектолитические ферменты. Именно широкий набор биологически активных метаболитов бактерий обеспечивает эффективное снижение численности патогенов, поскольку срабатывают различные механизмы воздействия. Например, на развитие возбудителя серой гнили бактерия оказывает не только одномоментный эффект, подавляя процесс прорастания спор гриба, но и длительное время подавляет рост мицелия [Воронкович, 2011].
Важной особенностью представителей рода Bacillus, которая делает перспективным их применение в защите растений, является способность бактерий к спорообразованию, что позволяет им переживать неблагоприятные условия. В спорах бактерий постепенно накапливаются биологически активные вещества, поэтому в момент прорастания антагонистическая способность бактерий резко усиливается.
В первую очередь принято оценивать антагонистическую активность бактериальных штаммов in vitro. Так, в лабораторных условиях выявляли активность штамма B. subtilis, двух штаммов B. amyloliquefaciens и четырех штаммов B. licheniformis в отношении ряда фитопатогенных грибов [Леляк, Штерншис, 2014]. Высокую антагонистическую активность против возбудителей болезней растений: Alternaria solani, Bipolaris sorokiniana, Phytophthora infestans, Botrytis cinerea, грибов рода Fusarium, – показали штаммы B. subtilis ВКПМ В-16041, DSM 24613, B. amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, DSM 24614 и B. amyloliquefaciens ВКПМ В-10643, DSM 24615 (табл. 1.5.). На возбудителя альтернариоза A. solani наибольшее ингибирующее действие оказали штаммы B. amyloliquefaciens Ba-1 и Ba-2, B. licheniformis ВКПМ В-10561, DSM 24609 (Bl-1) и B. subtilis Bs-1. В подавлении роста возбудителя корневых гнилей B. sorokiniana высокую активность проявили штаммы B. subtilis Bs-1, B. amyloliquefaciens Ba-1и Ba-2. Эти же штаммы были максимально активными по сравнению с остальными по отношению к возбудителю серой гнили растений B. cinerea. В то же время установлено, что штаммы B. licheniformis не подавляли роста B. cinerea (штамм ВКПМ В-1006). Против фитопатогенных грибов рода Fusarium и возбудителя фитофтороза пасленовых культур Ph. infestans все изученные нами бактерии Bacillus spp. показали высокий уровень ингибирующей активности. У бактерий B. licheniformis Bl-1; ВКПМ В-10562, DSM 24610 (Bl-2) и ВКПМ В-10564, DSM 24612 ( Bl-4) отсутствовала антагонистическая активность в отношении F. solani ВКПМ В-163. Результаты исследования показали, что штаммы B. subtilis, B. amyloliquefaciens и B. licheniformis проявляют ингибирующую активность в отношении фитопатогенных грибов, вызывающих болезни сельскохозяйственных культур, что явилось основой дальнейшего изучения их для управления здоровьем растений.
Таблица 1.5.
Ингибирующая активность бактерий в отношении фитопатогенных грибов, %
Наименование фитопатогенного
тест-микроорганизма
Штаммы бактерий-антагонистов*


Bs-1
Ba-1
Ba-2
Bl-1
Bl-2
Bl-3
Bl-4

A. solani A7 АКТЛ 112
68,5+1,19
71,4+2,07
71,4+1,55
71,4+1,80
65,7+2,19
68,6+2,23
37,1+1,07

A. solani А7 НКЛ 2в
66,7+2,09
50,0+1,85
56,7+1,90
66,7+2,44
66,7+2,70
66,7+2,19
66,7+2,17

A. solani А7 АКТЛ 125 3б
66,7+2,03
66,7+2,12
66,7+2,09
66,7+2,11
66,7+2,10
66,7+2,09
60,0+1,90

B. sorokiniana ВКПМ В-532
81,8+2,49
81,8+2,29
81,8+2,47
36,4+1,16
41,8+1,50
67,3+2,07
27,3+1,26

B. cinerea M-01
62,5+1,92
62,5+2,05
62,5+2,13
53,3+1,88
51,1+1,80
55,6+1,94
22,2+0,98

B. cinerea ВКПМ В-1006
50,0+2,24
50,0+2,17
50,0+2,01
0
0
0
0

B. cinerea M-4-2
68,7+2,30
68,7+2,46
68,7+2,41
68,8+2,03
48,6+2,11
68,7+1,95
37,5+0,88

Fusarium graminearum ВКПМ В-147
54,5+1,74
54,5+1,83
54,5+1,80
50,0+1,75
31,8+1,40
45,4+1,66
31,8+1,19

Fusarium solani ВКПМ В-163
44,4+1,33
44,4+1,40
44,4+1,37
0
0
33,3+1,18
0

A. solani A7 АКТЛ 112
68,5+2,20
71,4+2,69
71,4+2,55
71,4+2,71
65,7+2,38
68,6+2,30
37,1+1,15

A. solani А7 НКЛ 2в
66,7+2,07
50,0+1,92
56,7+1,84
66,7+2,04
66,7+2,12
66,7+2,29
66,7+2,31

A. solani А7 АКТЛ 125 3б
66,7+2,18
66,7+2,81
66,7+2,60
66,7+2,55
66,7+2,74
66,7+2,15
60,0+2,18

B. sorokiniana ВКПМ В-532
81,8+2,96
81,8+2,70
81,8+2,66
36,4+1,18
41,8+1,60
67,3+2,00
27,3+0,93

B. cinerea M-01
62,5+2,45
62,5+1,97
62,5+2,17
53,3+1,70
51,1+1,64
55,6+1,50
22,2+0,98

B. cinerea ВКПМ В-1006
50,0+1,74
50,0+1,66
50,0+1,54
0
0
0
0

B. cinerea M-4-2
68,7+2,15
68,7+2,26
68,7+2,33
68,8+2,40
48,6+1,83
68,7+2,01
37,5+1,14

Fusarium graminearum ВКПМ В-147
54,5+1,59
54,5+1,60
54,5+1,83
50,0+1,19
31,8+1,62
45,4+1,18
31,8+0,87

Fusarium solani ВКПМ В-163
44,4+0,75
44,4+1,13
44,4+1,04
0
0
33,3+0,60
0

Fusarium chlamydosporum ВКПМ В-899
76,2+2,29
76,2+2,61
64,3+2,16
52,4+1,67
47,6+1,32
61,9+1,70
16,7+0,29

Fusarium solani К 6
68,9+2,09
77,8+2,73
77,8+2,44
40,0+1,90
40,0+1,33
48,9+1,12
0

Fusarium oxysporum ВКПМ В-349
76,2+2,09
76,2+2,40
76,2+2,33
47,6+2,19
64,3+1,96
52,4+1,47
23,8+0,85

Fusarium avenacium ВКПМ В-623
76,1+2,44
76,2+3,85
76,2+2,41
59,5+1,94
64,3+1,87
64,3+2,03
23,8+0,70

Ph. infestans расы 3,4
80,0+2,55
80,0+2,79
80,0+2,64
66,0+1,95
66,0+2,04
68,0+2,17
50,0+1,03

Ph. infestans расы 1-11
70,0+2,69
75,0+2,70
75,0+2,13
62,5+1,98
57,5+1,72
67,5+2,03
25,0+0,81

Ba-1 - B. amyloliquefaciens ВКПМ В-10642, DSM 24614
Ba-2- B. amyloliquefaciens ВКПМ В-10643, DSM 24615
Bl-1- B. licheniformis ВКПМ В-10561, DSM 24609
Bl-2- B. licheniformis ВКПМ В-10562, DSM 24610
Bl-3- B. licheniformis ВКПМ В-10563, DSM 24611
Bl-4- B. licheniformis ВКПМ В-10564, DSM 24612
Bs-1- B. subtilis ВКПМ В-16041, DSM 24613

Антагонистическое действие штамма B. subtilis изучали другие авторы в отношении ряда возбудителей болезней сельскохозяйственных культур. Отмечено подавление фитопатогенных грибов родов Aspergillus, Botrytis, Monilia, Rhizopus, Penicillium, Fusaruim, Verticillium, Thelaviopsis, а также фитопатогенных бактерий родов Erwinia, Pseudomonas, Xanthomonas, Clavibacter. Наиболее выраженный эффект отмечен в отношении B. cinerea [Лапа, Авдеева, 2010]. Это подтверждено и в лабораторном опыте по прорастанию конидий возбудителя серой гнили B. cinerea при использовании другого штамма антагонистической бациллы - B. subtilis 494, по данным автора процент непроросших конидий фитопатогенного гриба составил 97,8–100 % [Стадниченко, 2011].
При интродукции бацилл в биоценозы необходимо учитывать влияние факторов внешней среды, что связано с реальными агроклиматическими условиями. Известно, что для спорообразующих бактерий в почвенных процессах большое значение имеет сочетание температурных условий и влажности, температурно-водный режим оказывает влияние на формирование микробного ценоза почвы.
Качественный состав комплекса почвенных микроорганизмов меняется в зависимости от типа почвы, а количественный – подвержен сильным колебаниям при изменении ее физических характеристик (температуры, влажности, скорости протекания процессов минерализации). В частности, наибольшее количество бацилл наблюдается при умеренной или пониженной влажности [Калинина и др., 1997].
На примере внесения бактериальных штаммов B. subtilis ИБ-15 и B. polymyxa ИБ-37, выделенных автором из почв сельскохозяйственного назначения в ризосфере пшеницы, продемонстрирована зависимость их протекторного действия и формирования структуры урожая культуры от абиотических факторов [Кузьмина, 1998]. Установлено, что наибольшее влияние на плотность популяции интродуцированных бацилл в ризосфере пшеницы оказывает температурный режимы почвы. С повышением температуры численность интродуцированных в ризосферу бацилл-антагонистов возрастает, однако реакция на изменение температуры зависит от видовой принадлежности штамма. В то же время исследуемые штаммы бацилл были способны колонизировать ризосферу пшеницы не только при оптимальном влагообеспеченни, но и при недостатке почвенной влаги. Автором установлено, что в полевых условиях эффективное подавление развития корневых гнилей пшеницы происходит в основном в раннем периоде вегетации растений: выход в трубку - цветение. В целом, анализ динамики численности B. subtilis ИБ-15 в прикорневой зоне пшеницы в условиях трех полевых сезонов показал, что этот штамм успешно колонизирует ризосферу пшеницы, а сезонные отличия динамики обусловлены погодными факторами.
В условиях Западной Сибири в садовом биоценозе нами испытано действие штаммов бацилл двух видов на фитопатогенный гриб D. applanata - возбудителя пурпуровой пятнистости, вызывающего наиболее распространенное заболевание малины [Штерншис и др., 2010]. Предварительно in vitro выявлена антагонистическая активность штаммов B. subtilis и двух штаммов B. licheniformes, выделенных в сибирских условиях. На чистой культуре D. applanata три исследуемых штамма бактерий рода Bacillus (104 КОЕ/мл) в той или иной степени подавляли ее рост. Так, на седьмые сутки выявлено подавление развития патогена под влиянием всех исследуемых штаммов. Ингибирующая активность штаммов составила от 17,2 до 69,7%. При увеличении концентрации суспензии в 10 и 100 раз не отмечено усиления ингибирующей активности штаммов в отношении D.applanata.
В 2008–2009 гг. проведены полевые опыты по изучению влияния суспензии трех штаммов, протестированных в лабораторных условиях, на поражение малины сорта Зоренька Алтая пурпуровой пятнистостью. В качестве сравнения использовали химический фунгицид топаз. Результаты действия препаратов на развитие пурпуровой пятнистости в полевом опыте 2008 г. представлены в таблице 1.6. Под влиянием биопрепаратов распространённость болезни уменьшилась в 1,9–2,9 раза, а развитие заболевания в 3,2–4,3 раза по сравнению с контролем. Развитие болезни в контроле превышало экономический порог вредоносности (ЭПВ) в 1,4 раза (ЭПВ – 25%). Различия по этому показателю между вариантами с использованием штаммов и химическим эталоном не существенны (d<НСР05=7,0). Биологическая эффективность применения биопрепаратов была близка для всех тестируемых штаммов – от 69,1 до 76,9%.
Таблица 1.6.
Влияние бактериальных штаммов на поражение малины пурпуровой пятнистостью, 2008 г.
Вариант

Распространённость
болезни, %
Развитие
болезни, %
Биологическая
эффективность, %

Контроль
92,5
35,0
-

B. licneniformis
IC- 832-1
32,5
8,1
76,9

B. licneniformis
IC-831-1
32,0
10,8
69,1

B. subtilis
ВКПМ В -7092
42,5
10,6
69,7

Топаз
50
12,5
64,3

НСР05

7,0






Таблица 1.7
Влияние бактериальных штаммов на поражение малины пурпуровой пятнистостью, 2009 г.
Вариант

Распространённость
болезни, %
Развитие
болезни, %
Биологическая
эффективность, %

Контроль
75,0
25,0
-

B. licneniformis
IC- 832-1
43,2
10,8
56,8

B. licneniformis
IC-831-1
34,1
8,5
66,0

Bacillus subtilis
ВКПМ В -7092
38,6
9,7
61,2

Топаз
38,6
10,8
56,8

НСР05

4,0



В таблице 1.7. представлены результаты, полученные в 2009 г., отличавшемся по погодным условиям от предыдущего. В 2008 г. более активное проявление симптомов поражения пурпуровой пятнистостью могло быть связано с обильными осадками в июне, что обусловило проявление ранней инфекции – пурпуровой пятнистости. В 2009 г. в июне повышенное количество выпавших осадков способствовало проявлению симптомов заболевания, однако более активное проявление сдерживалось температурным фактором – в целом температурный режим в этот период был пониженным. В 2009 г. по сравнению с 2008 г. отмечались более частые и резкие перепады температуры и менее интенсивные осадки. Под влиянием биопрепаратов распространённость болезни уменьшилась в 1,7–2,7 раза по сравнению с контролем, а развитие заболевания в 2,2–2,9 раза по сравнению с контролем. Глубокого поражения побегов малины в этом году не было отмечено. Развитие болезни в контроле не превышало ЭПВ. Различия между вариантами с использованием биопрепаратов и химическим эталоном не существенны (d<НСР05=4,0). Биологическая эффективность применения биопрепаратов была близка как для штамма B. subtilis, так для двух штаммов B. licheniformis, – от 54 до 66% Сравнение результатов по годам показало, что более всего влияние абиотических факторов отразилось на активности первого штамма, но не повлияло на эффективность двух остальных [Штерншис и др., 2010].
Кроме того, в полевых условиях нами изучена активность этих штаммов против септориоза черной смородины сорта Галинка, возбудитель Septoria rubis [Шпатова и др., 2011]. При испытании штаммов наиболее эффективными для защиты смородины черной от септориоза в течение вегетационных периодов 2008-2010 гг. оказались бактериальные штаммы B. licheniformis ВКПМ В-10561 и ВКПМ В-10562. Биологическая эффективность применения этих штаммов составляла в среднем за три года 74% (рис.1.2). Биологическая эффективность штамма B. subtilis ВКПМ В-10641 составила 60-69%, хотя в 2010 г. эффективность его применения (77%) превысила эффективность двух других штаммов, что можно объяснить аномальными условиями 2010 г. В первой половине вегетационного периода (май – июнь) в связи с низкими температурами до начала июня, холодными ночами в этот период проявление симптомов поражения грибными заболеваниями смородины отмечались единично. Более активное поражение септориозом наблюдали в июле и августе в связи с повышением температуры и более обильными осадками.
13 EMBED Excel.Chart.8 \s 1415
Рис. 1.2. Динамика пораженности черной смородины септориозом под влиянием обработок бактериальными штаммам и B. subtilis ВКПМ В-10641 и B. licheniformis ВКПМ В-10562, ВКПМ В-10561 (СХА «Сады Сибири») в среднем за 2008 - 2009 гг. (НСР05 по препаратам – 0,21; НСР05 по срокам – 0,17).

Биологическая эффективность химического эталона топаза в среднем за три года составила 85%, что объяснимо, так как данный препарат обладает более продолжительным периодом воздействия и менее подвержен влиянию погодных условий, чем экспериментальные препараты на основе бактериальных штаммов. Однако необходимо отметить, что в 2009 г. биологическая эффективность экспериментальных биопрепаратов достигла уровня химического фунгицида.
Проведенные исследования по снижению пораженности растений смородины септориозом показали, что результаты в целом сопоставимы с данными, полученными при обработке этими же препаратами растений малины против пурпуровой пятнистости [Штерншис и др., 2010].
Что касается биологического контроля других болезней плодовых и ягодных культур, то изучено влияние B. subtilis на серую гниль земляники [Hang et al., 2005; Helbig, Bochow, 2001] и яблок при хранении [Peighami-Ashnaei et al 2009], а также на болезни виноградников [Furuya et al., 2011]. Подавление возбудителя серой гнили B. cinerea на растениях винограда и плодов яблони продемонстрировано также при применении штаммов бактерии Bacillus spp., причем наибольшую активность проявлял вид B. licheniformis[Haidar, 2016; Tourй, 2004].
Интродукция бацилл для биологического контроля болезней ягодных и плодовых культур вместо применения химических пестицидов особенно ценно в связи с преимущественным потреблением плодов этих растений в свежем виде, а также их использованием в лекарственных целях.
Представляет интерес возможность использования штаммов бацилл для подавления болезней картофеля – одной из основных продовольственных культур в России – как в период вегетации, так и в период хранения клубней картофеля. В этом плане в отношении возбудителя фузариоза картофеля показана возможность подавления роста фитопатогенов F. sambacinum, F. oxysporum и F. redolens. Среди активных штаммов были представители рода Bacillus: B. subtilis штаммы 1-3, B. weihenstephanensis и B. pumilis. Штаммы B. subtilis № 2 и 3 проявили наибольшую способность к ингибированию роста колоний микромицетов, в том числе против возбудителей сухой гнили картофеля [Марданова и др., 2015]. Продемонстрированы также возможности антагонистического эффекта B. licheniformis в отношении болезней картофеля [Sadfi et al., 2002].
Отмечено снижение поражения растений картофеля возбудителем ризоктониоза - фитопатогенным грибом R. solani при использовании бактериальных штаммов. Эффект подавления болезни варьировал от 12 до 83% [Schmiedeknecht et al., 1998; Donmez et a.l, 2015].
В отношении возбудителей черной ножки картофеля Erwinia carotovora var. Atroseptica и E. aroideae, а также сухой фузариозной гнили F. sambucinum изучена активность более 200 штаммов бактерий рода Bacillus [Дорожкин и др., 1991]. По данным И.И. Новиковой с соавторами [2013], антагонистический эффект исследованных ими штаммов бацилл против возбудителей ризоктониоза и серебристой парши варьировал в зависимости от биоагента и фитопатогена. Наиболее выраженное действие оказали B. subtilis И-5 12/23 и B. laterosporus Bl 101( до 78% в отношении возбудителя серебристой парши Helmintosporium soiani и до 42% в отношении возбудителя ризоктониоза картофеля Rhizoctonia solanii.
Подавление возбудителей ризоктониоза, фузариоза и белой гнили (R. solani, Sclerotinia minor и F. solani) отмечено при изучении потенциальных биоагентов B. amyloliquefaciens, B. methylotrophicus и B. subtilis [Kai et al., 2007; Schisler et al., 2009, 2012; Catello et al., 2012]. В результате скрининга штаммов бацилл из Государственной коллекции микроорганизмов ГНУ ВИЗР и ВКПМ ФГУП НИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов по признаку антагонистической активности в отношении возбудителей болезней картофеля при хранении авторами были отобраны наиболее перспективные штаммы B. laterosporus Bl101, B. subtilis М-22 и B. subtilis-И5-12/23 [Рой и др., 2005].
Показано, что интенсивность развития болезней картофеля зависит от численности и состава антагонистов. При изучении биоразнообразия и антагонистической активности эпифитных микроорганизмов, выделенных с клубней картофеля, продемонстрировано, что наиболее активны штаммы рода Bacillus [Бельская и др., 1995].
Е. И. Кипрушкиной [2015] проведено детальное исследование возможностей использования бактерий-антагонистов для обработки клубней при холодильном хранении. При обработке клубней штаммами B. subtilis наблюдалась зависимость уровня снижения потерь от сорта картофеля. Показаны адаптивные возможности штамма B. subtilis 413, который после инокуляции присутствовал в составе эпифитной микробиомы клубней картофеля при холодильном хранении. Использование бацилл-антагонистов для обработки клубней привело к продлению сроков хранения, повышению пищевой ценности и последующего увеличения урожайности культуры.

1.4. Взаимодействие Bacillus thuringiensis с фитофагами
Энтомопатогенные бациллы издавна известны как регуляторы численности насекомых в природе. В качестве агентов биологического контроля численности насекомых наиболее часто используются бактерии Bacillus thuringiensis [Гулий и др.,1982; Garczynnski, Siegel, 2007]. Бактерия получила свое окончательное название Bacillus thuringiensis Вerliner в 1911г. после ее выделения Э. Берлинером в Германии (Тюрингия) из мельничной огневки Ephestia kuhniella Zell. и последующей идентификации [Berliner, 1911]. B. thuringiensis как спорообразующая бактерия во время споруляции продуцирует также параспоральный кристаллический белок, обладающий токсическим действием на насекомых. Это свойство и обусловило широкое использование B. thuringiensis как основы экологически безопасных энтомопатогенных препаратов в качестве альтернативы синтетическим химическим пестицидам.
Первоначально штаммы B. thuringiensis выделяли из насекомых отряда чешуекрылых и, соответственно, использовали для контроля численности этих же фитофагов [Heimpel, 1967]. Впоследствии выяснилось, что штаммы B. thuringiensis можно выделять из различных природных субстратов, включая почву, лесную подстилку, больных и погибших насекомых нескольких отрядов, а также с листьев растений и других объектов [Бурцева и др., 2001; Ермолова, 2016]. После продолжительного применения препаратов на основе этой бактерии исключительно против гусениц, в 1977 г. был выделен штамм B. thuringiensis subsp. israelensis, вызывающий заболевание и гибель насекомых отряда двукрылых [Маргалит, Бен-Дов, 2001]. Сначала в качестве хозяев этого подвида рассматривались только кровососущие комары, но впоследствии среди насекомых-хозяев выявились и фитофаги. Через несколько лет в Германии был идентифицирован штамм B. thuringiensis ssp. tenebrionis (morrisoni), токсичный для личинок отряда жесткокрылых [Krieg et al., 1983]. Данный подвид характеризуется пластинчатой формой кристаллов эндотоксина в виде плоских квадратов, прямоугольников и ромбов в отличие от бипирамидальной формы кристалла подвидов, действующих на гусениц или от округлой формы белкового кристалла B. thuringiensis subsp. israelensis.
По мере обнаружения новых изолятов B. thuringiensis как агентов бактериологического подавления численности насекомых произошло разделение бактерии на патотипы (патоварианты) согласно специфичности их энтомоцидного действия на насекомых определенных отрядов [Hofte, Whiteley, 1989; Lereclus et al., 1993]. Наиболее значимы как основа биопрепаратов для биоконтроля численности насекомых три патотипа B. thuringiensis (А, В и С). Подвиды B. thuringiensis, кристаллы которых с наибольшей активностью поражают чешуекрылых, относятся к патоварианту А. В патовариант В включены штаммы, поражающие двукрылых, а в патовариант С - жесткокрылых. Подвиды B. thuringiensis, относящиеся к этим патотипам, чаще всего используются в качестве основы препаратов для биологического контроля насекомых-фитофагов, хотя в целом насчитывается большее число патовариантов B. thuringiensis, в том числе активных в отношении нематод и фитопатогенов [Смирнов, 2000; Bravo et al., 1998].
Рассматриваемый вид спорообразующей энтомопатогенной бактерии продуцирует вторичные метаболиты, активно участвующие в инфекционном процессе. К метаболитам B. thuringiensis относят ферменты, антибиотики и токсины, среди которых, как уже упоминалось, наибольшее значение для контроля численности насекомых имеет белковый (-эндотоксин. Значимую роль в подавлении численности насекомых играет также продуцируемый бактерией во внешнюю среду термостабильный
·–экзотоксин нуклеотидной природы [Кандыбин и др.,2009].
Механизм действия дельта-эндотоксина B. thuringiensis на насекомых детально изучен [Bravo et al., 2007, 2013; Pardo-Lopez et al., 2013]. Сначала растворение белкового кристалла в среднем отделе кишечника насекомого происходит под действием щелочного рН кишечника. Высвобождающиеся полипептиды – протоксины имеют молекулярную массу (м.м.) 130 кДа для патоварианта А и 67 кДа – для патовариантов В и С. Следующая более важная стадия – активация под действием сериновых протеаз. Протоксины превращаются в истинные токсины, уменьшаясь в размерах примерно вдвое за счет отщепления N-терминальных аминокислотных остатков. Последовательно повышается инсектицидная активность получаемых токсинов. Интактный кристалл в 3,5 раза менее активен, чем протоксин, который, в свою очередь, в 6 раз менее активен, чем истинный токсин [Luthy, Wolfersberger, 2000]. Истинный токсин является по современной номенклатуре Cry-токсином. В настоящее время известно большое количество продуцируемых B. thuringiensis дельта-эндотоксинов. Это разнообразие обусловлено генетической пластичностью B. thuringiensis. В результате многочисленных работ по получению инсектицидных белков (путем включения кодирующих их генов в геном бактерии кишечной палочки), потребовалась систематизация как генов, так и продуцируемых ими токсинов B. thuringiensis. Во всем мире пользуются номенклатурой, предложенной группой ученых во главе с Н. Крикмор [Crickmore, 2000; Crickmore et al., 1998, 2014]. Гены, кодирующие инсектицидные белки дельта-эндотоксина, обозначены как cry, а сами токсины как Cry (cокращение от английского crystal – кристалл). В дополнение к инсектицидным Cry-белкам обнаружены цитолитические Cyt-белки у диптеро-специфичных штаммов (B. thuringiensis subsp. israelensis) [Маргалит, Бен-Дов, 2001; Ben-Dov, 2014]. В основу номенклатуры токсинов положен принцип алгоритмов филогенетического дерева. Присвоенные генам и белкам ранговые цифры и буквы указывают на степень филогенетического расхождения, что отражается в последовательности аминокислот в белке. Каждый токсин именуется по четырем рангам (арабские буквы), например, Cry1Ab или Cyt2Ba. Наименование зависит от местонахождения в филограмме, демонстрирующего степень идентичности аминокислотной последовательности между белками. Филограмма, а также список Cry и Cyt-белков представлены в обзорах [Crickmore et al., 1998; 2014; Schnepf et al., 1998]. Многие штаммы B. thuringiensis образуют более одного Cry-токсина, включенных в один кристалл дельта-эндотоксина [Luthy, Wolfersberger, 2000]. Cry и Cyt- белки относятся к классу PFT-токсинов (pore-forming toxins), образующих поры в клеточных мембранах [Bravo et al., 2007]. К белкам, токсичным для Lepidoptera, относятся, например, Cry1 и Cry9, для Coleoptera – Cry3, Cry7 и Cry8, а для Diptera – Cry11, Cry21 и Cyt-белки (Bravo et al., 2007).
Структура Cry- токсинов тесно связана с механизмом их действия. Эта структура включает три домена (рис. 1.3).


Рис.1.3. Структура Cry-токсина.
Домен II заканчивается тремя петлями, которые взаимодействуют c рецепторами клеточных мембран (Li et al., 1991).
Рентгеноструктурный анализ Cry белков B. thuringiensis обнаружил наличие трех составляющих их доменов [Grochulski et al.,1995; Garczynski, Siegel, 2007]. Домен I представляет пучок из 7 (-спиралей, одна из них опоясывает остальные шесть. Домен II состоит из трех антипараллельных (-структур. Бета-ленты каждой структуры заканчиваются тремя выступающими петлями. Домен III представляет сэндвич из двух (-структур. Проходя через перитрофическую мембрану, токсин связывается со специфическим участком (сайтом) на мембране цилиндрических клеток эпителия кишечника, затем образуются поры в мембране, через которые происходит проникновение в клетку токсина [Luthy, Wolfersberger, 2000]. При этом основная функция домена I заключается в увеличении проницаемости клеточных мембран, а домена II – в связывании с рецепторами. Связывание домена II с рецепторами – ключевой момент, отвечающий за специфичность действия. Для этого в структуре имеются специальные петли на конце домена II, которые зацепляются за рецепторы как за якорь. Охарактеризованы 4 типа рецепторов на примере Сry1А: кадхерин-подобный белок (CADR); гликозилфосфатидилинозитол (GPI), связанный с N-аминопептидазой (APN); GPI, связанный с щелочной фосфатазой (ALP); и 270-кДа гликоконъюгат (GCR) [Hua et al., 2004]. Рецепторы идентифицированы как белки или гликолипиды. В частности, рецептором для Cry 1Ac у капустной моли служит APN. Количество токсина, необходимое для гибели, определяется соответствием насекомого (его рецепторов) токсину. Так, гусеницы капустной белянки (массой 200-300 мг) погибают от 25-50 нг кристаллического белка, кодируемого cry1A генами, а для личинок комаров достаточно в 10 раз меньше белка, кодируемого генами cry4, cry10 и cry11. Домен III проявляет многофункциональность: защита токсина от протеолиза, связывание с рецепторами и участие в образовании ионных каналов. Его влияние имеет особое значение в случае эндотоксина двойного действия (против чешуекрылых и двукрылых) [Bravo et al., 2007]. При введении сублетальной дозы эндотоксина поврежденный эпителий способен восстановиться, а устойчивость насекомого к определенному подвиду связана с отсутствием связывания с рецепторами [Luthy, Wolfersberger, 2000; Garczynski, Siegel, 2007]. В этом аспекте интересно исследование, где показано, что невосприимчивость гороховой тли к токсинам Cry 1Ac Cry 3Aa определяется отсутствием связывания их с эпителием кишечника насекомых [Li et al., 2011].
Таким образом, краткая схема действия Cry-токсинов выглядит следующим образом: 1) связывание с рецептором мембран клеток, 2) внедрение токсина в клеточную мембрану с последующей олигомеризацией и образованием пор и/или ионных каналов в мембране, 3) осмотический дисбаланс и лизис клетки. Внешне это проявляется в прекращении питания в течение 1 часа вследствие паралича кишечника, а затем гибели через 1-2 дня. Поврежденный эпителий перестает быть барьером для бактериальной инфекции (проникновения спор).
При растворении белкового эндотоксина B. thuringiensis патоварианта В образуется также Cyt-токсин, состоящий из единственного домена, включающего бета-слой, вокруг которого обвиты две альфа-спирали [Lopez , Ceron, 2007]. Механизм взаимодействия Сyt-токсина с клеточной мембраной отличается от механизма действия Сry-токсина [Маргалит, Бен-Дов, 2001; Ben-Dov, 2014]. Первоначальное связывание происходит с ненасыщенными фосфолипидами, поэтому токсин не действует на бактериальные протопласты, из которых удалены фосфатидилхолин, сфингомиелин и холестерол. Существенным здесь является ацилненасыщенность в определенном положении фосфолипида мембраны. Сначала токсин связывается как мономер, затем образует агрегаты, формируя поры в мембране. Молекулярная масса агрегатов 300-400 кДа, что эквивалентно 16 молекулам токсина. Формирование пор приводит к цитолизу. Однако по другим данным, Cyt A не создает хорошо сформированные каналы, а действует как детергент, разрушая структуру мембраны. Результаты работы К. Ду с соавторами [Du et al., 1999] показали, что С-терминальная часть Cyt A и Cyt B токсинов, состоящая из (-структур, внедряется в мембрану с образованием пор. По данным П. Бутко [Butko, 2003] токсичность кристаллов Bt ssp. israelensis обусловлена комбинацией четырех белков Cyt 1A, Cry 4A, Cry 4B и Cry 11A. Синергизм между Cyt 1A и Cry 11A увеличивает токсичность каждого в 4-5 раз в сравнении с их индивидуальным действием. Подробный механизм действия эндотоксина представлен в обзорах А. Браво с соавторами [Bravo et al., 2007, 2013]. Считают также, что на основе структурных особенностей токсинов их можно отнести к трем категориям: трехдоменный токсин тип
·-PFT, Cyt-токсин тип
·-PFT и аэролизины (параспорины) тип
·-PFT [Xu et al., 2014]. К последним принадлежат токсины, поражающие раковые клетки человека.
Что касается термостабильного
·-экзотоксина (турингиензина), то долгое время считали, что он является антиметаболитом нуклеиновых кислот, механизм действия которого заключался в ингибировании синтеза ДНК-зависимой РНК-полимеразы (репликазы) [Farkas et al., 1976]. По последним данным, этот токсин представляет собой небольшую молекулу олигосахарида, включающую аденозин, глюкозу, фосфорную глюконовую кислоты с молекулярной массой 701 Да [Liu et al., 2014]. Вызывает тератогенез, наиболее ярко проявляющийся у взрослых насекомых. В головном отделе возможна атрофия или редукция глаз, усиков, ротового аппарата. Наблюдается атрофия или деформация конечностей и крыльев. Естественно, что нормальная жизнедеятельность таких уродливых особей невозможна. В первые же часы интоксикации наблюдаются качественные превращения гемоцитов. При инъекции в полость тела гусениц (-экзотоксин значительно токсичнее, чем при скармливании [Кандыбин, 1989]. Кроме того, разными авторами показано, что личинки старших возрастов более восприимчивы к экзотоксину, чем младшие. В комплексе со спорами и кристаллами экзотоксин действует как синергист [Bravo et al., 2007]. Содержание
·-экзотоксина расширяет сферу применения B. thuringiensis за счет иного механизма действия экзотоксина по сравнению с эндотоксином. Экзотоксин может действовать не только через кишечник, но и через покровы насекомых, а в комбинации со спорово-кристаллическим комплексом проявляет синергизм. Поэтому экзотоксинсодержащие препараты рекомендованы не только против гусениц, но также против таких опасных вредителей, как колорадский жук Leptinotarsa decemlineata Say и паутинный клещ Tetranichus urticae Koch.
Вызывает интерес еще один класс экзотоксинов B. thuringiensis - вегетативные инсектицидные белки (Vip-белки), активные против широкого спектра чешуекрылых насекомых [Lee et al., 2003; Garczynski., Siegel, 2007]. Эти белковые экзотоксины секретируются во время вегетативного роста некоторых штаммов B. thuringiensis. В частности, показано, что препарат секретируемых белков B. thuringiensis ssp. kurstaki (штамм 5м) вызывал гибель 60% гусениц черемуховой моли. Электрофоретический анализ данных секретируемых белков в SDS-PAGE показал, что у этого штамма присутствовал белок с молекулярной массой порядка 89 кДа [Калмыкова и др., 2009]. Это соответствует данным по вегетативному инсектицидному белку Vip 3А, который проявляет активность против широкого спектра личинок Lepidoptera, лизируя эпителиальные клетки среднего кишечника [(Donovan et al., 2001]. Индийские ученые [(Sattar et al., 2008] впервые продемонстрировали действие Vip-белка на насекомых отряда Homoptera, что особенно важно для биоконтроля численности этих фитофагов. В последующие годы интерес к вегетативным инсектицидным белкам стал возрастать [Hernandez-Rodriguez et al., 2009; Hernandez-Martinez et al., 2013; Silva et al., 2016]. При изучении действия токсина Vip 3Аа16 на гусениц двух видов насекомых: мельничной огневки Ephestia kuehniella и Египетской хлопковой совки Spodoptera littoralis показано, что узнавание рецепторов в кишечнике гусениц этим токсином определяет его активность в отношении разных насекомых- хозяев [Abdelkefi-Mesrati et al., 2011]. Выявляется все большее разнообразие экзотоксинов Vip3А. Так, Vip3Аа45 и Vip 3Аg4 из испанской коллекции B. thuringiensis, отличающиеся от Vip 3Аа1, высокотоксичны для гусениц трех видов насекомых [Palma et al., 2013], Vip3Ad нетоксичен для 8 видов насекомых, а Vip3Af проявлял активность только в отношении гусениц кукурузного мотылька Ostrinia nubilalis [Escudero et al., 2014]. Проанализирован механизм действия Vip3Аа и Cry1Ia10 токсинов B. thuringiensis на гусениц совок четырех видов Spodoptera spp. In vitro показано, что эти два токсина не конкурируют за один и тот же рецептор мембран ворсинок среднего отдела кишечника [Bergamasco et al., 2013]. При этом вегетативный инсектицидный белок более активен, чем Cry токсин, а их смешивание приводит к синергизму в отношении трех видов совок. Только в случае совки S. eridania выявлена возможность конкурирования токсинами за один рецептор, тогда более высокую активность проявляет Cry1Ia10 токсин. На примере озимой совки Agrotis segetum экспериментально доказано, что Vip3Аа16 специфически связывается с ворсинками среднего кишечника гусениц и не ингибирует при этом связывание Cry1Ас токсина с другим рецептором мембран ворсинок и наоборот. Авторы считают, что этот результат важен для использования Vip-токсина в качестве нового биоагента контроля численности насекомых [Hamadou-Charfi et al., 2013].
Экологические факторы, включающие абиотические и биотические, воздействуют на оба сочлена системы энтомопатогенная бактерия – хозяин при развитии патологического процесса насекомого под влиянием биоагента.
Из абиотических факторов наиболее значимы температура, влажность и солнечный свет, из биотических – микрофлора окружающей среды, биологически активные вещества растений. Все эти факторы могут в разной степени влиять на течение инфекционного процесса и на сами патогены, сохраняющиеся в окружающей среде. Рассмотрим влияние основных экологических факторов, влияющих взаимодействие энтомопатогенных бактерий с фитофагами, что часто ведет к затруднениям в их использовании как основы биологических препаратов.
Влияние температуры и влажности
Температура и влажность, как правило, неоднозначно влияют на бактериальные агенты биологического контроля насекомых, как обитающих в естественных условиях, так и внесенных в биоценозы в составе биопрепаратов. Следует иметь в виду, что насекомые как пойкилотермные животные практически имеют температуру тела, равную температуре окружающей среды.
В случае бактериальных инфекций насекомых, температура оказывает определенное влияние на сохранность вегетативных клеток, спор и токсинов энтомопатогенных бактерий, а также на течение инфекционного процесса. Влияние температуры на токсины B. thuringiensis зависит от их химической природы. Так, белковый дельта-эндотоксин значительно менее устойчив к температуре, чем бета-экзотоксин нуклеотидной природы. Температура достаточно сильно влияет на течение инфекционного процесса при заражении насекомых B. thuringiensis. Обычно оптимальная температура составляет 2432(С, нижний температурный предел 1315(С, верхний – 3650(С (для разных пар хозяин-паразит) [Бурцева и др., 2001]. При изучении остаточной активности B. thuringiensis из трех бактериальных препаратов (Delfin, Dipel и Foray) в хвойном лесу установлено, что через 8 дней после обработки оставалось около половины первоначального количества бацилл при температурах 1023оС [Gindin et al., 2007]. Эти данные свидетельствуют о значении температуры окружающей среды при внесении в биоценозы бактериальных энтомопатогенов для эффективного их использования.
Влияние влажности на течение инфекционного процесса при действии энтомопатогенных бактерий незначительно. Однако при хранении в водной суспензии разрушение бацилл происходит гораздо быстрее, чем при хранении в сухом виде [Штерншис, 1995].
Влияние солнечной радиации
Солнечная радиация, главным образом ультрафиолетовое облучение (УФО) - самый мощный фактор инактивации энтомопатогенных микроорганизмов. В лесных массивах влияние солнечного излучения несколько ослаблено за счет кроны.
Существует некоторая разноречивость мнений относительно разной восприимчивости спор и кристаллов экзотоксина к УФО. Как правило, исследователи указывают на более высокую, а иногда абсолютную устойчивость кристаллов. Но имеется ряд отечественных и зарубежных работ, где отмечается, что под влиянием инсоляции эндотоксин инактивируется [Лескова, 1987], и в ряде случаев быстрее, чем споры Батурин, Батурина, 1987].
Для B. thuringiensis ssp. kurstaki продемонстрировано снижение инсектицидной активности спор и эндотоксина под влиянием солнечной и УФ- радиации. При этом соотношение скорости инактивации спор и скорости инактивации кристаллов под действием естественной солнечной радиации выше, чем это же соотношение под действием УФО [Петров и др., 1989]. Это подтвердили и данные зарубежных авторов [Pozsay et al., 1987; Pusztai et al., 1991]. В наших опытах по облучению спор и кристаллов эндотоксина уже через 20 минут при длинах волн 290-340 нм жизнеспособность спор уменьшалась в 30 раз, а для уменьшения количества кристаллов потребовалось облучение в течение 4 часов [Штерншис, 1995].
Под влиянием солнечной радиации разрушается, хотя и медленнее, и (-экзотоксин B. thuringiensis [(Кандыбин, 1989]. Так, количество экзотоксина на листьях и в поверхностном слое почвы снижается соответственно на 12 и 60% через 1 сутки после нанесения и на 75 и 86% через 15 суток. По данным К. Иньоффо [Ignoffo, 1992], под действием солнечной радиации активность эндотоксина и жизнеспособность спор на листьях уменьшается быстрее, чем активность (-экзотоксина.
Другие факторы окружающей среды
Интересно, что повреждение микроорганизмов под действием УФО зависит также от влияния кислорода воздуха. Высказана гипотеза [Ignoffo, Garcia, 1978], что при инсоляции энтомопатогенов поверхностные биомолекулы образуют органические перекиси, ответственные за уменьшение жизнеспособности и патогенности биоагентов. Известно, что поглощение света в живых организмах с участием фотосенсибилизаторов в присутствии кислорода ведет к процессам повреждения биологических объектов [Фут, 1979]. Взаимодействие кислорода с фотосенсибилизаторами происходит через процесс свободнорадикального окисления биологических макромолекул микроорганизмов, что приводит к их повреждению. Можно полагать, что выживание аэробных микроорганизмов в атмосфере кислорода связано со сложным взаимодействием между биологической генерацией свободных радикалов и способностью организма контролировать эти частицы. Контроль свободных радикалов кислорода осуществляется супероксидисмутазной и антиоксидантной системами клетки. Эти данные согласуются с концепцией отрицательного влияния кислорода как компонента внешней среды на энтомопатогенные микроорганизмы, что подтверждено экспериментами по интенсивной обработке кислородом спорокристаллического комплекса B. thuringiensis subsp. galleriae (штамм 69-6). Оказалось, что при этом количество живых спор уменьшается более чем на порядок, а процент гибели насекомых - тест-объектов снижается более чем вдвое [Штерншис, 1995]. При добавлении в обрабатываемую суспензию спор и кристаллов антиоксидантов как ингибиторов свободных радикалов сохранность биоагентов резко возрастала. В условиях высокой скорости подачи кислорода добавление антиоксиданта в концентрации 0,2% сохраняло споры и кристаллы. Эти опыты свидетельствуют о необходимости учета и данного экологического фактора. Игнорирование роли этого фактора в исследованиях энтомопатогенов связано с неочевидностью повреждений и традиционной оценкой кислорода как необходимого компонента в жизни аэробных микроорганизмов. В природе энтомопатогенные бактерии испытывают неблагоприятное воздействие кислорода в комплексе с другими факторами: температурой, влажностью, УФО. Под влиянием всех этих факторов могут быть созданы благоприятные условия запуска свободнорадикальных механизмов повреждения микроорганизмов. В этой связи уместно привести данные по влиянию углекислого газа на активность энтомопатогенных бактерий. При изучении действия атмосферного углекислого газа на активность B. thuringiensis, распределенных на листьях, в отношении насекомых, выявлена прямая зависимость от концентрации газа в воздухе [Coviella, Trumble, 2000]. По мнению авторов, при прогнозируемом в будущем увеличении концентрации СО2 в атмосфере повысится и эффективность энтомопатогенных бактериальных препаратов в полевых условиях. Эти результаты также находятся в согласии с концепцией влияния кислорода на микроорганизмы.
К абиотическим факторам окружающей среды антропогенной природы относятся различные химические соединения, в том числе соли, химические инсектициды и другие агрохимикаты. Как правило, кратковременное воздействие их не оказывает влияние на энтомопатогены. В то же время нельзя полностью исключать отрицательного действия химикатов. Восприимчивость к энтомопатогену фитофага может зависеть от химического состава растения, на котором он питается. Еще до попадания в организм насекомого на патогены воздействуют фитонциды и другие биологически активные вещества, продуцируемые растениями.
Одними из первых бактериостатическое и бактерицидное действие хвои на B. thuringiensis отметили сибирские ученые [Полтев, Печерская, 1967]. Авторы полагали, что фитонциды могут защищать насекомых от болезней, подавляя энтомопатогены, попадающие на растения. При нанесении на зерно пшеницы и кукурузы бактериального препарата наблюдали снижение активности (-эндотоксина и (-экзотоксина уже через 15 суток [Salama et al., 1996]. Учитывая отсутствие солнечного излучения и осадков, можно полагать, что ингибирующее влияние на токсины оказывали биологически активные вещества зерен.
В то же время в опытах Н.В. Кандыбина [1989] по влиянию фитонцидов и экстрактов листьев тополя душистого, яблони и других плодовых культур на B. thuringiensis не обнаружено существенного влияния на бактерии этих растений. По другим данным, белок эндотоксина может инактивироваться танинами, экстракт листьев хлопка уменьшал его активность сильнее, чем экстракт хвои [Garczynski, Siegel, 2007]. Кроме того, и высокая (рН 1) и низкая (рН 11) кислотность поверхности листьев инактивирует белок токсина [Burges, Jones, 1998]. Изучены взаимодействия в системе триотрофа: разновидности капусты – капустная моль – B. thuringiensis. В качестве растительного субстрата использовали капусту белокочанную, цветную, китайскую и краснокочанную [Jafary et al., 2016]. B. thuringiensis наиболее активно подавлял численность гусениц моли при их питании на менее привлекательном растении (краснокочанная капуста) по сравнению с более привлекательным кормовым ресурсом (китайская капуста). Такая тенденция выявлена и в наших опытах [Андреева и др., 2013] по восприимчивости гусениц фитофагов к бактериальному препарату в зависимости от разновидности капусты. На менее благоприятном для развития насекомых растении-хозяине их восприимчивость к биопрепарату (B. thuringiensis subsp. kurstaki) была выше, хотя и варьировала в зависимости от численности в определенных условиях года. Такая зависимость подтверждается результатами ряда работ, где изучалось влияние растения-хозяина на эффективность B. thuringiensis в отношении насекомых-фитофагов [Meade, Hare, 1993; Janmaat, Myers, 2005]. Величина ЛК50 B. thuringiensis subsp. kurstaki, используемого против гусениц 3-го возраста лугового мотылька, значительно варьировала в зависимости от вида растения. Наименьшую ЛК50 отмечали при питании на свекле, в то время как на моркови значения были в 5,5-6,0 раза выше [Андреева, 2009]. При испытании B. thuringiensis subsp. kurstaki против гусениц Malacosoma disstria Hub., питающихся на разных субстратах, показано, что ЛК50 для личинок 3–го возраста была в 100 раз больше на тополе, чем на сахарном клене [Kouassi et. al., 2001]. Бактериальный токсин Cry1Ac при испытании против совки Helicoverpa armigera оказался более эффективным на растениях хлопчатника и сорго [Paramasiva et al., 2014]). Учет влияния кормового ресурса в системе триотрофа служит резервом повышения активности B. thuringiensis в контроле численности фитофагов.
Влияние на энтомопатогенные бактерии и на течение инфекционного процесса оказывают представители эпифитной, почвенной и другой микрофлоры окружающей среды (биотические факторы). Например, при изучении влияния грибов рода Beauveria на B. thuringiensis subsp. dendrolimus выявлено подавляющее действие грибов на эту бактерию [Громовых, 1982].
Почва является экологической средой как для энтомопатогенов, поражающих наземных насекомых, но персистирующих там до встречи с объектом – мишенью, так и для энтомопатогенов, паразитирующих на почвообитающих насекомых. В почве патогены подвергаются действию уже рассмотренных абиотических и биотических факторов, исключая солнечное излучение. А.Я. Лесковой [1987] установлено существенное значение для сохранности энтомопатогенных бактерий типа почвы, а также показателя кислотности. Бактерии не размножались в почвах с низким рН и отмирали при рН 5,0-5,6. Бациллы сохранялись в почве около двух лет, причем у реизолятов через 2 года выявлены изменения физиолого-биохимических свойств. При инкубировании спор и кристаллов B. thuringiensis ssp. kurstaki в почве показано, что хорошая выживаемость спор через 2 недели пребывания в почве обусловлена их неспособностью прорастать в этой среде [Petras, Casida, 1985].
Очевидно, сохранность спор и кристаллов B. thuringiensis зависит от типа почвы, ее кислотности, влажности, почвенной микрофлоры. Около 90% кристаллов эндотоксина утрачивают токсичность в нестерильной почве в течение 1000 дней [West, Burges, 1985]. Время выживания в почве спор и кристаллов в основном составляет от нескольких дней до нескольких месяцев на глубине не более 10 см [Garszynsky, Siegel, 2007].
В целом бактериальные метаболиты меньше, чем споры, зависят от абиотических факторов окружающей среды (температура, влажность, УФО).
Влияние всех описанных экологических факторов в сочетании, например, с повышенной плотностью популяции насекомого, может привести к возникновению эпизоотий. Процесс можно рассматривать как взаимодействие популяции патогенного паразита с популяцией его хозяина в конкретных условиях внешней среды. Чаще эпизоотии возникают в лесных биоценозах или в насаждениях многолетних культур. Эпизоотии, как уже отмечалось, являются источником выделения из погибших насекомых возбудителей болезней, которые и являются потенциальной основой биопрепаратов. Хотя в лесу наиболее распространены вирусные эпизоотии, именно при бактериальной эпизоотии сибирского шелкопряда Е.В. Талалаевым выделена бактерия – основа первого отечественного бактериального препарата дендробациллин. Многолетние исследования эпизоотий сибирского шелкопряда, вызванные B. thuringiensis, проводил В.С.Кулагин [1987]. По мнению автора, куколки сибирского шелкопряда представляют оптимальную экологическую среду для размножения и сохранения энтомопатогенных бацилл в лесном биоценозе. Хитиновая оболочка и размещение коконов с нижней стороны веток предохраняют размножившиеся микроорганизмы от УФ-облучения и смыва.
Таким образом, абиотические и биотические факторы в большей степени влияют на биологические агенты по сравнению с химическими веществами – основой синтетических инсектицидов. Это отражается как на сохранности биоагентов при хранении и применении, так и на скорости действия на целевой объект. Поэтому многочисленные исследования направлены на преодоление нестабильной эффективности биопрепаратов, наблюдающейся в практике и мешающей часто увеличению доли их использования в управлении фитосанитарным состоянием биоценозов.

Г л а в а 2
СОЗДАНИЕ И ПРИМЕНЕНИЕ БИОПРЕПАРАТОВ, ОБЕСПЕЧИВАЮЩИХ ЗДОРОВЬЕ РАСТЕНИЙ
2.1. Общие принципы разработки биопрепаратов на основе бацилл
Большинство биологических препаратов для защиты растений от фитофагов и фитопатогенов как в России, так и во всем мире производят на основе бактерий рода Bacillus. Биотехнология получения этих бактериальных препаратов достаточно проста. В производстве биопрепаратов основным является культивирование исходного штамма-продуцента на питательной среде (ПС) и получение необходимой препаративной формы. Выделим общие проблемы производства биопрепаратов. В первую очередь, для производства биопрепарата нужны активные исходные штаммы, а это требует селекции микроорганизмов. Селекцию ценных в отношении получения бактериальных препаратов бактерий осуществляют при выделении штаммов из природных источников, а также при получении экспериментальным путем (мутагенез, генная инженерия). Пока преимущественным направлением в селекции бактерий остается поиск и отбор активных природных штаммов из почвы, больных насекомых, зараженных тканей и органов растений. Критериями отбора являются: стабильная однородность популяции, высокая степень продуцирования спор и биологически активных веществ (БАВ), вирулентность и спектр патогенности для целевого объекта. Результатом такого отбора является штамм, превосходящий по качеству эталонные культуры продуцента препарата, необходимого для производства. Выделение бактерий в чистую культуру - необходимый этап после их извлечения из природных источников. В первую очередь для биотехнологии нужны активные исходные штаммы, а это требует селекции микроорганизмов. Критериями отбора новых штаммов являются: технологичность (однородность популяции, высокая степень продуцирования активного начала и т.д.), вирулентность и спектр действия. Если в течение многочисленных циклов культивирования свойства биологического агента не сохраняются или претерпевают существенные изменения, то данный биологический агент неприемлем и не может быть рекомендован для крупномасштабных технологических разработок. Результатом отбора должен быть штамм, превосходящий по качеству эталонные культуры существующего продуцента необходимого препарата. Важная роль принадлежит специализированным банкам биологических агентов (коллекции микроорганизмов). Коллекции культур обеспечивают сохранение жизнеспособности и генетических свойств штаммов. В России такие коллекции есть при Государственном научно-исследовательском институте генетики и селекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ), при Институте биохимии и физиологии микроорганизмов имени Г. К. Скрябина (ВКМ), а также в некоторых других научных учреждениях.
С селекцией связана проблема хранения штамма. Культуры микроорганизмов хранят на среде из свежезастывшего агара под вазелиновым маслом [Cираева и др., 2010] или без него; в лиофилизированном состоянии, в стерилизованной почве [Похиленко и др., 2009]. При хранении в пробирках на агаризованных питательных средах стабильность штамма обеспечивается при пересевах каждые 3-4 месяца. Поддержание чистой культуры штамма-продуцента является главной задачей любого микробиологического производства, поскольку высокоактивный, не претерпевший нежелательных изменений штамм может служить гарантией получения целевого продукта с заданными свойствами. Из отселектированных штаммов готовят маточную культуру, из нее – посевную, предназначенную для посева в ферментеры. Посевную культуру выращивают глубинным способом в небольшом посевном ферментере или в колбах на качалках [Патент 2128915, 1999; Патент 2295562, 2007; Гришечкина, Ермолова, 2015]. При получении посевного материала принципиально важным является способ выведения пропагул хранящейся маточной культуры из анабиоза, состав среды и режим культивирования. Мониторинг процессов в главном ферментере проводят по нескольким параметрам: температуре, рН, количеству растворенного кислорода и другим [Сouch, 2000]. Выбирают оптимальные сроки культивирования, показатели рН и температуры для выращивания бактерий рода Bacillus [Асатурова, 2009; Гришечкина, Ермолова, 2015]. Следует отметить, что в ряде случаев технологичность перспективных штаммов связана с их фагоустойчивостью [Романовская и др., 2007].
Качество питательной среды – одно из важнейших условий получения высокоактивных препаратов. При конструировании питательной среды необходимо учитывать физиологические потребности микробной культуры в элементах азотистого, углеводного и минерального питания. Принимают в расчет протеолитическую способность культуры. Если активность микробных протеаз невысока, следует брать низкомолекулярные белки, а лучше расщепленные белковые соединения. Например, для экзотоксинсодержащего штамма B. thuringiensis var. darmstadiensis (BtH 10) № 25, обладающего энтомоцидной и антифунгальной активностью, наилучшие показатели были получены на среде с гороховой мукой, заменяющей соевую. При росте на этой среде титр спор в культуральной жидкости 4х109/мл, активность экзотоксина (ЛК50) для тест-объекта составила 3,1 мкл/г корма, ингибирующая активность для Fusarium oxysporum 70,0 %, для B. cinerea 75,0 % [Патент 2514023, 2014].
Заключительным этапом производства биопрепаратов является получение приемлемой препаративной формы. Препаративная форма тесно связана с технологией применения биопрепаратов и со сроком их хранения. Проблема стабильности микробиологических препаратов актуальна, например, из-за необходимости накопления резервных запасов биопрепаратов. К концу приготовления препаративной формы должна сохраняться биологическая активность биологического продукта. Особенно это касается сухих форм, где часто требуется использование высокой температуры для высушивания биомассы. При использовании псевдоожиженных систем на входе температура колеблется от 180 до 215оС, на выходе 70-80оС [Couch, 2000]. Сухие формы представлены, как правило, смачивающимися порошками и диспергируемыми гранулами, а жидкие – водными концентрированными суспензиями и масляными эмульсиями [Штерншис и др., 2006]. В жидкие водные формы и смачивающиеся порошки вводят различные защитные ингредиенты.
Предложена концепция защиты активности биопрепаратов при хранении [Штерншис, 1995]. Суть ее в том, что в процессе хранения происходит взаимодействие кислорода воздуха с компонентами поверхностных макромолекул. Взаимодействие биологических систем с кислородом наиболее полно описывается через механизм свободно радикального окисления макромолекул. Так, для бактериальных препаратов поверхность спор и кристаллов представляют белки и полисахариды. Поэтому механизм их взаимодействия с кислородом подчиняется основным законам свободно-радикального процесса, идущего через образование осколков молекул - свободных радикалов. Характерной чертой такого процесса является возможность управлять им с помощью инициаторов или ингибиторов свободных радикалов [Хекли, 1979]. Накопление свободных радикалов влияет на жизнедеятельность микроорганизмов. В связи с этим было показано, что снижение активности бактериальных препаратов объясняется образованием свободных радикалов. Этот процесс тормозится при введении антиоксидантов в малых концентрациях. В реальных условиях хранения препараты, смешанные с антиоксидантами, значительно меньше снижали свою активность, чем контрольные [Штерншис, 1995].
Защитный экранирующий эффект на микроорганизмы оказывают также активированный уголь, окись титана, яичный альбумин и т.д. В этих целях при получении бактериальных препаратов перспективно также микроинкапсулирование [Ma et al., 2015]. Инкапсулированные препараты очень устойчивы к облучению. Кроме того, значительно увеличивается удерживаемость препарата на поверхности растения за счет адгезионных свойств оболочки. Современные разработчики биопрепаратов учитывают необходимость оптимизации препаративной формы, что недооценивалось на первых этапах развития биотехнологии. Так, предложена иммобилизованная форма. Клетки, иммобилизованные на или в массе носителя, менее подвержены воздействию света, температурным колебаниям и другим абиотическим и биотическим факторам. Это обеспечивает более длительные сроки хранения биопрепаратов. Например, проведено исследование антифунгальной активности в процессе хранения биопрепарата на основе штамма B. subtilis BZR 336g, иммобилизованного на гранулированном минеральном удобрении с определением численности адсорбированных бактериальных клеток в процессе хранения [Асатурова, Козицын, 2015]. Авторы пришли к выводу, что лучшими условиями сохранения численности адсорбированных клеток на поверхности гранул минерального удобрения «ОМУ» при высушивании является способ перемешивания гранул при температуре +60С в орбитальном шейкере.
Особое внимание уделяется стандартизации готового продукта. Основные показатели стандартизации зависят как от активности исходного штамма, так и от препаративной формы биопестицидов [Kabaluk et al., 2010]. Стандартизация биопрепаратов проводится по числу спор, включений, метаболитов и по биологической активности. Последний показатель более значим. При этом надо иметь в виду, что биологическая активность биопрепаратов отличается от активности штаммов-продуцентов, поскольку в препаративные формы включены различные ингредиенты. Стандартизации подлежат все препараты на основе бактерий независимо от способов их производства.
Количество жизнеспособных спор в 1г препарата определяют методом посева на питательные среды с подсчетом выросших колоний. Для посева используют разведение препарата, обеспечивающее рост не более 300 и не менее 50 колоний в одной чашке Петри. Разведение определяют делением предполагаемого титра на 300 и 50. Выросшие колонии подсчитывают при открытой чашке Петри и определяют титр препарата [Штерншис и др., 2006].
Титр препарата определяют по формуле:
13 EMBED Equation.3 1415, где
N – среднеарифметическое число колоний из двух серий параллельных разведений;
n – максимальное разведение.
Общее количество спор или клеток можно подсчитать и более простым методом в камере Горяева. Камера предназначена для подсчета количества клеток в заданном объёме жидкости. Она представляет собой предметное стекло с бороздами и нанесённой микроскопической сеткой. Размеры малых делений клетки сетки составляют 0,05 мм, а больших  0,2 мм. При этом сетка нанесена на площадку (участок стекла), расположенный на 0,1 мм ниже, чем две соседние площадки. Эти площадки служат для притирания покровного стекла. Успешное притирание характеризуется появлением радужных колец (колец Ньютона). В результате объем жидкости над квадратом, образованным большими делениями сетки Горяева, составляет 0,004 микролитра. Подсчитав количество клеток над большим квадратом, определяют плотность спор в суспензии по формуле [Гулий и др., 1982]. Недостаток этого метода состоит в том, что подсчитывается общее количество спор, в том числе нежизнеспособных.
В стандартизации и оценке качества биопрепарата главным показателем является его биологическая активность [McGuere et al., 1997]. Биологическая активность измеряется реакцией тест-объекта на действие биопестицида. Тест-объекты – возбудители болезней растений, насекомые либо клещи. Для более точной оценки биологической активности препаратов с целью сравнения используются стандарты, т.е. образцы микроорганизма- продуцента или биопрепарата, отвечающие всем необходимым условиям и требованиям.
Существующие требования к стандартам: 1) идентичность механизма действия, 2) неизменность физико-химических свойств, 3) неизменность содержания БАВ, 4) неизменность биологической активности, 5) однородность состава, 6) срок хранения 5-10 лет при 5(С, 7) стандарт изготавливается для одной или нескольких стран. Обычно производители препаратов используют внутренний стандарт, который должен периодически калиброваться с международным [Штерншис и др., 2006]. Для энтомопатогенных препаратов необходимыми требованиями к тест- объектам являются: 1) тест - объекты не должны быть карантинными вредителями; 2) должны легко разводиться в лабораториях и 3) регулярно восполняться при сборах в природе. Для биопрепаратов, предназначенных для подавления болезней растений, выбирают возбудителя болезни растений, легко выделяемого из природы, с одной стороны, и способного хорошо расти на ПС в лабораторных условиях, с другой стороны.
При использовании стандартов биологическая активность испытуемого препарата (Е) подсчитывается делением ЛК 50 стандарта на
ЛК 50 образца, где ЛК 50 - средняя концентрация суспензии, вызывающая гибель 50% целевых организмов.
Стандартизация биопрепаратов включает дополнительно определение таких характеристик, как смачиваемость, стабильность рабочей суспензии, адгезионная способность и срок хранения. Для определения стабильности рабочей суспензии предложена методика, основанная на определении оптической плотности суспензии бактериального препарата при 400 нм. При этой длине волны величина оптической плотности пропорциональна концентрации препарата [Штерншис, 1985]. Стабильность суспензии вычислялась в процентах, исходя из измерений оптической плотности надосадочной жидкости через 30 мин и 4 часа после приготовления рабочей суспензии. Для определения адгезионной способности 1 мл 1%-й суспензии препарата распределяли на дно стеклянной чашки Петри, подсушивали, а затем заливали 1 мл стерильной воды. Через 2 часа отбирали пробы для оценки количества КОЕ в 1 мл. Вычисляли процент биологического агента, который удерживался на стекле.
Для определения срока хранения образцы биопрепаратов помещают в боксы с разными температурными режимами. Как правило, образцы хранят при комнатной температуре, при +5є и -20є, хотя можно использовать и промежуточные интервалы. Ежемесячно в течение первого года, затем через 1,5, 2 и 3 года отбирают пробы и оценивают их титр и биологическую активность. Как правило, жидкие препаративные формы хранятся меньше [Штерншис, 1995; Сираева и др., 2010].

2.2. Создание биопрепаратов для подавления болезней растений
Бактерии рода Bacillus Cohn. широко используются в медицинской и ветеринарной биотехнологии в качестве продуцентов биологически активных веществ, ферментов, антибиотиков, а также, являясь пробиотическими микоорганизмами, входят в состав лекарственных средств и биологически активных добавок для человека и животных [Азизбекян, 2013].
Ранее применение бактерий рода Bacillus в биологической защите растений было ограничено, в основном, одним видом – B. thuringiensis, варианты которого послужили действующим началом применяемых в настоящее время эффективных биоинсектицидов. Однако многолетнее изучение свойств бактерий рода Bacillus позволило рассматривать их в качестве перспективных агентов биологического контроля болезней растений.
Наиболее известным и часто включаемым в состав биофунгицидов является Bacillus subtilis. Бактерии B. subtilis относятся к грамположительным факультативно аэробным палочковидным бактериям. Клетки палочковидные, эндоспоры овальные, расположены центрально или парацентрально, не раздувают клетку при спорообразовании. Длина клетки - (2-3) мкм, ширина - (0,7-0,8) мкм. Капсулу не образуют. По Грамму окрашиваются положительно. Штаммы являются олигофильными, размножаются при 25 – 45°С, оптимальный рост наблюдается при температуре 33 – 37 °С. рН среды: минимальная 5,7; максимальная 8,0; оптимальная 7,0 - 7,2. Не растут в анаэробных условиях, не образуют ацетилметилкарбинол из глюкозы в реакции Фогес - Проскауэра, ферментируют с образованием кислоты глюкозу, маннозу, фруктозу, рибозу, ликсозу, целлобиозу, трегалозу, мальтозу, туранозу. Гидролизуют крахмал, мочевину и эскулин. Обладают лецитиназной, каталазной активностью. Толерантны к концентрациям хлорида натрия в питательной среде в диапазоне 1 – 9 % [Смирнов и др., 1982].
Бактерии B. subtilis являются продуцентами широкого спектра ферментов: протеаз [Холодная, 1999], липазы, амилазы [Патент РФ 2298032, 2007], ксиланазы [Патент РФ 2509149, 2014], эндонуклеазы (рестриктазы) [Патент РФ 2270859, 2006] и других [Широков, 2004]. Другие продукты, синтезируемые бактериями рода Bacillus, - биологически активные вещества различного состава и происхождения, коферменты, аминокислоты, полипептиды, бактериоцины оказывают антагонистическое влияние на патогенные микроорганизмы, в том числе на фитопатогены, и позволяют использовать данный вид бактерий в качестве основы для биофунгицидов. Поскольку факторы, определяющие будущую эффективность биопрепарата на основе бактерий Bacillus, весьма обширны и до сих пор до конца не изучены, наиболее распространенным способом поиска антагонистически активных штаммов является их выделение из объектов окружающей среды, чаще всего, природных экологических ниш: почвы, воды, растительных остатков, ризосферы растений, с последующим отбором перспективных вариантов по критерию антагонизма к фитопатогенам [Патент РФ 2289621, 2006; Патент РФ 2295562, 2007; Патент РФ 2314693, 2008; Патент РФ 2444366, 2012].
Выделенные в чистую культуру штаммы подвергают дальнейшему изучению [Нетрусов и др., 2005]. Основными критериями будущей пригодности их в качестве действующего начала биофунгицида являются: наличие антагонистической активности к широкому спектру фитопатогенов, технологичность промышленной наработки, способность расти на питательных средах различного состава, давая при этом максимальный выход биомассы, и стабильность свойств, при длительном хранении. Кроме того, штаммы, которые предполагается использовать в промышленной биотехнологии, не должны обладать токсическим воздействием на биологические объекты, в том числе культурные растения, членистоногих, теплокровных. Некоторые авторы практикуют более широкий подход к выбору штамма, который включает, помимо перечисленного выше, изучение ферментативной активности, симбиоза с почвенной микрофлорой, совместимость с наиболее применяемыми химическими пестицидами и агрохимикатами с целью возможности дальнейшего использования в баковых смесях с ними [Патент РФ 2478290, 2013]. Тем не менее, первым критерием оценки является спектр антагонистической активности выделенных изолятов, которую проверяют классическим методом отсроченного антагонизма [Егоров, 2004] либо методом агаровых блоков на средах Чапека, Гаузе, картофельно-глюкозном агаре [Билай, 1982].
Спорообразующие бактерии рода Bacillus обладают широчайшими возможностями в плане подавления возбудителей болезней растений. Так, авторы, занимавшиеся селекцией, отмечали наличие антагонизма к следующим фитопатогенным грибам: Alternaria alternata (Fr.) Keissl., A. solani Sorauer, A. brassicae (Berk.) Sacc., A. tenius Samuel Paul Wiltshire, Aspergillus niger [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]) [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ]

B. subtilis 128
26,5±2,2
16,7±1,8
16,2±1,3
16,4±1,3
22,1±2,5

Bacillus spp. KR-083
36,1±2,8
30,7±1,7
34,0±4,4
23,7±1,7
28,1±2,9


Из данных, приведенных в таблице 2.2, видно, что штамм бактерий Bacillus spp. KR-083 обладает также и большей антагонистической активностью по отношению к фитопатогенным грибам по сравнению с прототипом - продуцентом биопрепарата фитоспорин.
Обычно, для выделения бактерий рода Bacillus используют метод прямого посева суспензии исходного материала (например, почвы) на питательные среды общего назначения (мясо-пептонный агар, агар Хоттингера и пр.) [Меджидов, 2003; Поляк и др. 2008; Поляк, 2005, 2006].
Поскольку особенностью данного рода бактерий является образование спор в неблагоприятных условиях, суспензию подвергают нагреву до температуры 80°С в течение 10 – 15 минут, что позволяет избавиться от лишней вегетативной микрофлоры. Выделенный в чистую культуру штамм поддерживают на плотных питательных средах различного состава (агаризованная среда NBY, плотная среда Эшби, мясо-пептонный агар) в пробирках на скошенном агаре. Для длительного хранения обычно используют лиофилизацию [Патент РФ 2289621, 2006; Патент РФ 2528058, 2014].
Когда все этапы выделения и идентификации штаммов для будущего биофунгифида пройдены, приступают непосредственно к наработке бактериальной биомассы. Чаще всего для этой операции применяют жидкие питательные среды. Технологический процесс получения готового биопрепарата складывается из нескольких этапов: получение клонов антагонистически активных вариантов штамма, выращивание их на плотных питательных средах, с которых производится засев маточных посевных колб. Маточные культуры в колбах дают начало следующему этапу производства – наработке биопрепарата в промышленном масштабе в ферментере или специальных сосудах для культивирования. Завершающей стадией процесса становится стандартизация полученной биомассы по титру спор и оценка ее на предмет микробиологической чистоты и антагонистической активности в отношении фитопатогенов [Патент РФ 2298032, 2007].
При выборе оптимальных питательных сред для масштабной наработки бактериальной биомассы авторы руководствовались физиолого-биохимическими особенностями спорообразующих бактерий рода Bacillus с целью обеспечения их всеми необходимыми для роста веществами. Известно, что споровые бациллы являются в большинстве своем мезофилами (исключение составляет термофильный вид Bacillus stearothermophilus, растущий при 65°С и выше), их рост возможен в интервале 15-35 °С, оптимальная для роста и спорообразования температура (35±1) °С. Бактерии рода Bacillus являются аэробами, поэтому при глубинной ферментации на жидкой питательной среде нуждаются в аэрации и перемешивании. Был предложен способ выращивания бактерий рода Bacillus на доступной по составу среде с целью получения биопрепарата для предпосевной обработки семян [Патент РФ 2140138, 1999]. Питательная среда содержала (в %): отруби пшеничные – 4,0; мел – 0,3. Культуру бактерий нарабатывали в условиях аэрации на качалке или в ферментере при температуре 30+1oC в течение 24-36 часов, при этом авторам удавалось получить титр порядка 107 клеток/мл. Готовый биофунгицид получали путем смешивания 50 мл культуральной жидкости и наполнителей: стерильного мела – 107 г, эмульсия ПВА – 50 мл, вода – 50 мл. При этом   природный мел использовался авторами в связи со способностью штамма к его активной колонизации, а эмульсия ПВА служила прилипателем.
Диапазон кислотности питательной среды составляет обычно 5,5 - 8,0, однако оптимальным для роста и спорообразования бацилл является рН 6,8 - 7,2. В качестве источников углеводов бактерии этого рода используют глюкозу, сахарозу, мальтозу, лактозу, арабинозу. Общеупотребительными источниками углерода и азота с повышенной питательной ценностью являются продукты специальной обработки тканей и органов животных: мясная вода, пептоны, казеин, дрожжевой автолизат и гидролизат. Все среды, используемые для культивирования в промышленных масштабах, можно разделить на: натуральные, полусинтетические и синтетические [Поляк и др., 2008]. Примером полусинтетической среды может служить предложенная среда следующего состава (компоненты указаны в %): меласса - 0,5; К 2HPO4 - 0,03; MgSO4 - 0,01; NaCl - 0,05; KNO3 - 0,1; СаСО3 - 1,0 [Патент РФ 2289621, 2006]. Другими авторами [Патент РФ 2482174, 2013] была предложена трехкомпонентная среда из доступных ингредиентов (указаны в %): пептон мясной ферментативный – 1,0; дрожжевой экстракт – 0,5; натрия хлорид – 0,5. Чаще используют полусинтетические среды. Вне зависимости от состава и происхождения (заводские готовые среды или среды, сделанные из отдельных компонентов непосредственно на производстве), для успешного культивирования и получения стабильно высокого выхода биомассы требуется контроль качественных параметров сред. В качестве показателей качества используют, главным образом, прозрачность и цветность среды, рН, содержание аминного азота (именно эта форма азота наиболее легко усваивается бактериями), стерильность, скорость роста.
Конечная препаративная форма биофунгицида может ограничиваться культуральной жидкостью, содержащей споровую биомассу, без внесения каких-либо добавок. Однако, такая форма имеет рад недостатков, самым существенным из которых является необходимость хранения при пониженных температурах (4 – 10 °С) с целью недопущения прорастания спор и потери титра и биологической активности. Более удобными с точки зрения хранения являются сухие и пастообразные формы биопрепаратов на основе бактерий рода Bacillus. Получение их достигается иммобилизацией жидкой биомассы на различных носителях. Так, было предложено [Патент РФ 2314693, 2008] для увеличения срока жизнеспособности микроорганизмов и придания препарату формы пасты в смесь культуральных жидкостей вносить каолин в количестве 20 - 30 % от общего состава препарата и соевую муку в количестве 20 - 30 %. А в качестве отдушки и источника микроэлементов и витаминов в полученный состав дополнительно предложили добавлять гидролизат смеси хвойного экстракта и хлорофилло-каротиновой пасты в концентрации 2,3 - 4,0 %. Другие авторы [Патент РФ 2444366, 2012] предложили высушивать споровую биомассу на сахарно-крахмальной смеси, при этом массовая доля наполнителя составляла 1 – 10 %. После получения биомассы в сухом виде (порошок) авторы смешивали ее со вспомогательными веществами в соотношении 2:1 - 3:1 и таблетировали. В качестве вспомогательных веществ использовали (массовая доля указана в %): стеарат кальция (0,5 - 1,0), тальк (2,5 - 3,0) и (или) крахмал (0,5 - 1,0) и (или) аэросил (0,5 - 0,8), глюкозу (5,0 - 20,0), сухое молоко (10,0 - 30,0) и (или) метилцеллюлозу (или поливинилпирролидон) (0,1 - 0,5). Таким образом, получали таблетированную препаративную форму, удобную в использовании с точки зрения хранения и дозирования.
Для иммобилизации культуральной жидкости бактерий B. amyloliquefaciens B-11475 был выбран мелкодисперсный диатомит, который является натуральной осадочной горной породой, состоящей преимущественно из останков диатомовых водорослей [Патент РФ 2528058, 2014]. Природный диатомит - обычно рыхлая или слабо сцементированная, светло-серого с желтоватым или розоватым оттенком порода. Химически диатомит более чем на 80% состоит из водного кремнезема. Легко стерилизуется (выдерживает температуру до 1400 °C), представляет собой легкие пористые мельчайшие гранулы с размером частиц по фракциям - от 0.1 до 10.0 мм; эффективный диаметр пор - 50-100 нм, с насыпной плотностью не более 620 кг/м3. Является инертным материалом, не вступающим во взаимодействие с большинством агрессивных сред. Диатомит - природный материал, обладающий необходимыми потребительскими свойствами для создания биопрепарата: стерилен, химически инертен, легкий, сыпучий, не слеживается, негорючий, биологически стойкий и экологически чистый, не подвержен процессам гниения, воздухо- и водопроницаем, обладает высокими адсорбционными свойствами и может впитывать до 120 % воды по массе. Благодаря высокопористой микроструктуре гранулы диатомита сберегают и продлевают действие вносимого биофунгицида не только при обработке зерна, но способны при внесении в почву предотвращать заражение зерновых культур в процессе всего вегетативного роста. Преимуществом такого препарата является то, что он хорошо хранится, удобен для транспортировки, дает стабильный объем, не слеживается, а фунгицидные свойства проявляет как при обработке семян зерновых растений, так и в почве в процессе вегетативного роста.
После первого зарегистрированного в России препарата бактофит (ГНЦ прикладной микробиологии – пос. Оболенск, Московской обл. и ПО «Сиббиофарм») появились фитоспорин (Башкортостан), алирин-Б и гамаир (ВИЗР), и другие биопрепараты, зарегистрированные или находящиеся в стадии испытаний.
Препарат бактофит, выпускаемый в виде суспензионного концентрата и смачивающегося порошка, в качестве действующего начала содержит штамм B. subtilis ИПМ 215 в количестве не менее 2 млрд/мл (г). Применяется на зерновых и овощных культурах против корневых гнилей, винограде против оидиума, а также против бактериоза капусты.
Фитоспорин-М, Ж. Содержит в качестве действующего начала бактерии B. subtilis, штамм 26 Д с титром не менее 1 млрд живых клеток и спор/мл. Применяется на зерновых культурах (яровая и озимая пшеницы) против корневых гнилей, в том числе фузариозной и гельминтоспориозной, мучнистой росы, бурой ржавчины; на овощных культурах открытого и защищенного грунта против корневых гнилей, альтернариоза, фитофтороза, ризоктониоза, мучнистой росы; для защиты фруктов, овощей, корне- и клубнеплодов при хранении; на плодово-ягодных культурах (яблоня, земляника) против парши, мучнистой росы, корневых гнилей [Менликиев и др., 1991]. Такой же спектр применения имеют препараты фитоспорин-М, ПС и фитоспорин-М, П, отличающиеся от выше указанного препаративной формой (порошок) и количественным содержанием действующего начала (не менее 100 млн живых клеток и спор/г и не менее 1 млрд живых клеток и спор/г соответственно).
Другим фунгицидом на основе спорообразующих бацилл является препарат алирин-Б, содержащий бактерии B. subtilis штамм В-10 ВИЗР. Выпускается в нескольких препаративных формах: таблетки с титром не менее 109 КОЕ/г; смачивающийся порошок с титром не менее 1011 КОЕ/г; жидкость с титром не менее 109 КОЕ/г. Алирин-Б применяют для защиты от корневых гнилей на рассаде, овощных культурах открытого и защищенного грунта; фитофторозом, ризоктониозом, альтернариозом, мучнистой росой, серой гнилью картофеля, огурцов и томатов.
Аналогичным спектром применения обладают препарат гамаир, действующим началом которого является B. subtilis, штамм М-22 ВИЗР.
Препарат витаплан, смачивающийся порошок, содержит два штамма с титром не менее 10 млрд. спор в грамме: В. subtilis ВКМ В-2604D и В. subtilis ВКМ В-2605 D. Производитель рекомендует применять препарат для протравливания семян и предпосевной обработки клубней, а также опрыскивания в период вегетации для подавления развития возбудителей грибных и бактериальных заболеваний озимой и яровой пшеницы, рапса, сои, картофеля, овощных культур и плодово-ягодных культур.
Представляет интерес разработка препаратов на основе энтомопатогенной бактерии, способных контролировать численность возбудителей болезней [Гришечкина и др., 2002; Смирнов, Гришечкина, 2010; Гришечкина, Лошакова, 2013], что будет подробнее обсуждено в следующей главе. Среди биофунгицидов, находящихся в стадии испытаний, следует отметить препарат фитоп 8.67, разработанный ООО НПФ «Исследовательский центр» в наукограде Кольцово. В его состав входят штаммы B. subtilis и B. amyloliquefaciens, антагонистически активные в отношении широкого спектра фитопатогенов грибной и бактериальной этиологии. Многолетние испытания данного биофунгицида [Коробов и др., 2014; Коробов и др., 2015] показали его эффективность в защите от корневых гнилей яровой пшеницы, при этом наблюдалось снижение развития болезни в 1,8 – 3,9 раза, а распространенность болезни снижалась в 1,1 – 3,7 раза относительно контроля. Данный биофунгицид также был успешно испытан на садовой землянике [Беляев и др., 2012, 2015].
Среди производителей импортных аналогов на первом месте стоит Bayer Crop Science – дочерняя фирма немецкой компании Bayer AG – один из крупнейших мировых поставщиков биологических фунгицидов, в состав которых входят бактерии рода Bacillus [Crop Science United States: [Электронныйресурс]. Линейка препаратов включает несколько позиций. Препарат серенада Опти (SerenadeOpti), действующим началом которого является штамм B. subtilis QST 713, по информации производителя, ингибирует прорастание спор фитопатогенов, нарушает целостность мембран инфекционной гифы и не дает ей проникнуть в растение. Препарат совместим с микроэлементами, инсектицидами и другими фунгицидами. Применяется на винограде, землянике, картофеле, семечковых культурах и орехе для борьбы с серой и белой гнилями, бактериозами, вызываемыми р. XanthomonasDowson и р. Erwinia Winslow et al. Серенада Соил (Serenade Soil) содержит штамм B. subtilis QST 713 и эффективно подавляет таких почвенных патогенов, как Pythium [ Cкачайте файл, чтобы посмотреть ссылку ], Rhizoctonia D.C., Fusarium Link, а также некоторые штаммы Phytophthora. Обозначенный штамм действует в ризосфере, обладает как прямым антагонизмом к фитопатогенам, так и активизирует иммунитет растений и их устойчивость к стрессам, обладает ростостимулирующим действием. Серенада Соил рекомендован для применения на томатах, огурцах, картофеле, землянике, цитрусовых культурах и луке.
Соната - еще один препарат из линейки биофунгицидов в состав которого входит штамм Bacillus pumilus QST 2808, эффективен для борьбы с ложной и настоящей мучнистой росой и ржавчиной семечковых культур, винограда и томатов.

2.3. Разработка энтомопатогенных бактериальных препаратов
Наибольшее распространение во всем мире получили препараты на основе B. thuringiensis. По составу действующих агентов их можно разделить на 3 группы. В первую входят препараты, содержащие споры и кристаллы эндотоксина бактерий в качестве действующего начала. Это наиболее многочисленная группа. Ко второй группе относятся препараты, содержащие дополнительно к спорам и кристаллам термостабильный
·–экзотоксин. Наконец, бактериальные препараты могут содержать только очищенные токсины, вырабатываемые бактерией B. thuringiensis. Как правило, для получения бактериальных энтомопатогенных препаратов используют культивирование исходных штаммов в жидкой питательной среде – глубинный способ.
Штаммы энтомопатогенных бактерий подвержены изменчивости, что проявляется в форме и размерах микробных клеток, интенсивности продуцирования вторичных метаболитов, таких как ферменты или токсины, чувствительности к фагам и т.д. Для разработки биопрепаратов, как правило, используются штаммы энтомопатогенов, выделенных из природы, хотя предложены и рекомбинантные штаммы как продуценты препаратов. В данной работе обсуждение будет касаться только природных штаммов энтомопатогенов. Роль селекции штаммов B. thuringiensis в создании бактериальных биопрепаратов хорошо известна. В ряде работ авторы связывали вирулентность с формой и размерами кристаллов эндотоксина, однако это не подтвердилось большинством исследований [Бурцева и др., 2001]. При отборе наиболее пригодных для создания биопрепаратов штаммов B. thuringiensis. уже на первых этапах учитывали явление спонтанной изменчивости [Барайщук, Покровская, 1985]. Изменение морфологии колоний B. thuringiensis связано с изменением вирулентности. Так, шероховатые формы колоний подвида galleriae были более вирулентными для тест-объекта, чем гладкие [Гулий и др., 1982]. Для повышения активности природного штамма B. thuringiensis subsp. kurstaki Z-2 проведена селекционная работа с использованием мутагенов, что привело к получению штамма Z-52, образующего как бипирамидальные, так и кубоидальные кристаллы эндотоксина. Этот штамм с повышенной активностью и стал основой распространенного российского препарата лепидоцид [Зурабова, 1986]. Cелекционные критерии разработаны и для отбора перспективных штаммов B. thuringiensis subsp. darmstadiensis [Смирнов, 2000]. Штамм этого подвида BtH10 №25 как основа препарата бацикол растет на дрожжеполисахаридных средах на основе соевой муки, кукурузного крахмала, кормовых дрожжей [Патент 2514023, 2014]. Штамм хранится на скошенном рыбном агаре в пробирках при 4-5°С с периодическим пересевом 1 раз в 6 месяцев, в лиофилизированном состоянии в запаянных ампулах и методом криоконсервирования в Ведомственной коллекции полезных микроорганизмов сельскохозяйственного назначения Россельхозакадемии (RCAM).
Из отселектированных штаммов энтомопатогенных бацилл готовят маточную, затем посевную культуру, которую используют для инокуляции жидкой питательной среды в основном ферментере. При соблюдении оптимальных условий споры и кристаллы образуются через 18 ч. При лизисе клеток до 80% снижают рН и температуру, что приводит к полному лизису клеток и освобождению спор и кристаллов. Для глубинного культивирования B. thuringiensis. в заводских условиях предложено использовать две среды: кукурузно-глюкозную и дрожжеполисахаридную [Фрейман и др., 1981]. Усовершенствование сред позволяет увеличить выход бактериальных биопрепаратов [Чиликин и др., 1989]. Серьезным осложнением при культивировании B. thuringiensis. может служить фаголизис микробной культуры. В частности, фаголизис явился причиной снятия с производства одного из первых отечественных препаратов – энтобактерина и перехода на производство препаратов на основе B. thuringiensis. других подвидов. Впоследствии были найдены достаточно простые способы предотвращения фаголизиса культуры B. thuringiensis.ssp. galleriae. Например, этого добивались путем добавления хитозана в питательную среду [Кочкина и др., 1996].
Культуральную жидкость, содержащую споры и кристаллы, центрифугируют (сепарируют), осажденную биомассу как основу препарата высушивают. Стадия высушивания исключается, если требуется жидкая препаративная форма. При отсутствии стадии сушки сокращается расход энергоносителей и соответственно происходит снижение себестоимости продукта на 20-25% Так, для получения лепидоцида СК (жидкая форма) используют культивирование В. thuringiensis subsp. kurstaki на питательной среде, содержащей в качестве источника углерода муку зерновых культур, источника аминного азота - дрожжи кормовые, муку бобовых культур предварительно обработанные кавитационно-вихревым диспергатором в течение 60 минут при 50-60° С и гидромодуле 1:5. Культуральную жидкость подвергают процессу фильтрования или центрифугирования, добавляют глицерин, парафин нефтяной жидкий, неонол (антиоксидант), отдушку хвойную [Патент РФ 2314691, 2008].
Эффективность бактериальных инсектицидов в отношении фитофагов тесно связана с оптимизацией их препаративной формы. Для создания оптимальной препаративной формы необходимо решить ряд проблем, обеспечивающих: 1) стабильность препарата при хранении и применении, включая защиту от УФО и 2) активирование микроорганизма – продуцента препарата.
На первых этапах разработки биопрепаратов основное внимание уделялось выделению активных штаммов микроорганизмов. Поэтому исходные штаммы - продуценты отечественных препаратов не уступали по всем показателям продуцентам зарубежных препаратов. Что касается препаративных форм бактериальных препаратов, то при их разработке вначале были механически перенесены принципы создания препаративных форм химических инсектицидов. Так, используемый издавна наполнитель каолин стали добавлять в бактериальные препараты. Не была учтена принципиальная разница между химическими и микробными инсектицидами. Отличие состоит в том, что препаративная форма микробного биопестицида должна обеспечивать оптимальные условия для проявления действия микроорганизма как регулятора численности фитофагов, а также для его защиты от вредного влияния факторов внешней среды. Приготовление препаративной формы является важным завершающим этапом в производстве энтомопатогенных препаратов. К концу приготовления препаративной формы должна сохраняться инсектицидная активность. Введение различных добавок при создании бактериальных инсектицидных препаратов позволяет повысить биологическую активность и сохранность инсектицидного препарата. Для повышения эффективности инсектицидных препаратов в их состав включают активаторы, антиоксиданты, прилипатели и другие вещества, способствующие повышению физической и биологической стабильности препарата, улучшению контакта растения с препаратом. Так, для увеличения инсектицидной активности бактериальных препаратов предложено добавлять к спорово-кристаллическому комплексу активаторы, усиливающие действие эндотоксина как разобщителя окислительного фосфорилированияи дыхания. Выявленное действие дельта-эндотоксина как разобщителя процессов окислительного фосфорилирования и дыхания с активированием фермента АТФазы послужило основой для выбора некоторых солей для усиления действия эндотоксина [Штерншис, Каменек, 1986]. Было показано, что при включении сернокислого магния или сернокислой меди в бактериальный энтомопатогенный препарат при его производстве, инсектицидная активность при применении повышается [А.с. 1510813, 1989].
Проблема стабильности бактериальных препаратов при хранении актуальна из-за необходимости накопления резервных запасов биопрепаратов. На начальных этапах создания отечественных биопрепаратов возникали проблемы в связи с малым сроком их хранения. Для первых бактериальных препаратов срок хранения не превышал года. Для разработки препаратов с увеличенным сроком хранения была привлечена концепция быстрой утраты активности биопрепаратами в процессе хранения за счет взаимодействия кислорода воздуха с компонентами поверхностных макромолекул. Исходя из этого, было предложено вводить в препаративные формы антиоксиданты не только для защиты от УФО, но и для пролонгирования срока хранения [Штерншис, 1995]. В реальных условиях хранения при разных температурных режимах препараты, смешанные с антиоксидантами, значительно меньше снижали свою активность, чем контрольные. Этот подход оказался перспективным в отношении бактериальных препаратов и в жидкой, и в порошкообразной формах.
В препаративные формы необходимо включать ингредиенты для повышения прилипаемости. Известно, что для предотвращения смыва биопрепаратов с поверхности растения-хозяина фитофага используют пленкообразующие полимеры (поливинилпирролидин, поливиниловый спирт и т.д.). Образуемые ими пленки могут защищать и от солнечного излучения. В качестве примера приведем создание препаративной формы B. thuringiensis - биоинсектицида с включением поливинилового спирта (ПВС) [А.с. 10501150, 1982]. После сепарирования культуральной жидкости к пасте, содержащей споры и кристаллы B.thuringiensis, добавляли ПВС из расчета 0,5% сухого ПВС к массе пасты. Предварительно порошок ПВС кипятили с водой до полного растворения, а после введения в пасту лиофилизировали и смешивали с хлористым натрием (1:1). Готовый продукт, содержащий 50% NaCl и 7% ПВС, обладал высокими показателями инсектицидной активности, адгезивных свойств и стабильности рабочей суспензии.
Важно создавать такую препаративную форму, в которой один ингредиент обладал бы сразу несколькими функциями. Естественно, что любой новый инградиент должен быть не токсичным как для патогена, так и для окружающей среды. В качестве примеров комплексного подхода приведем разработку жидкой формы и стабилизированного порошка бактериальных препаратов на основе разных подвидов B. thuringiensis патоварианта А. В жидкую препаративную форму, где наполнителем служил глицерин, нами предложено вводить антиоксиданты для защиты от УФО и продления срока хранения, а также ДМСО для увеличения инсектицидной активности. Глицерин выполнял функцию стабилизатора рабочей суспензии и прилипателя [Штерншис, 1995]. Такой препарат хранился при комнатной температуре в течение года.
Что касается сухой препаративной формы, то при ее усовершенствовании в качестве стандарта использовали первую разработанную форму - лепидоцид концентрированный с титром 100 млрд спор в 1 г. В его состав помимо спорово–кристаллического комплекса входили остатки питательной среды и наполнитель – каолин. Эта препаративная форма не обеспечивала реализации потенциальной активности исходного штамма, так как отсутствовали ингредиенты, защищающие действующее начало биопрепарата от неблагоприятных факторов внешней среды или усиливающие его инсектицидную активность. Каолин как наполнитель препятствовал созданию стабильной рабочей суспензии, что приводило к забиванию опрыскивателей при применении препарата. В связи с этим нами разработана препаративная форма, которая включала максимально возможный набор ингредиентов-активаторов [Патент 1792281, 1993]. Новая препаративная форма (ЛЕСТ) отличалась тем, что каолин был полностью заменен на водорастворимый компонент, который одновременно усиливал инсектицидное действие дельта-эндотоксина Bt. Углекислый натрий добавляли в таком количестве, чтобы рН 5%-й водной суспензии препарата была на уровне 8,5-10,5. Кроме того, в качестве протекторов от ультрафиолетового излучения и кислородных радикалов введены антиоксиданты (0,1-1%), а в качестве прилипателя и стабилизатора рабочей суспензии – концентрат сульфитно–спиртовой барды (30-50%). Исключение каолина способствовало повышению стабильности рабочей суспензии препарата.
Препарат ЛЕСТ с титром 70 млрд спор в 1 г показал более высокую биологическую эффективность по сравнению с лепидоцидом концентрированным (100 млрд спор в 1 г). Например, для использования против непарного шелкопряда требовалось в 2 раза меньше препарата ЛЕСТ, чем лепидоцида концентрированного. Срок хранения ЛЕСТа также увеличивался в 2 раза (до 3 лет). Последующие усовершенствования привели к выпускаемым сейчас предприятием «Сиббиофарм» двух препаративных форм лепидоцида (СК и П).
Стандартизация бактериальных инсектицидов, как уже было отмечено выше, включает определение титра спор (колониеобразующих единиц – КОЕ) в 1 г или 1 мл препарата и оценку биологической активности. Помимо количественной оценки спор требуется определение количества эндо- и экзотоксинов, входящих в состав энтомопатогенных препаратов. Для определения содержания (-экзотоксина в битоксибациллине и других содержащих его препаратах используют методы хроматографии и спектрофотометрии [Бубенщикова и др., 1982; Данилова, Барбашова, 1985]. Спектрофотометрический метод, например, основан на способности нуклеотидов поглощать в области 260-290 мм. Для концентрирования и извлечения (-экзотоксина из битоксибациллина применяют осаждение его ионами кальция. Осажденный из препарата (-экзотоксин гидролизуют хлорной кислотой и гидролизат спектрофотометрируют. Определяют величину поглощения при 260, 270 и 290 нм. Для вычисления содержания экзотоксина используют формулу Спирина, предложенную для определения содержания фосфора в нуклеотидах. При этом разница значений оптической плотности при 260 и 270 нм не должна превышать 15% [А.с. 1338135, 1987]. Содержание (-эндотоксина в бактериальных препаратах измеряют по УФ-спектрам при 280 нм или иммуноферментным анализом [McGuere et al., 1997].
В стандартизации биопрепаратов важен правильный выбор тест-объектов. Для российских бактериальных инсектицидов обычным тест-объектом является непарный шелкопряд. Для этого используют природные яйцекладки насекомого. Собранные яйцекладки, выдержанные в холодильнике, освобождают от пушка легким трением в марлевом мешочке. Очищенные яйца, перенесенные в другой мешочек, стерилизуют погружением в 1%-й раствор марганцевокислого калия. Затем промывают водой, переносят на фильтровальную бумагу и высушивают. Для получения отродившихся гусениц яйца помещают в чашки Петри на круг стерильной фильтровальной бумаги с вырезанным сектором. Для создания необходимой влажности на место вырезанного сектора кладут ватный тампон, смоченный водой, не допуская, чтобы он касался фильтровальной бумаги, на которой лежат яйца. Чашки ставят в термостат и инкубируют при 22о С в течение нескольких суток, ежедневно просматривая до массового отрождения гусениц. Во время массового отрождения гусениц на внутреннюю сторону крышки чашки помещают корм из расчета 5 г на 0,7 г яиц. Гусениц, перешедших на корм в течение первых суток, отделяют от яиц, перенося крышку с гусеницами на чистое дно чашки Петри. Питающихся гусениц содержат без смены корма до первой линьки при температуре 22оС и освещения в течении 16 ч в сутки. По мере накопления экскрементов дно чашки меняют [Гулий и др., 1982]. При постановке биотестов гусениц младших возрастов содержат на искусственных питательных средах. Примером может служить среда, в составе которой есть предварительно замоченная и выдержанная фасоль, размельченная до однородной массы, дрожжи, сахароза, фолиевая кислота, льняное масло, метабен, растворенный в спирте, ионы калия и 40%-й формалин. Дальнейшие действия состоят в том, что расплавленный агар смешивают с фильтровальной бумагой и вносят в приготовленную выше смесь, добавляют аскорбиновую кислоту. После перемешивания полученная среда должна иметь рН 6,6-6,7.
Разработана методика биотестов на гусеницах лугового мотылька [Штерншис и др., 1990]. Луговой мотылек разводится на искусственной питательной среде следующего состава: пищевой агар, дрожжи пивные, люцерновая мука, аскорбиновая кислота, бензойная кислота, растительное масло.
Диапаузирующую фазу (коконы с пронимфой) хранят в термостате при 810(С в стеклянных стаканах или банках объемом 250-500 мл по 30-50 коконов. Бабочек лугового мотылька содержат в стеклянных сосудах емкостью 3 л, покрытых марлей, подкармливают 14%-м раствором меда. Бабочек рассаживают по 20 особей при соотношении самок к самцам 1,2:1. В садки вкладывают вертикальные бумажные «гармошки» для откладки на них самками яиц. Изоляторы с бабочками помещают в термостат с температурой 2426(С, относительной влажностью воздуха 60-75% и 16-часовым световым днем. Отложенные на бумаге и марлевой крышке кладки яиц ежедневно вырезают вместе с бумагой или марлей и раскладывают по 200-250 шт. в чашки Петри. Чашки Петри с яйцами помещают в климатическую камеру с температурой 2426(, относительной влажностью воздуха 60-75% и выдерживают 4-6 суток до начала отрождения гусениц. Массовый отбор стандартных гусениц проводят вручную на 2-3-й день после линьки на 2-й возраст. Стандартных гусениц 2-го возраста используют для определения биологической активности препарата, подсчитывая процент погибших через 48 часов. Водная суспензия препарата при этом готовится в концентрациях 0,25; 0,06; 0,015; 0,004 и 0,001%.
Тестируемых насекомых заражают агентом биоконтроля для определения летальной концентрации.. При постановке эксперимента используют обычно чашки Петри, в которые помещают естественный корм или искусственную питательную среду, смешанную с суспензией биопрепарата из расчета 1 мл на 3 г корма. В каждую чашку затем высаживают 10-15 особей тест-объекта одного возраста. Число повторностей 3-5. В контрольном варианте корм смешивают с водой.
Величина ЛК50 обычно определяется двумя способами: графическим методом пробитов или по формуле Кербера. В первом способе выявляют зависимость «эффект-доза». Чтобы эта зависимость была прямой, предложено по оси абсцисс дозу представлять в виде логарифма, а по оси ординат – процент гибели, преобразованный в так называемые пробиты [Finney, 1971]. Процент гибели гусениц подсчитывают по формуле Аббота [Abbott, 1925]. Более прост, но менее точен способ подсчета ЛК50 по формуле Кербера [Ашмарин и др., 1974]: lg ЛК50 = lg Cм -
· (( Li - 0,5),
где См - максимальная из испытанных концентраций,

· - логарифм кратности разведения суспензии,
Li - гибель особей в долях смертности
Обычно для оценки ЛК50 берут наряду с концентрацией, вызывающей 50% гибели, не менее двух ниже и двух выше [McGuere et al.,1997]. Для каждой группы препаратов должен быть свой признанный стандарт с такими же характеристиками, как и у испытуемого препарата.
Российскими учеными разработан достаточно большой ассортимент бактериальных препаратов. Из них дендробациллин и энтобактерин были первыми препаратами, которые в последние годы в массовом масштабе не производятся в России, но зарегистрированы в Украине [Kabaluk et al. 2010].
Дендробациллин создан на основе спор и кристаллов B. thuringiensis subsp. dendrolimus (sotto) (патовариант А). Бацилла выделена в 1949 г. профессором Иркутского государственного университета Е.В. Талалаевым во время эпизоотии сибирского шелкопряда Dendrolimus superans sibiricus Tchetw. в таежных лесах из погибших гусениц. Первая партия препарата дендробациллина в количестве 3 т была наработана в 1958 г. на Московском заводе бактерийных препаратов и прошла успешные испытания против сибирского шелкопряда.
Энтобактерин – препарат на основе спор и кристаллов B. thuringiensis subsp. galleriae (патовариант А). В 50-е годы ХХ в. в ВИЗР во время эпизоотии гусениц большой пчелиной огневки Galleria mellonella L. выделен возбудитель болезни – B. thuringiensis subsp. galleriae. В 1963 г. первый промышленный выпуск энтобактерина произведен на Бердском заводе биопрепаратов Новосибирской области (сейчас ПО «Сиббиофарм»).
Лепидоцид разработан на основе спор и кристаллов B. thuringiensis subsp. kurstaki (патовариант А). Во время эпизоотии мельничной огневки Ephestia kuehniella Zell. Э.Р. Зурабовой [1986] выделен возбудитель болезни гусениц – B. thuringiensis subsp. kurstaki. Следует отметить, что после 1970 г. большинство энтомопатогенных бактериальных препаратов в мире производится на основе данного подвида, впервые выделенного в 1962 г. американским ученым польского происхождения Э. Курстаком.
Бактокулицид (бактицид) – препарат на основе спорово-кристаллического комплекса B. thuringiensis subsp. israelensis (патовариант В). Первый отечественный препарат на основе этого подвида создан совместно ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии и Киевским университетом под названием «бактокулицид» и первоначально предназначался для подавления численности кровососущих комаров и мошек. Впоследствии ПО «Сиббиофарм» стал выпускать его под торговой маркой «бактицид».
В России также разработаны, но не производятся по разным причинам децимид и колорадо на основе B. thuringiensis subsp. tenebrionis (morrisoni), зарегистрированные в Украине.
Битоксибациллин (БТБ) на основе B. thuringiensis subsp. thuringiensis (патовариант А) относится ко второй биотехнологической группе биопрепаратов – содержит помимо спор и эндотоксина водорастворимый
·-экзотоксин. Разработан во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, зарегистрирован в России и в Украине. Первый отечественный препарат, содержащий кроме спор и белковых кристаллов водорастворимый
·-экзотоксин.
Турингин-1 – представитель третьей группы препаратов на основе токсинов без спор. Это жидкий препарат, содержащий в растворенном виде
·-экзотоксин (0,3%), продуцируемый B.thuringiensis subsp. thuringiensis. В настоящее время в России не производится, но зарегистрирован в Украине.
К этой же группе препаратов можно отнести битиплекс, зарегистрированный в начале ХХI в. в России. Битиплекс содержит активированный эндотоксин B. thuringiensis ssp. kurstaki (пептиды). Разработан в Ульяновском государственном университете [Каменек, 1998].
На основе B. thuringiensis subsp. darmstadiensis разработан препарат бацикол, пока не вошедший в Каталог. Действующим началом является спорово-кристаллический комплекс и
·-экзотоксин [Гришечкина, Ермолова, 2015].

2.4. Использование биопрепаратов на основе антагонистов фитопатогенов
Как отмечено выше, важная роль в подавлении развития болезней растений принадлежит антагонистическим бактериям рода Bacillus. В основе использования бактериальных препаратов против болезней растений лежит механизм антибиоза, регулирующий взаимоотношения микроорганизмов в природе. В настоящее время бактериальные препараты против болезней растений более распространены, чем грибные [Коваленков и др., 2007; Новикова и др., 2005; Франк и др., 2008; Dua, Sindhu, 2012; Janisiewicz, Korsten, 2002; Liu et al., 2011]. Зарегистрированные в России препараты на основе B. subtilis разрешены к применению в сельском и личном подсобном хозяйствах против болезней картофеля (ризоктониоз, фитофтороз), цветочных культур открытого и/или защищенного грунта (корневые гнили, пятнистости), капусты белокочанной («черная ножка», бактериоз), томата открытого и/или защищенного грунта (корневые гнили, фитофтороз, альтернариоз), плодово-ягодных культур, некоторых зерновых, сахарной свеклы, винограда и др [Государственный каталог пестицидов и агрохимикатов, 2016]. За рубежом также активно используют биологические препараты на основе антагонистических бацилл на различных культурах для управления здоровьем растений. Приведем примеры, представленные в российских и зарубежных источниках.
Большое количество публикаций посвящено использованию первого российского бактериального препарата бактофит против болезней различных культур в разных регионах России. Показано, что при использовании бактофита наибольший эффект получают для обработки сначала семян, а затем путем опрыскивания растений во время вегетации [Санин, 2013].
Обзор данных, представленных в российской литературе, указывает на предпочтительное использование биопрепаратов, в том числе бактофита, в условиях юга России. По данным В.П. Боровой [2008; 2009] при использовании бактофита биологическая эффективность в отношении корневых гнилей пшеницы составила 65%, а против сетчатой пятнистости до 70%. По другим данным, в условиях Краснодарского края при применении бактофита против септориоза листьев на озимой пшенице биологическая эффективность составила 72 и 43%, соответственно, против септориоза колоса – до 41 и 63%, соответственно. При применении бактофита для обработки семян против семенной инфекции биологическая эффективность не превышала против корневых гнилей – 53%, против снежной плесени – 46% [Коваленков и др., 2012]. При применении биопрепарата бактофит его биологическая эффективность против стеблевой ржавчины пшеницы составляла 74,6%, против септориозной и гельминтоспориозной пятнистостей – 65,0 и 78,8% соответственно. При снижении пораженности бурой ржавчиной озимой пшеницы эффективность препарата была значительно ниже и составила не более 41% [Кольбин и др., 2012].
Использование бактофита против темно – бурой пятнистости на озимом ячмене вызывало подавление данного заболевания на 18-31%, а ринхоспориозом до 43%, при поражении озимого ячменя мучнистой росой отмечено снижение пораженности заболеванием до 61% [Грошев и др., 2006]. На этой же культуре бактофит показал высокую (на уровне 70 %) биологическую эффективность против возбудителей корневых гнилей [Боровая, 2009].
В испытаниях, проведенных сотрудниками Северо-Кавказского НИИ садоводства и виноградарства показано, что при использовании бактофита на виноградниках в условиях повышенной влажности препарат обеспечивал высокоэффективную защиту (80,6–99,4 %) от оидиума. При использовании этого биопрепарата в период роста ягод винограда и до созревания биологическая эффективность биопрепарата достигала 99% [Юрченко и др., 2010]. Примененный для оздоровления виноградников Дагестана, пострадавших от массивных пестицидных нагрузок бактофит, при использовании двукратно опрыскиванием рабочей суспензией при норме расхода 3,0 л/га, показал биологическую эффективность против милдью на уровне 89-95 % [Астарханова и др., 2010].
Продемонстрировано также, что при использовании препарата бактофит отмечено выраженное снижение пораженности яблони грибными заболеваниями (паршой и мучнистой росой). Биологическая эффективность в отношении парши достигала 99%, при подавлении мучнистой росы - 96% [Якуба, Гусин, 2010].
При использовании бактофита для защиты насаждений персика от поражения клястероспориозом, монилиозом и паршой показано снижение поражения этими болезнями с эффективностью до 50-60% [Осташева и др., 2007]. На посадках земляники в Краснодарском крае эффективность бактофита в отношении серой гнили достигала 51% [Гринько, Стрелков, 2008].
В условиях Ставропольского края применение бактофита на сое против комплекса листостебельных и корневых инфекций обеспечило биологическую эффективность на уровне 70-92% [Коваленков и др., 2006]
Продемонстрировано антагонистическое действие бактофита отношении септориоза листьев и колоса озимой пшеницы в центральной части России, биологическая эффективность составила до 54% [Комков и др., 2004]. По результатам 6-ти опытов во ВНИИ фитопатологии в 2006 – 2009 гг. протравливание семян озимой пшеницы алирином-Б и бактофитом для подавления корневых гнилей и снежной плесени было равноценно химическим эталонам по эффективности (35-70 %) и по сохраненному урожаю (1,1 – 3,6 ц/га) [Захаренко, 2015].
В условиях Западной Сибири после обработки бактофитом зараженность семян грибом В. sorokiniana снизилась в 3 раза, одновременно препарат полностью оздоровил семена пшеницы от грибов рода Fusarium На фоне бактофита средний индекс развития болезни (по четырем органам корневой системы) оказался в 2,6 раза ниже контроля. Но сильнее всего под его влиянием оздоровились первичные корни (в 3,1 раза), что, по мнению авторов, свидетельствует о качественной, на уровне химического эталона, обработке семенного материала [Коробова, Гаврилец, 2005, 2006].
Нами было проведено детальное изучение влияния бактофита на возбудителя пурпуровой пятнистости малины в условиях Западной Сибири. Использовали два сорта малины, различающихся по устойчивости к болезни : относительно устойчивый сорт Колокольчик и менее устойчивый к болезни сорт Киржач. Предварительно выясняли действие бактофита на чистую культуру возбудителя пурпуровой пятнистости. Результаты in vitro в отношении D. аpplanata приведены в таблице 2.3.
Диаметр колоний возбудителя пурпуровой пятнистости снизился под влиянием биопрепарата, причем разница между контролем и опытом была существенной и препарат подавлял возбудителя в 1,3-1,6 раза.
Таблица 2.3
Влияние биопрепаратов на диаметр колонии гриба D. applanata
Вариант
Диаметр колонии, см
Ингибирующая активность, %


3-и
5-е
7-е
10-е
3-и
5-е
7-е
10-е

Контроль
4,1
6,1
6,9
8,6





Бактофит
2,4
2,7
3,1
3,3
41,5
55,7
55,1
61,6

НСР05 по вариантам – 0,3
НСР05 по суткам – 0,2



Следующий этап исследований включал испытание биопрепарата в условиях искусственного заражения стеблей малины фитопатогенов.
Данные по влиянию изучаемого биопрепарата через 7 и 30 суток после инокуляции на менее устойчивом сорте Киржач, а также в конце вегетации (в сентябре), на развитие пурпуровой пятнистости по размерам некротического участка и количеству плодовых тел гриба, представлены в таблице 2.4.






Таблица 2.4.
Влияние биопрепарата бактофит на размеры некротического участка и спороношение D.applanata при искусственном заражении сорт Киржач, инокуляция 24 июня, итоговый учет поражения 22 сентября
Вариант
Площадь пятна, см2
Количество плодовых тел / см2


7-е сутки
30-е сутки
Конец вегетации


Бактофит
1,0*
1,2*
7,0*
2,5*

Контроль (искусственный инфекционный фон)
3,9
4,1
19,9
8,1

НСР05 по вариантам
2,6
4,7

*различия существенны
Уже на 7-е сутки площадь пятна под действием бактофита была в 3,9 раза меньше. В конце вегетации в обоих случаях наблюдали достоверное уменьшение площади некротического пятна в 1,6 – 2,8 раза. В проведенных исследованиях нами отмечено активное подавление фитопатогена под влиянием биопрепарата бактофит. Количество плодовых тел достоверно уменьшалось под влиянием бактофита (в 3,2 раза).
Данные по влиянию биопрепарата на развитие пурпуровой пятнистости на более устойчивом к болезни сорте Колокольчик представлены в таблице 2.5.







Таблица 2.5.
Влияние биопрепарата бактофит на размеры некротического участка и спороношение D.applanata при искусственном заражении (сорт Колокольчик, инокуляция 24 июня, итоговый учет поражения 22 сентября
Вариант
Площадь пятна, см2
Количество плодовых тел / см2


Через7 сут
Через 30 сут
В конце вегетации


Бактофит
0,8
0,9
4,0*
3,6

Контроль (искусственный инфекционный фон)
1,6
2,1
11,2
7,8

НСР05
2,6
4,7

*различия существенны
Хотя различия между контролем и опытным вариантам по площади пятна были не существенны на 7-е сутки и 30-е сутки, наблюдалась тенденция к уменьшению этого показателя в 2 и более раз при обработке биопрепаратом. Только в конце вегетации подавление возбудителя болезни было достоверным. Эта же тенденция проявлялась в показателе количества плодовых тел на 1 кв. см (табл.2.5).
В 2013-2014 гг. проведены исследования в полевых условиях по оценке действия биопрепарата на пораженность однолетних побегов малины пурпуровой пятнистостью на двух сортах малины с разным уровнем устойчивости (табл.2.6.). Сроки обработки определялись при появлении первых симптомов болезней.





Таблица 2.6
Влияние обработки бактофитом на пораженность сортов малины пурпуровой пятнистостью в 2013 г. Обработка 12 июля
Варианты
Сорт


Киржач
Колокольчик


Развитие болезни, %


19.08
29.08
13.09
19.08
29.08
13.09

Контроль
22,5
26,3
28,1
10,0
12,5
13,1

Бактофит
10,6
11,3
13,1
5,0
6,1
6,9

Топаз
7,5
8,8
10,0
3,8
5,6
6,3

НСР 05: по вариантам =1,1; по сортам = 0,8


В 2013 г. развитие пурпуровой пятнистости в контроле на все даты учета было достоверно более чем в 2 раза больше на менее устойчивом к болезни сорте Киржач. На растениях сорта Киржач, обработанных бактериальным препаратом или химическим фунгицидом топаз, поражение болезнью снижалось примерно вдвое. На сорте Колокольчик при значительно меньшем поражении болезни в контроле степень влияния биопрепарата относительно контроля была примерно такой же как на сорте Киржач. Топаз в конце августа и середине сентября показал одинаковую эффективность с бактофитом.
В таблице 2.7. представлены данные по поражению побегов малины пурпуровой пятнистостью в течение вегетационного периода 2014 г. На протяжении трех сроков учета поражение более устойчивого сорта Колокольчик в контроле было примерно вдвое меньше, чем на менее устойчивом сорте Киржач.



Таблица 2.7
Влияние обработки бактофитом на пораженность сортов малины пурпуровой пятнистостью 2014 г. Обработка 18 июля
Варианты
Сорт


Киржач
Колокольчик


Развитие болезни, %


20.08
31.08
10.09
20.08
31.08
10.09

Контроль
13,8
15,9
22,5
7,5
8,3
9,4

Бактофит
6,3
7,4
10,6
3,8
4,2
5,0

Топаз
4,4
5,4
8,1
2,5
3,5
4,4


НСР 05 по сортам = 0,5; НСР 05 по препаратам =0,7


В 2014 г. на сорте Киржач наблюдалась тенденция к более высокой эффективности бактофита. Топаз на обоих сортах показал более высокую эффективность по сравнению с биопрепаратом.
Отметим, что бактериальный препарат бактофит, зарегистрированный в России для контроля листовых болезней овощных и зерновых культур, впервые апробирован нами в отношении возбудителя пурпуровой пятнистости малины в опытах in vitro, а также в полевых условиях при контролируемой и неконтролируемой инфекционной нагрузке. Опыты в лабораторных условиях показали, что в использованных концентрациях бактофит эффективен в отношении подавления роста D. applanata. В продолжение лабораторных опытов оценивали воздействие биопрепарата бактофит на возбудителя пурпуровой пятнистости D. applanata в модельном эксперименте на искусственном инфекционном фоне на двух сортах малины Киржач и Колокольчик по показателям размера некротического пятна и количества плодовых тел на см2.
На все три даты учета (табл. 2.7) бактофит при контролируемой инфекционной нагрузке оказывал сильное влияние на возбудителя пурпуровой пятнистости малины по показателям площади некротического пятна (примерно вдвое) на сорте малины, неустойчивом к пурпуровой пятнистости. Что касается устойчивого сорта Колокольчик, только в конце вегетации обнаружены существенные различия между контролем и опытным вариантом, с одной стороны и биопрепаратом, с другой. Под влиянием бактофита количество плодовых тел уменьшалось значительно сильнее на сорте, слабоустойчивом к фитопатогену.
В 2013 и 2014 гг. в полевых испытаниях на естественном фоне заражения стеблей возбудителем пурпуровой пятнистости для сравнения использовали топаз. В оба года поражение сорта Колокольчик пурпуровой пятнистостью было примерно вдвое ниже. Бактофит в полевых условиях подавлял развитие пурпуровой пятнистости, хотя и в меньшей степени чем топаз. Однако в конце вегетации бактофит показал одинаковую эффективность с топазом. Возможно, это связано с высокой степенью выживания и размножения спор бацилл [Bouizgarne, 2013].
При сравнении результатов активности биопрепарата на двух сортах малины с разной степенью устойчивости к дидимелле выявлено следующее. В год, более благоприятный для развития болезни (2013), на неустойчивом сорте малины бактофит проявлял более высокую антагонистическую активность, хотя разница не столь велика как в предыдущих опытах, на устойчивом сорте проявлялась лишь тенденция к увеличению активности бактофита, зато и разница в активности бактофита с химическим стандартом была несущественной, что может быть связано с накоплением биоагента. В следующем году погодные условия в меньшей степени способствовали развитию болезни.
Таким образом, проведенные исследования впервые показали возможность снижения пораженности малины пурпуровой пятнистостью препаратом бактофит с разной степенью эффективности в зависимости от устойчивости сорта и погодных условий. Препарат более эффективен на сорте малины, неустойчивым к пурпуровой пятнистости [Shternshis et al, 2016].
Высокая эффективность получена при испытаниях бактофита на других культурах в разных регионах России [Франк, Кищенко, 2008]. Например, продемонстрировано использование бактофита против болезней лесных культур в питомниководстве. Биопрепарат вызывал снижение пораженности мучнистой росой дуба черешчатого, шиповника собачьего, а также поражение культур корневой гнилью. Биологическая эффективность достигала 93% [Максименко, Титаренко, 2004].
Наряду с применением бактофита накоплено множество примеров эффективного биологического контроля болезней растений другими бактериальными препаратами (фитоспорин М, алирин-Б, гамаир и др).
Так, обработка семян пшеницы фитоспорином-М против корневых гнилей способствовала снижению пораженности растений в 3-4 раза. Биологическая эффективность биопрепарата была в интервале 72,4–92,5% в зависимости от возбудителя заболевания [Захарова и др, 2006 ]. Успешное использование фитоспорина против листостебельных инфекций пшеницы продемонстрировано рядом авторов [Горянин и др., 2015; Давлетшин и др., 2010; Коренюк, 2014; Немченко и др., 2014]. При использовании фитоспорина–М при протравливании семян против корневых гнилей эффективность составила 40%, против мучнистой росы, септориоза и бурой ржавчины - до 47% [Кузнецов и др., 2012]. Применение фитоспорина-М для обработки семян яровой пшеницы перед посевом в дозировке 1 л/т с последующим опрыскиванием в фазу флагового листа с расходом препарата 1,5 л/ га [Немченко, Цыпышева, 2014] повышало полевую всхожесть до 59 % (в сравнении с 54 % в контроле), прибавка урожайности при этом составила 3,1 ц/га к контролю.
Показана возможность использования фитоспорина–М против ризоктониоза картофеля. Разработанная схема обработок фитоспорином-М картофеля, включающая двукратное применение препарата, способствовала снижению пораженности ризоктониозом в 8,5 раз по сравнению с контролем, при этом биологическая эффективность достигала 88 % [Пусенкова и др., 2010]. Выявлено снижение пораженности картофеля фитофторозом при использовании данного биопрепарата как в период вегетации [Ишкова и др., 2008], так и при хранении клубней [Герасимова и др., 2010].
По данным В.Э. Лазько и др., [2014] применение фитоспорина-М привело к активному подавлению ряда грибных заболеваний на бахчевых культурах, например, пероноспороза, фузариоза и антракноза на дынях и арбузах более в 2-3 раза в зависимости от заболевания и культуры. В целом, достаточное количество публикаций посвящено использованию фитоспорина на зерновых, овощных, кормовых, плодовых и ягодных культурах против ряда болезней в разных климатических зонах [Жернова, Жернов., 2008; Гришечкина и др., 2010; Холод, 2014]. Так, при использовании биопрепарата фитоспорин–М пораженность заболеваниями черной ножкой и бактериозами снижалась на растениях капусты. Биологическая эффективность достигала 62% против черной ножки, против слизистого бактериоза – до 73%, сосудистого бактериоза – до 85%. Кроме того, обработка препаратом подавляла фитофтороз на листьях томата до 59%, на плодах до 92%. [Гришечкина и др., 2010].
Испытания нового бактериального препарата витаплан на посевах льна-долгунца [Захарова, Дьяконов, 2013] показали его биологическую эффективность против бактериоза до 100%, против пасмо – до 96,9 %, при этом витоплан не только обладал фунгицидным действием, но стимулировал рост культуры, увеличивая длину стебля, выход и массу семян.
Во многих случаях успешным было использование алирина Б для подавления болезней на разных культурах. Алирин Б эффективно сдерживал развитие корневых гнилей, пятнистостей, увяданий различной этиологии, мучнистой росы огурца и томата, фитофтороза томата в разных регионах России [Новикова, 2003; Помелов, Дудин, 2009]. Показана возможность его применения против фузариозов зерна при хранении с эффективностью до 90% [Алябьева и др., 2014]. Этот препарат сдерживал развитие пятнистостей земляники на уровне 91% [Холод, 2013; 2014], отмечено активное снижение пораженности парши яблони при использовании этого препарата [Якуба, 2004]. Есть сведения о возможности применения алирин Б для подавления грибных болезней смородины, при его использовании наблюдали снижение развития заболевания мучнистой росой с биологической эффективностью до 93% -96% [Козлова, Лысенко, 2008; Лысенко и др., 2009]. Другими авторами в разных климатических условиях показана возможность использования алирина Б в биологическом контроле возбудителей болезней овощных культур [Полякова, 2008; Попов, Толопило, 2008; Антонова, 2015].
В полевых испытаниях против альтернариоза картофеля [Байрамбеков, Корнева, 2009] на момент уборки биологическая эффективность алирина-Б составила 38,6 % относительно 52,7 % у эталона (ридомил голд МЦ, вдг). Кроме этого, авторы отмечали достоверную прибавку урожая на уровне 20 % и увеличение выхода крупных клубней на 8 % в сравнении с контролем.
Довольно много примеров успешного использования гамаира для биоконтроля болезней растений [Павлюшин и др., 1999, Новикова, 2005; Полякова, 2008]. Изучено влияние гамаира на силу начального роста семян озимой пшеницы и на снижение пораженности этой культуры корневой гнилью. Обработка препаратом существенно повышала энергию прорастания и активно снижала развитие заболевания [Зимоглядова и др., 2009]. Л.Д. Гришечкиной с соавторами [2010] отмечено подавление семенной инфекции, а также существенное снижение пораженности зерновых культур корневыми гнилями (до 85%). При защите насаждений смородины от американской мучнистой росы биопрепаратом гамаир эффективность достигала 96% в зависимости от применения на сортах различного уровня устойчивости [Лысенко и др., 2009; Козлова, 2013, 2014].
Нами дана оценка влияния гамаира на пурпуровую пятнистость малины в условиях Западной Сибири [Шпатова, Штерншис, 2012].
Сначала проверили действие биопрепарата in vitro в отношении возбудителя D. аpplanata. В лабораторных условиях отмечено подавление роста фитопатогенного гриба под влиянием биопрепарата. Биологическая эффективность в отношении фитопатогена варьировала от 59 до 67%. В полевом опыте под влиянием обработки растений малины гамаиром выявлено снижение пораженности однолетних побегов пурпуровой пятнистостью (табл.2.8).
Таблица 2.8.
Влияние препаратов на поражение малины пурпуровой пятнистостью (СХА «Сады Сибири», сорт Зоренька Алтая, в среднем за 2010-2011гг.)
Вариант
Распространенность, %
Развитие, %
Биологическая эффективность, %
Урожайность, т/га

Контроль
80,0
21,9
-
2,04

Гамаир
55,5
14,3
34,7
2,18

Топаз
43,6
11,2
48,9
2,22

НСР05
-
1,6
-
0,19


Проведённые полевые испытания показали, что под влиянием биопрепарата распространённость и развитие болезни уменьшились в 1,4 раза по сравнению с контролем. Различия между опытным вариантом и контролем существенны. Под влиянием топаза распространенность и развитие заболевания сокращались в 1,8 раза по сравнению с контролем. В вариантах с применением, как биопрепарата, так и химического эталона топаз урожайность была одинаковой. Статистических различий между вариантами по урожайности (гамаир и топаз) не выявлено. Таким образом, полевые испытания подтвердили антагонистическое действие микробного препарата выявленное в лабораторных условиях, где ингибирующая активность достигала 67%.
Помимо имеющихся в Российском каталоге бактериальных препаратов испытание проходят экспериментальные, еще не зарегистрированные препараты на основе бацилл. Имеется достаточно публикаций по применению таких биопрепаратов на разных культурах. В отношении корневых гнилей выявлено снижение пораженности на зерновых культурах при использовании экспериментальных препаратов на основе штаммов B. subtilis BZR 336g и B. subtilis BZR 517 – биологическая эффективность против корневых гнилей 45-68 %; бурой ржавчины – 18 %; желтой пятнистости листьев 26-49 % [Надыкта и др., 2015]. В отношении поражения озимой пшеницы фузариозом данные препараты показали достаточно высокую биологическую эффективность (до 78%) при обработке семян [Асатурова и др., 2014]. При использовании экспериментального биопрепарата на основе Bacillus amyloliquefaciens штамм ВКПМ –B 11008 при протравливании семян против ряда болезней яровой пшеницы отмечено снижение пораженности культуры. Против обыкновенной корневой гнили и септориоза - на 100%, альтернариоза и фузариоза до 98% относительно контроля [Сираева, Захарова, 2012
Показана возможность подавления ризоктониоза и фитофтороза на картофеле экспериментальным препаратом баксис. Биологическая эффективность применения баксиса на основе комплекса метаболитов бактерий B. subtilis составила 58% против ризоктониоза, против фитофтороза при умеренном развитии заболевания - 76% по листьям и до 73% при обработке клубней [Герасимова и др, 2010]. На подсолнечнике при использовании баксиса против фомопсиса отмечено снижение пораженности заболеванием, эффективность составила до 67%, против ложной мучнистой росы до 69% [Диденко и др., 2010]. В отношении пораженности картофеля фитофторозом и другими болезнями клубней при хранении показана возможность использования другого экспериментального препарата бацилон. Биологическая эффективность составила 24%. [Давидюк и др., 2004].
На томатах и огурцах применяли препарат бактоген на основе бактерии B. subtilis против ряда болезней. Биологическая эффективность против бактериозов достигала 97%, против пероноспороза - 86%, аскохитоза – 72%, корневых гнилей -75%, против белой и серой гнилей – 61% [Максимова и др., 2001]. При использовании экспериментального препарата на основе штамма B. subtilis Ал-5 против бактериального рака стеблей отмечено снижение пораженности растений томата на 48% [Суркова, 2008].
При применении препарата фитоцид – Р на основе штамма Bacillus subtilis наблюдали снижение пораженности болезнями проростков в 1,5 раза по сравнению с контролем при замачивании семян огурца. Выявлено, что эффективно использование данного препарата разными способами: обработка семян, внесение в лунки при посадке рассады и трехразовый полив растений на протяжении вегетации. Пораженность корневыми гнилями снижалась более чем в 3,5 раза. Эффективность применения данного препарата достигала 74% [Ткаленко, Болоховская, 2012].
Применение экспериментальных биопрепаратов D 7-1 и бациллин в условиях юга России обеспечивало снижение поражения подсолнечника стеблевой формой проявления белой гнили от 2,4 до 11 раз, при этом биологическая эффективность составила 54,5-100%, при эффективности эталонов 33,9-54,5 %. В среднем за два года наибольшая биологическая эффективность против стеблевой формы проявления белой гнили составила 83 %. Пораженность растений корзиночной формой болезни снижалась в 1,5-3,9 раза [Фирсов и др., 2009]. При использовании бациллина в отношении серой гнили на землянике его эффективность достигала 77% [Холод, 2010]. Успешными были испытания бациллина на яблоне против альтернариоза на юге России, биологическая эффективность препарата превышала 70% [Якуба, Гусин, 2006; Якуба, 2007].
Из новых перспективных биопрепаратов, разработанных в институте микробиологии НАН Беларуси, препарат на основе B. amyloliquefaciens позволял свести к минимуму пораженность плодов яблони в период хранения плодовой и пенициллезной гнилями (до 1%) [Купцов и др., 2014].
За рубежом биологические препараты на основе бактерий рода Bacillus также зарекомендовали себя как эффективные, экологически безопасные и альтернативные синтетическим пестицидам [Colins et al., 1994; Burkhard et al., 1991]. Следует отметить биологический фунгицид для контроля листостебельных инфекций серенада MAX (на основе Bacillus subtilis штамм QST 713). Этот препарат применяется методом малообъемного опрыскивания с целью контроля черной бактериальной пятнистости, пустульного бактериоза, мучнистой росы, склеротиниоза и питиоза. Способствует эффективному снижению развития бактериальной пятнистости и склеротиниоза [Kim et al., 1999], а также ботритиоза [Paulitz, Belanger, 2001].

2.5. Применение энтомопатогенных бактериальных препаратов
Конкуренция фитофагов и человека за потребление растительной пищи обусловливает применение специальных мероприятий по контролю численности насекомых и клещей. Периодически возникающие в природе эпизоотии насекомых являются реализацией природного механизма биологического контроля численности фитофагов, что защищает растения без вмешательства человека. Однако природные эпизоотии проявляются не столь часто, поэтому по мере необходимости следует вносить биологические агенты – естественные регуляторы численности фитофагов в виде энтомопатогенных биопрепаратов для защиты лесных и сельскохозяйственных культур.
Биологическую защиту растений считают важнейшим фактором оптимизации фитосанитарного состояния растениеводства, управления здоровьем растений. Российские ученые в ряде случаев были пионерами в развитии биологических методов защиты растений. Первый в мире биопрепарат для защиты растений был создан И.И. Мечниковым более 100 лет назад, и это положило начало развитию микробиологического метода защиты растений в мире [Lord, 2005]. К середине 80-х годов прошлого века в нашей стране были созданы все условия для наращивания темпов производства и применения биопрепаратов, при этом была обеспечена всесторонняя поддержка со стороны государства. Произошедшие в российском обществе в 90-е годы ХХ в. изменения социально-экономических условий резко ухудшили эту ситуацию, и только в начале ХХI в. наметился подъем в использовании биологических препаратов для защиты растений. В данной главе приведены основные результаты использования энтомопатогенных бактериальных препаратов для контроля численности фитофагов (насекомых и клещей).
Прежде всего, необходимо отметить, что использование энтомопатогенов в качестве основы бактериальных препаратов, как и других агентов регуляции численности видов, повреждающих растения, определяется стратегиями, которые предложены в результате многолетнего обсуждения этого вопроса учеными стран, входящих в глобальную международную организацию по биологическому контролю вредных видов [Eilenberg et al., 2001]. Применение возбудителей болезней насекомых и клещей, которые используются не для искоренения, а для регуляции численности фитофагов до хозяйственно неощутимого уровня, определяется четырьмя основными стратегиями:
- интродукция в популяцию вредных видов биологического агента из удаленного ареала для его долговременного обоснования и постоянной регуляции численности фитофагов;
- однократное применение биологического агента с целью его дальнейшего размножения и функционирования как регулятора численности в течение продолжительного срока (но не постоянно);
- многократное использование биологического агента для оперативного сдерживания фитофагов;
- сохранение, активизация и учет деятельности природных полезных энтомопатогенов различными способами.
Примеры успешной реализации всех четырех предложенных стратегий имеются и в России, и в других странах. Активный путь подавления численности насекомых заключается во внесении инфекционного начала в биоценоз в виде препарата и может осуществляться двумя способами: 1) однократное применение препарата в очаге размножения вредителя в расчете на возникновение искусственной эпизоотии, 2) не менее, чем двукратное внесение биопрепарата по типу инсектицида. Это соответствует второй и третьей стратегиям (однократное и многократное использование биопрепаратов).
Для некоторых систем энтомопатоген - хозяин возможно однократное внесение агента для создания искусственной эпизоотии. Значимость эпизоотийного направления отмечали И.И. Мечников [1879] и Э. Штейнхауз [1952]. При реализации эпизоотологического направления количество внесенного энтомопатогена может быть незначительным в расчете на инициацию вспышки заболевания.
После разработки первых отечественных бактериальных препаратов сторонниками создания искусственных эпизоотий явились Е.В. Талалаев, Н.В. Кандыбин и др. Однако, следует отметить, что далеко не всегда удается вызвать искусственную эпизоотию при однократном внесении энтомопатогена. С большей вероятностью это происходит в лесных биоценозах. Работами школы профессора Е. В. Талалаева (Иркутский государственный университет) показана возможность создания искусственных эпизоотий при однократном внесении бактериальных препаратов в лесной биоценоз. Так, В. С. Кулагин [1987] отмечает, что вероятность эффективного подавления численности сибирского коконопряда в результате возникшего эпизоотического процесса определяется количеством энтомопатогенных бактерий B. thuringiensis в биоценозе, численностью вредных насекомых и экологическими условиями.
Следует отметить, что более распространена в современных условиях третья стратегия использования биопрепаратов для подавления численности вредных насекомых и клещей в открытом и закрытом грунте. Оперативное сдерживание фитофагов осуществляется не менее чем двукратным применением биопрепаратов на основе энтомопатогенов или их метаболитов. При сохранении той же степени экологической безопасности этот способ регуляции численности насекомых (по типу биологического инсектицида) более надежен. В данном случае ориентируются на быстрый эффект энтомопатогена, внесенного в данный очаг, а не на возникновение искусственной эпизоотии.
Далее будут представлены примеры использования биопрепаратов с учетом вышеперечисленных стратегий для защиты сельскохозяйственных и лесных культур. Рассмотрено включение биопрепаратов в системы защиты растений, разработанных, в первую очередь в России и, преимущественно, в условиях Сибири.
Замена химических инсектицидов на биологические препараты наиболее целесообразна на овощных и плодово-ягодных культурах, продукция которых употребляется в пищу в свежем виде, часто для диетического питания. Для региона Сибири и Дальнего Востока в 80-е гг. ХХ в. была разработана система защиты основной овощной культуры открытого грунта - белокочанной капусты, где предложена максимальная замена химических инсектицидов на биологические препараты [Штерншис и др., 1987]. Позднее продемонстрирована возможность почти полного биологического контроля всех насекомых - фитофагов, заселяющих ее в период вегетации [Осинцева, 1995; Штерншис и др., 1995; Shternshis, 2004]. Чешуекрылые вредители: капустная совка Mamestra brassicae L., капустная белянка Pieris brassicae L., капустная моль Plutella xylostella L., луговой мотылек Pyrausta sticticalis L. способны полностью уничтожить урожай капусты. Отечественные препараты на основе B. thuringiensis патоварианта А (дендробациллин, лепидоцид и др.) стали полноценной заменой химических инсектицидов. Для подавления численности наименее восприимчивых к B. thuringiensis гусениц капустной совки более всего пригодны лепидоцид (с более высоким, чем у других бактериальных инсектицидов содержанием эндотоксина) или экзотоксин-содержащие препараты (БТБ, бикол). В условиях Сибири на посадках капусты встречается также садовая совка Mamestra suasa L. Гусеницы садовой совки обладают более высокой чувствительностью к биопрепаратам, что важно при определении норм их расхода [Осинцева, 1995]. Для защиты от белянки и моли, как правило, применяют меньшие из рекомендованного в Каталоге пестицидов диапазона норм расхода биопрепаратов.
По мере того, как регистрировались новые препаративные формы биологических инсектицидов, уточнялись и технологии их применения. Так, в Кемеровской области на сортах капусты разных сроков созревания испытывали лепидоцид СК и лепидоцид [Шульгина, Штерншис, 2004]. Оказалось, что лепидоцид СК в жидкой препаративной форме предпочтительней стандартного сухого лепидоцида П, так как обеспечивает значительное уменьшение нормы расхода при достижении одинакового защитного эффекта. Оптимальная норма расхода лепидоцида СК – 1 л/га. Показано также, что погодные условия в большей степени влияют на эффективность препарата против менее восприимчивого вредителя - капустной совки. В Иркутской области при использовании лепидоцида СК и П против чешуекрылых вредителей капусты биологическая эффективность достигала 74-80%, при этом требовались значительно меньшие нормы расхода жидкой препаративной формы по сравнению с порошком [Пахтуев и др., 2002].
Выявлена разная восприимчивость гусениц фитофагов к бактериальному препарату в зависимости от разновидности капусты [Андреева и др., 2013]. На менее благоприятном для развития насекомых растении-хозяине их восприимчивость к биопрепарату была выше, хотя и варьировала в зависимости от численности в определенных условиях года. В полевых испытаниях на 2-х разновидностях капусты гибель гусениц капустной моли от лепидоцида зависела от кормового субстрата (табл. 2.9).
Т а б л и ц а 2.9.
Действие лепидоцида на гусениц капустной моли на 2-х разновидностях капусты, Новосибирский р-н, 2009 г.

Вид капусты
Вариант
Количество живых особей,
экз./100 растений, по суткам
Биологическая эффективность, %
по суткам



До обработки
3
7
3
7

Белокочанная
Контроль
183,3
131,3
62,5
-
-


Лепидоцид
193,3
37,8
18,3
73
72

Краснокочанная
Контроль
269,5
131
66,8
-
-


Лепидоцид
260,3
59
40
53
48

НСР05
Факторы А, В
67,1
32,6
25,7
-
-


АВ
94,9
46,1
36,3
-
-


Примечание: фактор А – разновидность капусты, В – препарат.

Биологическая эффективность препарата на белокочанной капусте сорта Подарок (где численность вредителей была меньше) на 3-7 сутки после обработки была выше на 20-24% по сравнению с краснокочанной капустой сорта Марс. Такая зависимость подтверждается результатами ряда работ, где изучалось влияние растения-хозяина на эффективность B. thuringiensis в отношении насекомых-фитофагов [Андреева, 2009; Janmaat, Myers, 2005; Meade, Hare, 1993,1995]. Полученные результаты находятся в русле общей концепции триотрофа, отраженной в работах российских и зарубежных исследователей [Шапиро и др., 1979; Kouissi et al., 2001]. Согласно этой концепции, различия в биохимическом составе растения-хозяина могут изменять восприимчивость насекомого (консумента I порядка) к энтомопатогену (консументу II порядка). Аллелохемики (вторичные метаболиты растений) способны защищать растения, уменьшая выживаемость насекомых за счет ухудшения качества кормового ресурса, а также прямо или опосредовано влиять на энтомопатогенный микроорганизм [Cory, Hoover, 2006].
Против ранних вредителей капусты - крестоцветных блошек (Coleoptera: Chrysomelidae) в России испытан разработанный во ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии, еще не зарегистрированный препарат бацикол на основе B. thuringiensis ssp. darmstadiensis, содержащий как споры, так и эндо- и экзотоксины. В ряде регионов его эффективность достаточна для подавления численности этих вредителей капусты [Смирнов, 2008; Гришечкина, 2015]. Таким образом, численность всех основных видов фитофагов капусты успешно контролируется применением биологических препаратов.
Выращивание овощных культур в закрытом грунте играет важную роль в получении ранней и диетической продукции, однако возможности бактериальных препаратов здесь ограничиваются только экзотоксин-содержащими. Опыт использования битоксибациллина против основного вредителя овощных культур (огурца, томата, перца, зеленных культур) – обыкновенного паутинного клеща Tetranichus urticae Koch. в хозяйствах Иркутской, Кемеровской и Новосибирской областей показал, что при неоднократном опрыскивании растений суспензией в концентрации 0,7-1,0% гибель вредителя достигает 70% [(Неудачина, 1985; Штерншис, 1988; Андреева, Штерншис, 1995]. Успешно использовали препарат в этой же концентрации суспензии против T. urticae при выращивании розы в теплицах [Долженко, 2013; Яковлева и др., 2013]. При учете кормового ресурса более высокая биологическая эффективность битоксибациллина, как в лабораторных опытах, так и в теплицах, отмечена на растениях баклажана, по сравнению с растениями сои и огурца [Андреева, 2011].
Среди плодовых культур в России в целом и в Сибири, в частности, большое внимание уделяется яблоне. Для подавления численности основного вредителя яблони яблонной плодожорки Carpocapsa pomonella L. также используют бактериальные препараты. Для получения высокой эффективности важно точно определить срок обработки биопрепаратами, поскольку отродившиеся гусеницы плодожорки короткий срок находятся на поверхности листьев и плодов, затем вгрызаются в плод. Поэтому обработки биопрепаратами следует проводить через 5-7 дней после откладки яиц или сразу после отрождения гусениц. В точном определении этого срока в условиях Западной Сибири помогают феромонные ловушки [Цветкова и др., 2008]. Из бактериальных инсектицидов применяют все препараты B. thuringiensis патоварианта А. В России разработана система защиты яблони от фитофагов с максимальным применением биопрепаратов для Центрального черноземного региона [Колесова, 1994]. Наибольшая эффективность от препаратов получена при их применении в фазе розового бутона яблони или сразу после цветения, т.е. против гусениц младших возрастов. Замена высокотоксичных химических инсектицидов биопрепаратами активизирует деятельность природных энтомофагов, что дает дополнительный эффект. В ряде хозяйств Воронежской и Липецкой областей был испытан препарат баксин (B. thuringiensis ssp. dendrolimus), который также показал высокую эффективность против листогрызущих вредителей. Апробация лепидоцида (2 кг/га) и баксина (1 кг/га) продемонстрировала возможность их использования для защиты плодов летних и осенних сортов яблони от яблонной плодожорки. По данным автора, однократное применение этих препаратов через неделю после пика лета бабочек перезимовавшего поколения позволило снизить поврежденность съемных плодов до 0,4-0,8% против 12,5% (без обработок). В южном регионе установлено, что микробиологические препараты более эффективны во второй половине вегетации. В Краснодарском крае выявлена достаточно высокая эффективность полученных в условиях малотоннажного производства биопрепаратов лепидоцид, бацикол и других, в защите яблони от фитофагов [Ярошенко и др., 2002]. В этом же регионе наибольшую эффективность против яблонной плодожорки показали смеси препаратов димилин + лепидоцид и матч + лепидоцид, в результате применения которых удалось сохранить от повреждений 96 и 94 % плодов соответственно. Смесь лепидоцида с димилином обладает также наибольшим овицидным действием с эффективностью 91 % [Иванова, 2009].
В рекомендациях М.И.Болдырева и Н.Я. Каширской [2009] по Центральной черноземной зоне в систему защиты яблони от яблонной плодожорки включены все препаративные формы лепидоцида и БТБ.
Защита плодовых и ягодных культур экологически безопасными биопрепаратами чрезвычайно важна в регионах с холодным климатом, где природа за короткий вегетационный период не способна быстро восстановиться от стрессов, вызванных высокой пестицидной нагрузкой. В Сибири помимо яблони выращивают облепиху, смородину, крыжовник, малину, землянику. Облепиха, как известно, является ценной поливитаминной культурой. Ее повреждают гусеницы непарного шелкопряда, восприимчивые к бактериальным препаратам. Гусеницы облепиховой моли Gelechnia hyppophaella L. успешно подавляются битоксибациллином [Штерншис, 1988].
На черной смородине в условиях Западной Сибири применение лепидоцида сдерживало численность крыжовниковой огневки на уровне химических инсектицидов. Оптимальная норма расхода лепидоцида КЭ составила 0,6 - 1.2 л/га [Васькин, Штерншис, 2006]. В результате обработки смородины биопрепаратом в таких нормах расхода достигается значительное снижение численности сопутствующих насекомых-вредителей, в частности, таких как крыжовниковая побеговая тля Aphis grossulariae Kalt. Отмечена зависимость эффективности биопрепаратов в отношении гусениц огневки от погодных условий. Дождливая погода с температурой воздуха около 18оС ухудшала эффективность обработки из-за частичного смыва препарата каплями дождя с поверхности ягод; а также отсутствия системного действия биопрепаратов. Урожайность черной смородины была примерно на одном уровне при обработке биопрепаратами и химическим инсектицидом (табл. 2.10). Однако преимуществом при этом является сохранение природных энтомофагов, вносящих свой вклад в естественную регуляцию численности фитофагов черной смородины.
Т а б л и ц а 2.10
Урожайность черной смородины (СХА «Сады Сибири», 2003 – 2005г.)

Варианты
Урожайность т/га


2003
2004
2005
среднее

Контроль
6,02
6,09
5,05
5,72

Лепидоцид 0,6л/га
9,06
9,20
9,04
9,10

Лепидоцид 0,8л/га
9,52
9,38
9,21
9,37

Лепидоцид 1,25л/га
10,38
9,77
9,94
10,03

Фуфанон 2,5л/га
10,83
10,06
10,09
10,33

НСР05
0,51
0,39
0,30



В условиях Новосибирской области сравнивали влияние лепидоцида и фуфанона на энтомофагов, обитающих в садовом ценозе, где выращивали ягодные культуры, включая кокцинеллид, сирфид и жужелиц, пауков [Васькин, Штерншис, 2004]. Численность всех энтомофагов резко снижалась на участках, обработанных химическим инсектицидом фуфанон. После опрыскивания фуфаноном в концентрации 0,2% численность пауков и жужелиц на данном участке восстанавливалась достаточно долго (около месяца). В то же время обработка лепидоцидом практически не оказала вредного воздействия на количество энтомофагов. Их численность сохранялась такой же, как и при обработке растений водой (контрольный вариант). В условиях Ленинградской области на смородине и крыжовнике с высокой эффективностью применяли битоксибациллин против крыжовникового пилильщика.
В Сибири красная малина и садовая земляника – одни из самых распространенных ягодных культур, как при промышленном возделывании, так и на приусадебных участках. Красная малина занимает по площади второе место после черной смородины. Наиболее вредоносным фитофагом малины в этом регионе является малинная побеговая галлица Resseliella theobaldi Barnes [Белых и др., 2004]. Особенность этого вредителя – сопряженность с заболеванием, вызываемым фитопатогенными грибами, главным образом D. applanata, поэтому оценка действия препаратов проводится по развитию так называемого галлицевого ожога [Беляев, 2004; Shternshis et al., 2002].
Для сдерживания численности малинной побеговой галлицы перспективно использование препарата бактицид на основе B. thuringiensis ssp. israelensis. Выбор этого препарата обусловлен тем, что была показана эффективность его действующего начала (B. thuringiensis патовариант В) против некоторых видов насекомых отряда Diptera, в частности, рисового комарика [Кандыбин и др., 1995].
Полевые опыты по оценке влияния бактицида на галлицевый ожог проводили в насаждениях малины в Новосибирской области на восприимчивом к вредителю сорте Новосибирская крупная. Использовали двукратное опрыскивание суспензией препарата с интервалом 10 дней. Контрольный участок не обрабатывали. В качестве химического стандарта применяли актеллик. Под влиянием обработок бактицидом, 0,2%, развитие галлицевого ожога достоверно снижалось в 1,4 - 1,9 раза. Различия с химическим эталоном - актелликом, 0,2%, были несущественны. Следует отметить, что бактицид не оказал влияния на независимую грибную инфекцию малины, что свидетельствует о восприимчивости именно галлицы к биопрепарату. Необходимым условием для эффективного контроля численности малинной побеговой галлицы является своевременное определение начала лета фитофага, так как упущенные сроки отрицательно сказываются на биологической эффективности биопрепаратов. Оптимальным сроком проведения обработки является начало массового лета галлицы. В этом отношении представляет интерес использование феромонных ловушек. Проведенные испытания феромонов малинной побеговой галлицы, предоставленных нам английским энтомологом Джерри Кросс (Jerry Cross), показали их высокую специфичность и уловистость по сравнению с традиционно применяемыми водными ловушками [Беляев и др., 2010].
В последние годы наблюдается экспансия опасного вредителя картофеля колорадского жука Leptinotarsa decemlineata Say. во многие регионы России, в том числе в Сибири. Что касается бактериальных энтомопатогенных препаратов для подавления численности этого фитофага, большее распространение получили экзотоксин-содержащие. В России зарегистрированы против колорадского жука битоксибациллин и бикол. Так, по данным Н. В. Кандыбина и др. [2009], при трехкратных обработках картофеля битоксибациллином при норме расхода БТБ 2 кг на 1 га эффективность подавления колорадского жука была стабильно высокой. При этом отмечена необходимость своевременной первой обработки во время массового появления личинок первых возрастов. Вторая группа бактериальных препаратов против колорадского жука имеет своей основой B. thuringiensis ssp. tenebrionis (иное название - B. thuringiensis ssp. morrisoni, штамм tenebrionis). После открытия в 1983 г. этого подвида достаточно быстро были разработаны первые биопрепараты против колорадского жука в США. Два таких препарата M-Trak® и Foil® показали высокую эффективность в подавлении личинок всех возрастов жука и хорошо сочетались с яйцеедом Coleomegilla maculata De Geer [Hilbeck et al., 1998]. В начале 90-х годов ХХ в. в СНГ впервые был успешно испытан для защиты картофеля от этого фитофага препарат новодор датской фирмы «Ново Нордиск» [Король и др., 1994]. Эти результаты явились стимулом для разработки отечественного препарата колорадо [Азизбекян и др.,1996]. Однако к 2010 г. из мирового ассортимента разработанных препаратов действующим остался лишь новодор. Причинами этой неудачи называют строгую специфичность этих препаратов, максимальную эффективность против личинок 1-2 возрастов, труднодоступных при опрыскивании, и быструю инактивацию в полевых условиях [Gelender, 2004]. В настоящее время новодор больше всего используется в органическом земледелии и в городских парках против ильмового листоеда Xanthogaleruca luteola Muller.
В условиях Сибири колорадский жук стал опасным вредителем картофеля значительно позже, чем в Европейской части России. При использовании БТБ против колорадского жука в норме расхода 5 кг/га в Новосибирской области эффективность достигала 95%, в Кемеровской области – 78% [Пахтуев и др., 2002], что было сравнимо или несколько ниже уровня химических инсектицидов. В Омской области применяли этот препарат в норме расхода 2 кг/ га [Барайщук, Штерншис, 2008]. Наибольшая эффективность БТБ наблюдалась для личинок 1 и 2 возрастов ( 87%, меньшая для личинок 2 и 3 возрастов ( 79% и самая низкая для личинок 3 и 4 возрастов ( 25%. Гибель личинок от химического инсектицида сумицидин и БТБ достоверно не отличалась в отношении личинок 1 ( 2 возрастов колорадского жука. Лишь в отношении личинок 3(4 возрастов наблюдалась достоверно более высокая эффективность сумицидина по сравнению с бактериальными препаратами. В Новосибирской и Ленинградской областях успешно испытан бацикол для подавления численности колорадского жука на посадках картофеля [Гришечкина, 2015].
В лесных массивах внесение биопрепаратов помимо прямого эффекта приводит к возникновению долговременных очагов инфекции вредителей. Накоплен достаточно большой опыт использования бактериальных препаратов для защиты леса как в России, так и за рубежом [Талалаев, 1970; Бахвалов, 1995; Голосова, 2004; Гниненко, 2007]. Огромные массивы леса сосредоточены в Сибири, что обусловило интерес сибирских ученых к разработке бактериологического метода подавления численности лесных фитофагов. Объектами исследований стали такие опасные вредители лесов как сибирский шелкопряд Dendrolimus sibiricus superans Tschetv., непарный шелкопряд Lymantria dispar L., шелкопряд-монашенка Lymantria monacha L. и другие. Проведены теоретическое обоснование и практическая реализация использования бактериальных препаратов дендробациллина, инсектина, гомелина в регуляции численности шелкопрядов. Так, Е. В. Талалаевым [1970] предложено для защиты от сибирского шелкопряда инфицирование хвои в межлетном году для создания очагов инфекции. По данным В. С. Кулагина [1987] при качественной и своевременной обработке лесных насаждений бактериальные препараты способны сдерживать численность сибирского шелкопряда в нескольких поколениях вредителя. В 1965 г. получены первые успешные результаты бактериологического подавления численности непарного шелкопряда в сосновых лесах Красноярского края [Машанов и др.,1981]. Наряду с непарным шелкопрядом действие бактериальных препаратов распространялось также на сопутствующего вредителя - гусениц черно-желтой ванессы Vanessa xanthomelus L. В Омской области успешно подавлены очаги непарного шелкопряда в лесхозах в 2005-2006 гг. [Барайщук, 2008]. Проведена наземно(очаговая обработка лесов усовершенствованным препаратом лепидоцид, СК(М против гусениц непарного шелкопряда аэрозольным генератором ГРД. Биологическая эффективность препарата составляла от 73 до 80% в 2005 г., и от 78 до 94% в 2006 г.
Бактериальные препараты достаточно широко применяли в лесах Дальнего Востока. Так, способом ультрамалообъемного опрыскивания (3 л/га) лепидоцидом СК без разбавления водой подавляли численность гусениц сибирского шелкопряда 3-4 возраста (300-400 особей на дерево) в Приморском крае. Биологическая эффективность составила.82,5% [Кутеев, 1998]. По данным Т. С. Малоквасовой и Л. П. Челышевой [1998] в период нарастания численности гусеницы шелкопрядов относительно устойчивы (эффективность до 45%). В эруптивную фазу вспышки восприимчивость к дендробациллину и лепидоциду в среднем за многие годы была достаточно высокой. При этом восприимчивость к биопрепаратам гусениц шелкопрядов амурских популяций всех возрастов в продромальную и эруптивную фазы выше по сравнению с приморской популяцией.
В лесах Ульяновской области с высокой эффективностью применяли битиплекс против хвое- и листогрызущих вредителей при отсутствии отрицательного эффекта в отношении энтомофагов [Каменек и др., 2005]. При эффективной бактериальной обработке дубрав Самарской области против дубовой зеленой листовертки Ю. А. Сергеевой [2007] отмечено щадящее влияние лепидоцида СК на паразитов этого фитофага.
Применение биопрепаратов важно также и в полезащитных лесных полосах. Показана перспективность использования биопрепаратов как экологически безопасных средств защиты лесных полос при вспышке массового размножения дубовой зеленой листовертки и непарного шелкопряда [Белицкая, 2004]. Высокий защитный эффект (до 90%) получен при использовании дендробациллина и битоксибациллина. В лесных и городских насаждениях Северного Кавказа многолетними исследованиями выявлена высокая эффективность авиационного применения бактериальных препаратов против опасного вредителя – американской белой бабочки без отрицательного влияния на энтомофагов [Кобзарь и др., 1991].
При обсуждении использования биопрепаратов для подавления численности вредителей сельского и лесного хозяйства нельзя не коснуться проблемы их безопасности для человека и окружающей среды, отражающей главное достоинство этих средств защиты растений. Естественно, что основное преимущество биологических препаратов - специфичность действия, является залогом безопасности их для здоровья человека. Тем не менее, для включения любого биопрепарата в Каталог зарегистрированных для применения, необходимо получить доказательства его безвредности для человека, животных, полезной энтомофауны и других нецелевых объектов.
Такие доказательства получают при проведении специальных экспериментов по внутривенным и внутриутробным инъекциям, пероральному введению агента с последующими морфологическими исследованиями подопытных животных. Существуют также тесты на хроническую токсичность и канцерогенность. По свидетельству И. Танада [Tanada, 1984], его учитель Э. Штейнхауз (основоположник патологии насекомых как науки) первым выпил суспензию B. thuringiensis, чтобы доказать безвредность бактерии для человека. В нескольких странах проводились проверки безопасности энтомопатогенных бактерий на добровольцах с последующим тщательным медицинским обследованием, которое не обнаруживало отрицательных последствий для здоровья человека.
Препараты на основе B. thuringiensis, содержащие термостабильный экзотоксин, проявляют большую токсичность, чем не содержащие его. В связи с тем, что термостабильный экзотоксин обладает тератогенным действием на насекомых, а в опытах на лабораторных животных установлено ингибирование синтеза РНК, важное значение приобретают исследования, направленные на выявление мутагенного гонадотоксического, тератогенного и других возможных эффектов воздействия. Есть данные по токсичности турингиензина для легочной ткани крыс [Xu et al., 2014]. Однако следует иметь в виду, что в этих исследованиях содержание
·-экзотоксина намного превышает те концентрации, в которых он поступает в окружающую среду с препаратом.
При безусловно высоком уровне экологической безопасности биологических препаратов их применение не всегда дает стабильный эффект. Это связано со сложностью взаимодействия энтомопатогенов с организмом насекомого-хозяина и с внешней средой. Гибель насекомых, как правило, наступает не моментально, а по истечении определенного периода времени, необходимого для развития заболевания. Кроме того, действующее начало препаратов подвергается разрушительному влиянию ряда абиотических факторов при попадании в окружающую среду. Поэтому важны исследования, способствующие повышению эффективности биопрепаратов при их применении.
В качестве одного из таких подходов, в 1971 г. в Канаде стали использовать хитиназу в качестве фермента, разрушающего молекулы хитина в перитрофической мембране насекомых, для усиления действия препаратов на основе B. thuringiensis [Smirnoff, 1971]. В сибирских условиях подтверждена правомерность такого подхода к энтомопатогенным бактериальным препаратам [Дужак и др., 1995]. Для этого использовали ферментный препарат (ФП) c хитиназной активностью, который добавляли к бактериальным препаратам. Действие хитиназы, содержащейся в ФП, при совместном применении с дендробациллином выражалось в ускорении гибели насекомых. Через сутки после заражения гусениц лугового мотылька суспензией дендробациллина с ФП (в концентрации менее 0,02%) гибель насекомых увеличивалась в 1,5-2 раза. Кроме того, результаты свидетельствовали о возможности существенного снижения концентрации биопрепарата за счет введения ФП. Это же наблюдалось и при оценке влияния лепидоцида с хитиназой в отношении гусениц капустной совки [Овчинникова и др., 2009]. В лабораторных условиях гибель гусениц капустной совки от лепидоцида в концентрации 108 спор/мл была такой же, если снижали на порядок эту концентрацию за счет добавления фермента (табл. 2.11). Результаты полевой оценки представлены в таблице 2.12. В полевых условиях концентрацию лепидоцида уменьшали в 5 раз за счет добавления хитиназы.
Т а б л и ц а 2.11
Влияние смеси лепидоцида с хитиназой на гусениц капустной совки в лабораторных условиях
Вариант опыта
Биологическая эффективность по суткам, %


3
5
7
10

Лепидоцид (108 спор/мл)
26,7
50,0
60,0
70,0

Лепидоцид (107 спор/мл) + хитиназа (0,5 мЕ/мл)
33,3
53,3
60,0
66,7

Хитиназа (0,5 мЕ/мл)
0
0
0
0

НСР 05
11,1
13,0
11,1
12,2




Т а б л и ц а 2.12
Полевая оценка биопрепаратов на посадках капусты сорта Делус против гусениц чешуекрылых вредителей
Вариант опыта
Биологическая эффективность по суткам, %
Урожайность, т/га


3
5
7
10


Лепидоцид
(1,25 · 108 спор/мл)
Совка
Моль
Белянка

·
8,4
44,7
45,3
33,2
29,2
55,6
76,7
57,9
41,7
64,4
86,5
68,8
66,9
74,7
96,2
84,7
42,4

Лепидоцид + хитиназа
(6,25 · 107 спор/мл)
Совка
Моль
Белянка

·
6,8
37,5
29,6
24,0
30,5
58,5
48,7
43,6
53,1
68,9
68,5
63,2
66,1
68,0
89,2
79,6
40,8

Контроль

-
-
-
-
34,8

НСР05 = 4,3
Усиливающая роль хитиназы в отношении инсектицидной активности B. thuringiensis подтверждена зарубежными авторами на примере токсина Cry 1C по отношению к гусеницам полифага Spodoptera littoralis Hb. [Regev et al., 1996]. В присутствии экзогенной хитиназы, Cry 1C в концентрации 3 мкг/мл вызывал такой же токсический эффект, как при использовании токсина в концентрации 20 мкг/мл, но без хитиназы. Кроме того, авторы показали, что хитиназа образовывала поры в перитрофической мембране, полагая, что это и связано с повышением активности токсина.
Из материала, изложенного в главах 1 и 2, следует, что в щелочной среде происходит деградация кристаллического белка B. thuringiensis до наиболее активной фракции. На этом основании мы использовали углекислый натрий как активатор при растворении его в суспензии бактериального препарата с последующей оценкой инсектицидного эффекта. С увеличением концентрации этого вещества от 0,005% до 0,2% и соответствующим повышением рН от 8,5 до 10,5 гибель тестируемых насекомых значительно возрастала [Штерншис, 1995]. Интересно, что активированный раствором Na2CO3 кристалл B. thuringiensis становился токсичным для имаго совок Heliothis virescens F. и Spodoptera exigua Hubn., на которых не оказывал влияния без активации в щелочной среде [Grove et al., 2001].
Для увеличения инсектицидной активности бактериальных препаратов предложено добавлять к спорово-кристаллическому комплексу B. thuringiensis активаторы, усиливающие действие эндотоксина как разобщителя окислительного фосфорилирования и дыхания. Выявленное действие дельта-эндотоксина как разобщителя процессов окислительного фосфорилирования и дыхания с активированием фермента АТФазы послужило основой для выбора некоторых солей для усиления действия эндотоксина [Штерншис, Каменек, 1986]. Увеличение активности фермента наблюдали при добавлении к B. thuringiensis таких используемых в растениеводстве солей как сернокислый магний и сернокислая медь. Добавление этих соединений в концентрациях 0,025-0,05% в лабораторных опытах с подвидами galleriae и dendrolimus привело к увеличению гибели гусениц капустной белянки вдвое на 2-е сутки после заражения и в 4-5 раз для непарного шелкопряда. В полевых опытах против вредителей капусты биологическая эффективность увеличивалась более, чем в 1,5 раза при сохранении урожая на 25% [Штерншис, 1995].
Таким образом, энтомопатогенные бактериальные препараты достаточно широко представлены в сельском и лесном хозяйстве как экологически безопасные средства защиты растений и управления их здоровьем.
Г л а в а 3
ОПТИМИЗАЦИЯ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ БИОПРЕПАРАТОВ ДЛЯ УПРАВЛЕНИЯ ЗДОРОВЬЕМ РАСТЕНИЙ

3.1. Основы полифункционального действия агентов биоконтроля организмов, повреждающих растения

В главе 2 представлен накопленный опыт исследований по применению биопрепаратов на основе антагонистических бацилл для подавления фитопатогенов и на основе энтомопатогенных бацилл для подавления фитофагов в рамках биологического контроля численности вредителей и болезней растений. В данной главе мы уделим основное внимание результатам, отражающим многоцелевое (полифункциональное) влияние бактерий рода Bacillus и препаратов на их основе, что отвечает требованиям управления здоровьем растений. Это означает, что наряду с собственно биологическим контролем фитопатогенов и фитофагов будут рассмотрены связанные с этим эффекты усиления роста и развития растений, индукции системной устойчивости, повышения сопротивляемости растений неблагоприятному влиянию абиотических факторов, влиянию на продуктивность культур. Наличие инсекто-фунгицидного эффекта как одного из аспектов управления здоровьем растений будет показано на примере B. thuringiensis.
Прежде всего остановимся на обсуждении исследований, отражающих основы полифункционального действия бацилл в рамках управления здоровьем растений. В последние годы все больше внимания при оценке механизма действия бактерий рода Bacillus уделяют образованию бациллами биологически активных веществ и ферментов. Первоочередной интерес представляет продукция циклических липопептидов и хитиназ, отвечающих и за антагонистический, и за инсектицидный эффекты бактерий.
Продукция липопептидов бактериями рода Bacillus. Достаточно большое количество работ, особенно в последнее десятилетие, посвящено образованию антагонистическими и энтомопатогенными бактериями рода Bacillus липопептидных циклических антибиотиков, ответственных и за прямой антагонистический эффект, и за индукцию устойчивости растения к болезням и вредителям [Lee et al., 2007; Ongena et al., 2007; Li et al., 2008; Kim et al., 2010; Yanez-Mendizabal et al., 2012; Mnif et al., 2015, 2016]. Липопептиды содержат в молекуле пептидную цепь, с которой ковалентно связан остаток жирной кислоты. Молекулы известных липопептидов содержат от 4 до 16 аминокислотных остатков линейных пептидных цепей. Липопептиды включают группы (семейства) сурфактинов, итуринов и фенгицинов [Baruzzi et al., 2011]. Сурфактины (сурфактин, лихенизины и пумилацидины) продуцируются такими бациллами как B. subtilis, B licheniformis, B. natto, B. pumilis и содержат циклические гептапептиды, образующие лактоновые мостики с
·-гидрокси -жирными кислотами. Длина углеродной цепи жирных кислот от С13 до С18. Группа итуринов состоит из А, С, Е и D изоформ, бацилломицина D, F и L и микосубтилина. Все они содержат циклический гептапептид, ацилированный
·-амино -жирными кислотами с длиной цепи С14 – С16. Фенгицины, включая плипастатин как стереоизомер, состоят из
·-гидрокси -жирных кислот, связанных с N-концом декапептида [Stein, 2005].
Связь структуры и функций липопептидов выражается разной степенью антагонистического действия в зависимости от патогена, хотя в целом все они вызывают возникновение пор в клеточных мембранах.
Циклические липопептиды, относящиеся к биосурфактантам, образуют B. subtilis [Мелентьев, Кузьмина, 2005; Kim et al., 2010; Ongena et al., 2007; Yunez-Mendizabal et al., 2012], B. amyloliquefaciens [Lee et al., 2007], B. licheniformis [Li et al., 2008], B. thuringiensis [Kim et al., 2004].
B. subtilis. В зависимости от штамма B. subtilis и мишени-фитопатогена большую или меньшую антагонистическую активность проявляли продуцируемые бактериями итурин А, фенгицин или сурфактин А. Все эти липопептиды действуют на фосфолипиды и способны формировать поры в клеточных мембранах грибов и бактерий [Avis, 2007]. Специфические механизмы образования пор различны для липопептидов разных семейств, что обуславливает их разную активность [Etchegaray et al. 2008; Falardeau et al. 2013]. Выяснилось, что, как правило, штаммы с более высоким содержанием липопептидных антибиотиков обладают более высокой антагонистической активностью и спектром действия. Так, штамм B. subtilis CMB32 продуцирует все названные липопептиды, которые ответственны за антифунгальную активность в отношении Colletotrichum gloeosporioides, вызывающего антракноз у растений [Kim et al., 2010]. Итурин, выделенный из штамма B. subtilis KS03, in vitro ингибировал активность возбудителя антракноза Gloeosporium gloeosporioides [Cho et al., 2003]. В модельном опыте по инфицированию корней арабидопсиса бактерией Pseudomonas syringae. B. subtilis образовывал биопленки, продуцирующие сурфактин, который ингибировал фитопатогенную бактерию [Bais et al., 2004]. При изучении антигрибных соединений, продуцируемых штаммом B. subtilis ИБ-54 -антагониста почвенных микромицетов, авторы пришли к выводу, что антагонистическая активность бациллы обусловлена способностью синтезировать липопептиды, близкие к сурфактинам и итуринам [Мелентьев и др., 2010].
Показано, что при определенном подборе питательной среды при размножении бактерий наиболее активным становится сурфактин [Ali et al., 2010], в другом случае добивались увеличения выхода итурина [Mizumoto et al., 2007]. Выход сурфактинов B. subtilis повышали добавлением в питательную среду сульфатов магния и железа [Abushady et al., 2005].
Имеются сведения, что фенгицин, продуцируемый выделенным из почвы штаммом D1/2 ингибирует Fusarium graminearium - возбудителя болезни кукурузы и пшеницы [Chan et al., 2009]. Штамм GA1 образует фенгицин, содержание которого коррелирует с фунгицидной активностью против серой гнили на яблоне [Toure et al., 2004]. Бацилломицин и фенгицин штамма UMAF
·

Приложенные файлы

  • doc 7046853
    Размер файла: 2 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий