Установлено, что выделенные фруктозаны состоят из фруктофуранозных остатков, связанных между собой ?-(2>1) связью типа инулина.

НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК КЫРГЫЗСКОЙ РЕСПУБЛИКИ
ИННОВАЦИОННЫЙ ЦЕНТР ФИТОТЕХНОЛОГИЙ






На правах рукописи
УДК 547.917





БАКИРОВА ГУЛЬМИРА АБДЫГУЛОВНА



ГЛЮКОМАННАНЫ И ФРУКТОЗАНЫ EREMURUS CRISTATUS, ИХ СТРУКТУРА И СВОЙСТВА

Специальность: 02.00.03 – органическая химия



ДИССЕРТАЦИЯ
на соискание ученой степени
кандидата химических наук






Научный руководитель:
д.х.н. Турдумамбетов К.








БИШКЕК – 2016
ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ ______________________________________________________5
ГЛАВА І ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР__________________________________10
1.1. Распространение глюкоманнанов и фруктозанов____________________10
1.2.Выделение, очистка и разделение глюкоманнанов и фруктозанов______11
1.3. Физико-химические свойства глюкоманнанов и фруктозанов_________14
1.4. Примеры строения и свойств глюкоманнанов и фруктозанов__________37
1.5. Применение глюкоманнанов и фруктозанов________________________42
ГЛАВА ІІ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ__________________________46
ГЛАВА ІІІ ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ___________________________66
3.1. Общая характеристика углеводного состава растений рода Eremurus, произрастающих в Кыргызстане____________________________________67
3.2. Общая характеристика полисахаридов из корней растений E. Cristatus__75
3.3. Общая характеристика полисахаридов из надземной части растений
E. Cristatus___________________________________________________78
3.4. Изучение строения глюкоманнана из корней растений E. Cristatus____79
а) ИК-спектроскопия глюкоманнана из фракции Ф-2;__________________81
б) периодатное окисление глюкоманнана из фракции Ф-2;_____________82
в) метилирование глюкоманнана из фракции Ф-2;_____________________85
г) анализ спектра 13С-ЯМР глюкоманнана из фракции Ф-2;____________86
д) частичный кислотный гидролиз глюкоманнана из фракции Ф-2______88
3.5. Изучение структуры фруктозана фракции Ф-2 из корней растений E. Cristatus____________________________________________________________90
3.6. Пектиновые вещества из корней растений E. Cristatus_________________98
3.7. Изучение строения глюкоманнана из надземной части растений
E. Cristatus____________________________________________________ 102
3.8. Усовершенствование способа получения глюкоманнана из растений E. Cristatus __________________________________________________________107
3.9. Усовершенствование способа получения D-маннозы из растений E. Cristatus _________________________________________________________113
3.10. Острая токсичность глюкоманнана из растений E. Cristatus________120
ЗАКЛЮЧЕНИЕ_____________________________________________________________ 122
ВЫВОДЫ__________________________________________________________________125
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ_________________________________126
ПРИЛОЖЕНИЯ_____________________________________________________________ 141
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ

Е. – Эремурус
ВРПС – водорастворимый полисахарид
МС - моносахариды
ОС – олигосахариды
ПВ – пектиновые вещества
ГЦ – гемицеллюлоза
Manp – маннопиранозил
Glсp – глюкопиранозил
Fruf - фруктофуранозил
к - корни
н/ч – надземная часть
ТСХ – тонкослойная хроматография
БХ – бумажная хроматография
Ф – фракция
ММ – молекулярная масса
СП – степень полимеризации
В – восстанавливающий конец
Н – невосстанавливающий конец
Gal – галактоза
Ara – арабиноза
Xyl – ксилоза
Rham – рамноза
Glc – глюкоза
Gal. Ua – галактуроновая кислота

ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы диссертации.
Полисахариды растительного происхождения, в том числе глюкоманнаны, фруктозаны и пектины, являются важными биополимерами, входят в состав практически всех растений и выполняют множество различных жизненно важных функций, характеризуются широким спектром биологического действия. Полисахариды являются перспективным сырьем для фармацевтической, медицинской, пищевой, микробиологической, химической и полиграфической промышленности. Они могут стать дополнительным источником получения новых лекарственных средств, обладающих антибиотической, противовирусной, противоопухолевой активностью (Р.К.Рахманбердыева, 2012, В.Д.Щербухин, 2009).
Синтетический путь получения глюкоманнанов, фруктозанов и пектинов требует использования дорогостоящих химических реактивов. В связи с этим весьма актуальной является задача нахождения среди дикорастущих лекарственных растений, произрастающих на территории Кыргызстана, тех, которые являлись бы легкодоступными, дешевыми и ежегодно возобновляемыми и содержали бы большое количество углеводов.
Наиболее богатыми глюкоманнан - и фруктозансодержащими растениями являются растения рода Eremurus.
Изучению биологических, физиологических и химических свойств растений рода Eremurus были посвящены исследования ряда ученых. Так, впервые изучение химических свойств растений рода Eremurus было начато под руководством Б.Н. Степаненко, затем продолжено З.Ф.Исмаиловым и Д.А.Рахимовым (1995). Свойства, строение и динамика накопления эремурана были изучены В.Д. Шербухиным (1971) и Р.К. Рахманбердыевой (2003). Ими же были намечены пути практического использования этих растений.
Настоящая работа посвящена исследованию углеводного состава растений E. Cristatus. Растения E. Cristatus являются одним из интересных и перспективных сырьевых источников, так как наиболее богаты по содержанию в нем водорастворимых полисахаридов – глюкоманнана, фруктозана и пектиновых веществ.
Нами в результате предварительного изучения количественного состава углеводов было установлено, что корни этих растений наиболее богаты олиго - и полисахаридами, в связи с чем особый интерес представляло проведение работ по изучению полисахаридов, однородных фракций глюкоманнанов, фруктозанов и пектинов.
Растения E. Cristatus – сорные, двухлетние растения высотой 50 – 70 см, образующие сплошные заросли на холмах, пустырях, предгорьях и пастбищах. Расширение лекарственной растительной сырьевой базы путем выявления нового перспективного лекарственного растительного сырья, произрастающего на территории Кыргызстана, которое являлось бы дикорастущим, легкодоступным, дешевым, быстро возобновляемым, широкораспространенным, наиболее богатым по содержанию углеводов и пригодным для получения физиологически активных веществ, а именно: глюкоманнанов и фруктозанов, Д – маннозы, пектиновых веществ и определяет актуальность данного научного исследования.
Cвязь темы диссертации с планом научно-исследовательских работ.
Диссертационная работа выполнена в лаборатории химии и технологии растительных веществ Института химии и химической технологии, лаборатории химии и технологии углеводов Инновационного центра фитотехнологий НАН КР в соответствии с планом научно-исследовательских работ.
Цель исследования – выявление нового перспективного сырья из растений рода Eremurus с высоким содержанием глюкоманнанов и фруктозанов, выделение их в нативном виде, комплексное химическое изучение состава и свойств, установление структурных особенностей и нетоксичности глюкоманнана. В связи с этим были поставлены следующие основные задачи:
- изучение качественного и количественного состава углеводов растений рода Eremurus;
- химическое изучение изменения содержания углеводов в зависимости от места произрастания, фазы развития, срока хранения, а также исследуемого органа растений E. Cristatus;
- установление структуры глюкоманнанов, фруктозанов, пектиновых веществ с использованием современных физико-химических методов анализа;
- усовершенствование способов получения глюкоманнанов и D – маннозы из растений E. Cristatus;
- изучение острой токсичности глюкоманнана.
Научная новизна полученных результатов.
Дана химическая характеристика углеводного состава растений рода Eremurus, произрастающих на территории Кыргызстана. В результате проведенных исследований была экспериментально подтверждена целесообразность использования растений E. Cristatus как источника углеводов. Проведено изучение динамики накопления углеводов в подземных и надземных органах растений E. Cristatus по периодам вегетации и определен их качественный и количественный моносахаридный состав. Приведены новые сведения о составе углеводов растений E. Cristatus. Доказана структура глюкоманнанов, фруктозанов, пектиновых веществ, изучены их физико-химические свойства и особенности структуры. Установлено, что глюкоманнаны растений E. Cristatus состоят из линейной цепи
·-(14) связанных остатков D-глюкопиранозы и D-маннопиранозы.
Впервые нами были выделены фруктозаны из корней растений E. Cristatus, исследована их структура. Установлено, что выделенные фруктозаны состоят из фруктофуранозных остатков, связанных между собой
·-(21) связью типа инулина. Впервые нами были выделены пектиновые вещества из корней растений E. Cristatus, изучено их содержание в зависимости от фазы развития и моносахаридный состав, установлено наличие
·-(14) галактопиранозных связей. Установлено, что выделенные однородные глюкоманнаны из корней растений E. Cristatus по результатам частичного гидролиза состоят из набора сахаров, т.е. из дисахаридов, трисахаридов и тетрасахаридов.
Практическая значимость полученных результатов.
Выявлен новый источник сырья для получения глюкоманнана и D-маннозы (растение E. Cristatus). Разработаны усовершенствованные способы получения глюкоманнана и D-маннозы из растений E. Cristatus. Усовершенствованные способы получения глюкоманнана и D-маннозы имеют ряд преимуществ по сравнению с ранее известными, заключающихся в повышении чистоты и выхода целевого продукта, упрощении, ускорении и исключении из технологического процесса химических реактивов и растворителей. Предлагаемые способы получения глюкоманнана и D-маннозы позволяют использовать дешевое местное растительное сырье и исключают применение дорогостоящих реактивов.
На усовершенствованный способ получения D-маннозы из растений E. Cristatus получен Патент КР № 1001.
У глюкоманнана, полученного из корней растений E. Cristatus, обнаружена нетоксичность. Нетоксичность является предпосылкой для разработки на его основе противомикробных препаратов для нужд медицины. Это подтверждает перспективность дальнейшего изучения глюкоманнана в этом направлении. Рекомендуется использовать глюкоманнан из растений E. Cristatus в медицинской, фармацевтической, микробиологической, пищевой и других отраслях промышленности.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
- результаты химического изучения изменения содержания углеводов в растениях E. Cristatus зависимости от места произрастания, фазы развития, срока хранения, а также исследуемого органа;
- результаты современных физико-химических методов анализа определения химического состава глюкоманнанов, фруктозанов, пектиновых веществ и установления их структуры;
- усовершенствованные способы получения глюкоманнанов и D – маннозы из растений E. Cristatus, имеющие ряд преимуществ перед ранее известными способами, заключающихся в повышении чистоты и выхода целевого продукта, упрощении, ускорении и исключении из технологического процесса химических реактивов и растворителей.
Личный вклад соискателя заключается в сборе и анализе обширного литературного материала по составу, физико-химическим свойствам и применению растений рода Eremurus, в проведении основной части экспериментальных работ, анализе, интерпретации, обобщении полученных результатов и оформлении в виде диссертации с соответствующими выводами.
Апробация результатов диссертации. Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на: 3-научно-практической конференции «Проблемы образования и науки», посвященной 2200-летию Кыргызской государственности (Нарын. госуниверситет, г. Нарын, 2004), І Международной научно-практической конференции «Перспективы развития научно-инновационной деятельности» (НАН КР, Бишкек, 2008), Международной научной конференции «Актуальные проблемы механики и горного машиноведения, развития науки и интеграции ВУЗов» (Кырг.- узб. университет, г. Ош, 2009), ІІ Международной научно-практической конференции «Перспективы развития научно-инновационной деятельности» (НАН КР, г. Бишкек, 2010).
Опубликованность результатов. По материалам диссертационной работы опубликованы 1 монография, 9 научных статей и 2 тезиса докладов, получен Патент Кыргызской Республики № 1001 на «Способ получения
·- D-маннозы».
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, трех глав, заключения, выводов, списка использованных источников, включающего 147 наименований. Работа изложена на 140 страницах компьютерного текста, содержит 24 рисунка, 20 таблиц, 2 приложения.
ГЛАВА І ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1.1. Распространение глюкоманнанов и фруктозанов

О том, какую роль играют полисахариды в жизнедеятельности живых организмов давно и хорошо известно. Поэтому большое значение в последнее время приобретают работы, связанные с поиском растительного материала с высоким содержанием полисахаридов
Полисахариды растительного происхождения являются одним из основных органических соединений, имеют большое значение для человеческого организма (1, 2(.
Глюкоманнаны или полисахариды состоят из остатков маннозы и глюкозы, а фруктозаны – из остатков фруктозы и глюкозы.
Эти соединения обнаружены в растениях различных видов семейств: Liliаceae – лилейных, Araceae - ароидных, Orchideacae - орхидных, Iridoceae - ирисовых и т.д., а фруктозаны – преимущественно в растениях семейства Сложноцветных (Compositae), но также встречаются и в семействе Liliаceae - Лилейных, Amarullidacuае - Амаруллисовых, Gramineae - Злаковых (3( и т.д.
Содержание глюкоманнанов и фруктозанов в растениях разных видов варьируется в широких пределах. Они относятся к единственным запасным полисахаридам и содержатся в растениях наряду с фруктозаном и крахмалом. Однако до сих пор не выяснена причина их одновременного присутствия. Наиболее богатым по содержанию глюкоманнанов являются растения рода Eremurus (4(.
Растения рода Eremurus широко распространены по всему миру. На территории СНГ произрастает около 50 видов этих растений. Только на территории нашей Республики их насчитывается до 30 % от общего видового количества.
Eremurus произрастают повсеместно по всей территории республики, но преимущественно на юге, особенно на холмах, пастбищах, пустырях и предгорьях на высоте от 700- 2800 м над уровнем моря (4(.
Расширение ассортимента цветочных культур в озеленении городов и населенных пунктов является одним из путей повышения их привлекательности. Многие виды эремурусов относятся к декоративным растениям и потому их можно использовать для озеленения. В природной флоре Кыргызстана встречается 18 видов эремурусов. В коллекции растений природной флоры Кыргызстана Ботанического сада НАН КР насчитывается и выращивается 10 видов эремурусов, в том числе E. Cristatus [5].

1.2. Выделение, очистка и разделение глюкоманнанов и фруктозанов

Изучение углеводного состава растительного сырья является важной составной частью современного исследовательского анализа. В настоящее время известно много физико-химических методов количественного выделения и определения углеводного состава.
Авторами работы [6] определены группы полисахаридов: моно-, олиго-, водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества и гемицеллюлозы А и Б и их количественный и качественный моносахаридный состав при исследовании шести видов растений рода Эремурус.
Авторами работы [7] были выделены глюкоманнаны и фруктозаны из клубней растений эремурусов и установлены оптимальные сроки их выделения. Установлена динамика содержания запасных углеводов у Эремурусов (глюкоманнанов у Эремуруса гиссарского и фруктозанов у Эремуруса мощного) в течение годичного цикла развития. Максимальное накопление запасных углеводов приходится на фазу плодоношения и отмирания надземных органов, минимальное – на период выхода из состояния зимнего покоя и фазу формирования розетки листьев.
Главной задачей исследования является выделение глюкоманнанов и фруктозанов из растительного материала и получение их в нативном состоянии. Выделение включает в себя несколько стадий: экстракцию исследуемого сырья, осаждение и очистку полисахаридов от посторонних примесей неуглеводного характера.
Получение их в нативном виде из растительного сырья - сложная задача и требует осторожного подхода к выбору метода. Как известно, от способа выделения каждого полисахарида (в частности, глюкоманнана и фруктозана) зависят его свойства и биологическая активность. Первоначальной стадией выделения глюкоманнана и фруктозана является обработка растительного сырья кипящим этанолом, метанолом или смесью метанола с хлороформом. Это приводит к дезактивации ферментов, деградирующих полисахаридов, а также к удалению липидов, красящих веществ, частично протеинов моно - и олигосахаридов и неорганических примесей (8-11(.
В работе (12( приведены результаты исследований по определению групп полисахаридов, их количественному и качественному моносахаридному составу, изучению динамики содержания полисахаридов в разные фазы развития.
Из луковиц пролески Seila sibirica (13( выделен путем экстракции горячей водой и очищен амилолизом и хроматографией на ДЕАЕ – целлюлозе (после удаления фруктана мягким кислотным гидролизом) ацетилированный глюкоманнан, содержащий D-маннозу, D-глюкозу и ацетильные группы в соотношении 7,7:1:2,4. По данным метилирования и спектров 13С-ЯМР, молекулы полисахарида представляют собой линейные цепи, построенные из 14 связанных остатков
·-D-маннопиранозы и
·-D-глюкопиранозы, причем ацетильные группы, по-видимому, распределены по всем возможным гидроксильным группам моносахаридных остатков.
Из корней растений мать - и мачехи и Лопуха войлочного методом последовательной экстракции водой авторами статьи (14( выделено по четыре полисахаридных фракции. Моносахариды были идентифицированы после гидролиза трифторуксусной кислотой с помощью бумажной хроматографии.
Обычно выделение глюкоманнанов осуществляется путем экстракции измельченного сырья водой (15(, диметилсульфоксидом или щелочью (16( с последующим их осаждением метанолом или этиловым спиртом (17].
Полученные глюкоманнан и фруктозан бывают обычно загрязнены белковыми и неуглеводными низкомолекулярными примесями. Существует много способов очистки глюкоманнанов и фруктозанов от сопутствующих белковых веществ. В одном из этих методов используется 5-10 %-ный водный раствор трихлоруксусной кислоты (18(, при этом белок отделяется от растворенного глюкоманнана и выпадает в осадок. Недостатком этого метода является кислая среда, приводящая к деградации как самого глюкоманнана, так и кислотно-лабильных групп. Одним из мягких способов, применяемых для удаления остаточного белка сырья, является метод севага (19(. К числу недостатков метода относится многократность повторения операций, приводящая к значительным потерям вещества.
Различающиеся по молекулярному весу белок, глюкоманнан и фруктозан могут быть разделены с помощью гель-фильтрации на сефадексе и биогеле (20(, но при этом одновременно удаляются и неорганические примеси.
Простое осаждение глюкоманнанов и фруктозанов не приводит к разделению смеси полисахаридов. Широкое применение при исследовании глюкоманнанов получило фракционирование раствором Фелинга (21(, при этом осаждаются полисахариды, содержащие высокий процент маннозных остатков, в виде плохо растворимых медных комплексов.
В исследовании структуры глюкоманнанов и фруктозанов важным этапом является разделение смеси полисахаридов на отдельные гомогенные фракции. Наиболее простым методом является дробное осаждение спиртом (22(. Осаждение проводится из водного раствора полисахаридов. Другой способ разделения смеси полисахаридов основывается на использовании
свойства глюкоманнанов и фруктозанов образовывать комплексы с некоторыми соединениями (например: цетилтриметиламмоний бромидом, солями меди - фелинговой жидкостью, СиСl2, СиSO4 и др.). Щелочнорастворимые глюкоманнаны разделяют по методу Мейера (23(, используя раствор гидроокиси бария.
Более результативным методом для разделения кислых и нейтральных полисахаридов оказался способ применения ионнообменной хроматографии. Для этих целей обычно используют полимеры на основе целлюлозы и в первую очередь – диэтиламиноэтилцеллюлозу (24(. Электрофорез также используется для разделения полисахаридов и для контроля гомогенности испытуемого вещества. В работах (24, 25( приведены методы проведения электрофореза глюкоманнанов на стекловолокнистой бумаге в щелочной среде. Метод ультрацентрифугирования используется как для определения гомогенности глюкоманнанов и фруктозанов, так и для определения молекулярной массы, которую можно определить и гель-хроматографией (17(.

1.3. Физико-химические свойства глюкоманнанов и фруктозанов

Глюкоманнаны, полученные из растительного сырья, представляют собой аморфные порошки белого или серого цвета в зависимости от источника сырья и способа очистки, без запаха. Хорошо растворяются в воде и в водных растворах щелочи, а также в некоторых органических растворителях: формамиде, диметилсульфоксиде, муравьиной кислоте, образуя вязкие, коллоидные растворы.
Глюкоманнаны высших растений являются левовращающими, так как их молекулы связаны Я - связями.
Для осаждения глюкоманнанов можно использовать растворы солей меди (8,9( и соляной или уксусной кислот.
К существенным недостаткам этого метода относятся сильно - щелочная или кислая среда. Очищенный глюкоманнан становится менее растворимым в воде. Причем одни авторы (9( объясняют уменьшение растворимости в воде конформацией гексозных остатков, а другие тем, что при действии щелочей омыляются щелочелабильные группы С (ацетильные), вследствии чего глюкоманнан теряет растворимость в воде. Для фракционирования щелочорастворимых глюкоманнанов, гемицеллюлоз Мейер (23( предложил использовать раствор Ва (ОН)2. Образование бариевых комплексов, по-видимому, связано с упомянутыми выше свойствами цис-гидроксильных групп образовывать комплексы. Эти комплексы легко растворяются в разбавленных кислотах и воде, но не растворяются в органических растворителях. Глюкоманнаны, образующие обратные комплексы, можно фракционировать с помощью четвертичных аммониевых солей типа цетовлона (цетилтриметиламмоний бромида) (19]. Осаждение происходит в результате взаимодействия цетовлона с обратным комплексом, образованным за счет цис-гликольных групп монозных остатков.
Для разделения глюкоманнанов широко используется ионообменная хроматография.
Аниониты, полученные модификацией целлюлозы (ДЭАЭ - целлюлоза), легко и прочно адсорбируют кислые полисахариды при рН 5-6 и, в зависимости от содержания кислотных групп, вымываются щелочными и кислыми растворами (23(. Нейтральные полисахариды почти не содержатся в солевой форме при рН 5-6, но хорошо адсорбируются в основной форме при вымывании обратным буфером (21(.
Метод гель-фильтрации стали применять для препаративного фракционирования полисахаридов. При сильном различии в молекулярных весах имеет место достаточно хорошее разделение смеси полисахаридов на сефадексах и биогелях (16,26(. Этот метод очень широко используется и в исследовании глюкоманнанов (26(.
Преимущество метода заключается в том, что благодаря специально подобранным условиям гель-фильтрации можно вычислить средневесовой молекулярный вес. Электрофорез до недавнего времени почти не применялся для очистки и фракционирования глюкоманнанов, хотя в литературе имеются сведения об электрофорезе нейтральных полисахаридов (25(.
Сведения об основных свойствах глюкоманнанов обобщены Степаненко Б.Н. и др. и изложены в работах (8,9(. Из водного раствора глюкоманнаны осаждаются смешивающимися с водой растворителями (этанол, метанол, ацетон), раствором Фелинга, борной кислотой и солями тяжелых металлов. Следует отметить, что глюкоманнаны обладают очень слабой редуцирующей способностью. Большинство глюкоманнанов не дают окрашивания с йодом. Однако отдельные полисахариды окрашиваются йодом в красно-фиолетовый цвет (15(. Природа указанной реакции пока не выяснена.
В табл. 1.1. приведены физико-химические свойства известных в литературе глюкоманнанов. Из данных таблицы видно, что глюкоманнаны преимущественно содержатся в подземных органах растений, за исключением Aloe и семян ирисовых. Они отличаются по соотношению сахаров и по молекулярной массе.
Водорастворимые глюкоманнаны из корней E. ИАЭ и Е. Zangezuricus содержат 28,8; 69,0 и 2,2% (E. ИАЭ) и 22,6; 74,8 и 2,6% (E. Z.) D-глюкозы, Д-маннозы и ацетилгруппы, соответственно [59]. Их ИК-спектры были идентичными и указывали на наличие
·-14 гликозидной связи и эфирных групп карбонила. Спектры 13С-ЯМР-спектроскопии показали, что эти полисахариды являются линейными и частично ацетилированными.
Водорастворимый глюкоманнан из корней Е. Zangezuricus [60] содержит D-глюкозу, D-маннозу и ацетилгруппы в молярном соотношении 1:2,8:0,38. Глюкоманнан Е. Zangezuricus имеет следующие параметры: [
·]Д = -37,5о; [ОП] = 3,73 дл/г и М.в. = 151 кДа.
Фруктозаны представляют собой полимерные молекулы, построенные из остатков Д-фруктозы (61(, находящихся в фуранозной форме. Различают два типа связей фруктозанов высших растений: типа инулина и типа левана. В инулине остатки фруктозы связаны (- (2(1) (І) связями, а в структуре левана - (-(2(6) (ІІ) связями:
Таблица 1.1 – Характеристика некоторых глюкоманнанов



Семейство и род растений


Орган растения
Соот-
ноше-
ние
моно-
меров
glc : маn
Значение [(]Д, град.


СП и
МВ


Тип связи
Литература





Глюкоманнан
Метил производ
ный




1
2
3
4
5
6
7
8

Araceae
Amorph.ophalas. oncophillus

Клубни

1: 2

-21,3(н2о)

-41(cнсl3)

-


· - 14

27

Konjak
----//-----
2: 3
-38 (н2о)
-19 (снсl3)
-

· - 14
4, 28


Arum korolkovi

----//-----

1: 1,6

-56 (н2о)

-
27000
Разв.при
16
маннозы
29

maсulatum

----//-----

2:3

-
-
-
Разв.при
С2С6ман-
нозы
4

orientable

----//-----

1: 3,1

-
-
-
----//-----
4, 16

Nareissus tazetta

луковица

1: 5,7

-24,3(н2о)

-
119000
----//-----

30, 31

Licoris radiata

----//-----

1: 4

-
-30,4(снсl3)
СП 49


· - 14

10, 32

L. squamigera

----//-----

7: 2

-23,1(н2о)

-
180000


· - 14

12, 33

Liliaceae
Lilium auratum


луковица


3: 8


-37,5(с.0,7н2о)


-

35700


Разв.
при С,С3,С6 маннозы

26

L. candium

----//-----

1:1,83

-25 (с.0,4 н2о)

--
-
----//-----
7,34

L. umbellatum

----//-----

1: 2

-26 (с.0,4 н2о)

-20(снсl3)

СП 27

----//-----

7,34

L. henryii

----//-----

1:1,93

-21(с.0,5 н2о)

-23(снсl3)

СП 75

----//-----

7,34

Scylla nonsripta

----//-----

1: 1,3

-24 (н2о)

-18(снсl3)
-
----//-----

35

S. puschkinioi

----//-----

1: 8,7

-15 (н2о)

-
-
----//-----

36

Aloe vera

----//-----

1: 1

-
-
-

· – 14

37

А. barbadensis

листья
1: 22

-
10,2(снсl3)
1,5.104


· – 14

38

А. officinalis

семена
1: 1

-
-
СП 800


· – 14

39

Cardyline indivise

листья

1: 1,5

-
-
СП 32


· – 14

3,4

Eremurus regeli

листья

1: 2

-32,5 (NaOH)

-37(снсl3)
-
138000


· – 14

15,18

E. altaicus

семена

1: 2,6

-41,7 (н2о)

16(снсl3)

108000


· – 14

40

E. comosus

древесина

1: 3,2

-39,6(с.0,4н2о)

-
63000


· – 14

41

E. inderensis

клубни

1: 3,5

-
-
138000


· – 14

40,42

E. hissaricus

----//-----

1: 1,6

-49 (с.0,42н2о)

-
263000


· – 14

43, 44

E. fuscus

----//-----

1:1,26

-48 (с.0,4 н2о)

-
158000


· – 14

45,46

E. tadschicorum

----//-----

1: 2

-
--
-

· – 14

40

E. turkes tamicus

----//-----

1:1,8

-36 (н2о)

-
97000

· – 14

40, 47

E. spectabilis

----//-----

1: 2,9

-32,9 (NaOH)

-
-152000

· – 14

48










Iridacene
Iris orcholeula


семена

1: 1


-25 (2н.NaOH)


-9 (снсl3)


-

Разв.пр1
С2С6манн

4,49

Sibirica

----//-----

1: 1

-26 (2н.NaOH)


-9 (снсl3)

-
----//-----
4,49

Soqdiana

----//-----

1:1,2

-
-
-
----//-----

50

Оrchidaceae
Руски солеп


клубни

1: 3,8


-



-


· – 14

51

Orchismilitarus

----//-----

1: 3

-40 (н2о)

-
-

· – 14

52

O. mascula

----//-----

1: 3

-40 (н2о)

-
-
----//-----

53

O.hircina

----//-----

1: 3

-40 (н2о)

--
-
----//-----

53

O. species

----//-----

1: 3

-40 (н2о)

-
-
----//-----

53

Сирийский салеп

----//-----

1:1,29

-39 (н2о)

-
-
----//-----

53

Polugonatum
P. falkatum


корневища

1: 2


-29 (с.0,5 н2о)


-

410000


----//-----


20,54

P. odaratum
----//-----

1: 3

-29 (с.0,3 н2о)

-
500000-
----//-----

54

P. roseum

----//-----

-
-34,6(н2о)

-
-
----//-----

55

P. polyanteum

----//-----

1:10,2


-15(ацет.)

-
----//-----

56

P. sewerzowii

----//-----

1:15,4

-
-
-

· – 14

57,58

Fruf 2
· [6 Fruf 2]n
· 6 Fruf Glcp 1
· [2 Fruf 1]n
· 2 Fruf
(ІІ) (І)
Полисахаридная цепь на восстанавливающем конце заканчивается остатком
·-D-глюкопиранозы, присоединенная 12 связью к остатку D-фруктофуранозы.
В природе встречаются молекулы фруктозанов с длиной цепочки около 200 моносахаридных звеньев (63(. Структурные исследования выявили, что фруктозаны в водных средах имеют геликальную структуру (64( и имеют две формы: (-модификация, которая обладает слабой растворимостью в воде и (-модификация, которая легко растворяется в воде. (-модификация при длительном хранении преобразуется в кристаллическую (-форму. Они оба обладают разной оптической активностью.
Химическая структура фруктозанов (61,63( рассматривается как структурное свойство сахарозы, от которой они и ведут свое начало.
Инулин относится к классу фруктозанов, состоящих из (-(2(1) связанных фруктофуранозных частей с терминальным глюкозным остатком. Наименьшим “инулином” является трисахарид I-кестоза. Инулины, как правило, имеют степень полимеризации 30-35 (линейные). В природе встречаются инулины со степенью полимеризации равной 200 (64(.
Низшей единицей левана является трисахарид 6-кестоза, который связан с несколькими остатками фруктозы, (-(2(6) связями с концевыми остатками глюкозы. Леван высших растений имеет степень полимеризации 260-314, во много раз превышающую степень полимеризации инулина (64(.
Фруктозаны, благодаря наличию большого количества свободных гидроксильных групп, хорошо растворяются в воде, но плохо в диметилсульфоксиде, формамиде и практически не растворяются в спирте, ацетоне и эфире. Фруктозаны обычно выделяют в виде порошка. Они имеют отрицательный угол удельного вращения, что объясняется наличием (- гликозидной связи между моносахаридами.
В одном растении могут одновременно существовать фруктозаны разного строения. Данные о размере колец, степени разветвления углеводной цепи, характере и конфигурации глюкозидной связи устанавливаются с помощью методов метилирования и периодатного окисления.
Авторами работы (65( были изучены химическими методами полисахариды из подземной части Аllium Sativum, а также основываясь на данных 13С-ЯМР-спектроскопии инулина и левана был изучен фруктозан (ІІІ) в одной полимерной цепи, состоящей из (-(2(1) и (-(2(6) фруктофуранозных остатков:

·-D-Fruf-2 [-6-
·-D-Fruf-2-]n - [-1-
·-D-Fruf-2-]n – 1-
·-D-Fruf
6 2

·-
·-D-Fruf 1-
·-D-Glcp

(ІІІ)
Эти фруктозаны являются запасными полисахаридами растений и находятся в растениях вместе с другими полисахаридами. Обширное изложение сведений по фруктозанам приведено в работе (66(.
В работе (67( указаны сведения о свойствах, структуре, биологическом значении, путях биосинтеза, разрушении и распространении фруктозанов.
Фруктозаны хорошо растворяются в горячей воде, но нерастворимы в спирте, не имеют редуцирующую способность, легко гидролизуются кислотами.
Для выделения фруктозанов используются горячая вода, метанол или этанол разных концентраций. Для разделения фруктозанов различного молекулярного веса используют методы тонкослойной (ТСХ) и бумажной хроматографии, а также гель-фильтрацию на сефадексах и колоночную хроматографию на различных сорбентах и др.
Многолетние исследования показали, что многие растения в качестве главного резервного вещества содержат полисахариды, и, в первую очередь, фруктозаны (61,65,67( и глюкоманнаны (8,9,10,29(.
В расшифровке строения некоторых уже известных фруктозанов и глюкоманнанов ученые многих стран продвинулись довольно далеко, в связи с чем был открыт ряд новых представителей этой группы. Под установлением строения полисахаридов подразумевается проведение следующих исследований:
1. установление качественного и количественного мономерного состава;
2. определение характера и конфигурации гликозидных связей;
3. определение размера окисных колец в моносахаридных остатках;
4. определение степени разветвленности углеводной цепи и мест присоединения боковых цепей к основной;
5. установление природы концевых моносахаридных остатков;
6. изучение характера и места расположения различных остатков неуглеводной природы (например, ацетатов);
7. определение степени полимеризации, молекулярного веса и степени дисперсности;
8. определение числа повторяющихся звеньев с установлением строения каждого из них.
Изучение состава и строения выделенного глюкоманнана прежде всего необходимо начать с проверки его гомогенности. Гомогенность глюкоманнанов определяется методами ультроцентрифугирования, электрофореза и гель-фильтрации на биогелях и сефадексах (20,54(.
Полисахариды считаются индивидуальными соединениями, если после применения методов очистки не изменяется их мономерный состав и физико-химические свойства (удельное вращение, молекулярный вес) и когда аналитические методы анализа указывают на отсутствие примесей (гомогенность по данным гель-хроматографии, электрофореза и седиментации).
Методы выделения, очистки глюкоманнанов, фруктозанов и установления их химических строений приведены во многих работах (8,9,11,13,29,50,56,68,69(. Поэтому мы сочли возможным не останавливаться на этих вопросах, а непосредственно перейти к изучению глюкоманнанов и фруктозанов, используя методы кислотного гидролиза, метилирования и периодатного окисления.
Для определения мономерного состава полисахаридов, в том числе глюкоманнанов и фруктозанов, обычно применяется полный кислотный гидролиз. Очень часто для этой цели используют серную или соляную кислоты, иногда применяют муравьиную кислоту с последующим разрушением побочно образующихся формиатов моносахаридов. Условия гидролиза (концентрация кислоты, температура и длительность гидролиза) зависят от особенностей строения полисахарида. В случае гидролитического расщепления можно использовать также и кислые ионообменники. Образующиеся продукты гидролиза легко выделяются и они не загрязнены неорганическими примесями.
Контроль над процессом кислотного гидролиза обычно осуществляют по определению вязкости растворов, увеличению восстанавливающей способности, изменению угла удельного вращения или по хроматограмме на бумаге. Для колоночной хроматографии гидролизата полисахарида обычно используют целлюлозу [54], а электрофоретическое разделение моносахаридов основано на способности моносахаридов образовывать отрицательно заряженные комплексы с борной кислотой или соляной кислотой и рядом других неорганических анионов [54].
При анализе гидролизата полисахарида все чаще применяется метод газожидкостной хроматографии (ГЖХ) (70(, впервые использованный в химии углеводов в конце 50-х годов (1(. Преимущество метода заключается в высокой чувствительности, возможности проведения качественной идентификации и количественного определения при очень малом расходе анализируемого образца. Поскольку свободные сахара не обладают летучестью, то их анализируют с помощью ГЖХ. В процессе исследования с помощью ГЖХ проводят перевод производных моносахаридов в соответствующие триметилсилиловые эфиры, что представляет собой хорошо отработанный метод, которому посвящен ряд работ (54(.
С 1969 года было предложено использование ацетатов альдононитрилов при проведении ГЖХ анализа смеси моносахаридов. Эти производные можно получить легко и с количественным выходом. Совмещение ГЖХ с масс-спектрометрией позволяет проводить одновременно как идентификацию, так устанавливать структуру отдельных компонентов смеси сахаров.
Авторами работы (71( были изучены шесть видов Эремурусов, произрастающих в Пятигорске, на содержание водорастворимых полисахаридов и их мономерный состав. Из водных экстрактов пяти видов Эремурусов выделены глюкоманнаны 27-38% с различным содержанием маннозы и глюкозы.
В работе (72( авторами были выделены 12,5-36% глюкоманнаны из растения в период цветения и плодоношения. Установлено, что глюкоманнан хорошо растворим в воде, имеет эмульгирующую способность и состоит из остатков D-глюкозы и D-маннозы при соотношении 1,0:2,5, которые соединены между собой
·-(14) гликозидными связями.
Из родов Георгины (73( были выделены водорастворимые полисахариды (ВРПС), из остатков сырья пектиновые вещества, а затем гемицеллюлозы А и Б. Ими же разработан безотходный метод использования сырья.
Для удаления низкомолекулярных, красящих веществ растительное сырье предварительно обрабатывают хлороформом. Затем при комнатной температуре проводят экстрагирование водой в течение 12 часов, после чего фильтруют и осаждают 1:2 этиловым спиртом. Выпавший осадок отфильтровывают. Из шрота выделяют пектиновые вещества, затем из остатка сырья 7,5%-ным раствором NаОН выделяют гемицеллюлозы А и Б.
В гидролизатах определяют моносахариды методом бумажной хроматографии, в ВРПС идентифицируют глюкозу и фруктозу, в ПВ - галактуроновую кислоту, рамнозу, арабинозу, глюкозу. В гидролизатах гемицеллюлозы А и Б обнаруживают нейтральные моносахариды - глюкозу, арабинозу и галактозу.
Для определения типов гликозидных связей, размеров окисных колец и степени разветвления в молекуле полисахаридов используются методы метилирования.
Эти методы основаны на устойчивости метиловых эфиров сахаров в условиях кислотного гидролиза и заключаются в исчерпывающем метилировании всех свободных гидроксильных групп с последующим расщеплением продуктов замещения и идентификации образовавшихся метилированных сахаров.
Для изучения строения полисахаридов наиболее часто применяются следующие методы метилирования: Пурди-Ирвина (74(, Хеуорса (75(, Куна (76(, Хоррмана (77(, Хакомори (77(. Как известно, исчерпывающее метилирование гидроксильных групп фруктозанов достигается путем многократной обработки метилирующими агентами.
Метод Куна представляет собой обработку растворенного в диметилформамиде полисахарида йодистым метилом в присутствии окиси серебра или окиси бария с добавкой гидроокиси бария. При этом метилирование проходит неполностью и дометилирование чаще всего осуществляют уже по методу Пурди-Ирвина. Преимущество этого метода заключается в том, что он используется как для начального, так и для исчерпывающего замещения. Единственный его недостаток – это образование устойчивого комплекса растворителя с катализаторами, что затрудняет выделение продуктов метилирования.
Этот метод претерпел ряд модификаций. Применение в качестве растворителя диметилсульфоксида упростило выделение продукта, вместо йодистого метила был использован более доступный диметилсульфоксид (76(.
Наиболее распространенным приемом проведения первых стадий метилирования служит метод Хеуорса, сущность которого заключается в обработке веществ диметилсульфоксидом в присутствии водного раствора едкого натра в токе инертного газа. Водная среда обуславливает растворение большинства полисахаридов, что приводит к высокой степени замещения при первой же обработке. В последующих стадиях метилирования применяют водный раствор ацетона, тетрагидрофуран и диоксан, так как частично метилированные полисахариды плохо растворимы в воде. Модификацию метода Хеуорса проводят путем обработки диметилсульфатом и порошкообразной щелочью ацетилированного полисахарида, растворенного в ацетоне или тетрагидрофуране.
При проведении этой реакции метилирование и дезацетилирование протекают одновременно. К недостаткам метода Хеуорса относится возможность деструкции полисахарида под действием кислорода воздуха и щелочи.
Метод Пурди простой и удобный в выполнении и обычно используется для диметилирования. Частично метилированный полисахарид обрабатывают йодистым метилом или его смесью с хлороформом и ацетоном в присутствии свежеприготовленного активированного оксида серебра. К недостаткам этого метода можно отнести многократность повторения операции метилирования, где имеет место большой расход оксида серебра и слабая растворимость полисахарида в реакционной среде. Следует упомянуть еще два способа метилирования, которые довольно редко применяются. Один из них – это обработка йодистым метилом в жидком аммиаке. Он удобен для завершения метилирования микроколичеств полисахаридов, другой же метод заключается в действии йодистого метила на таллиевые алкоголяты полисахарида и применяется при метилировании глюкоманнанов, чувствительных к щелочам.
Сущность метода Хоррмана состоит в определении локализации щелочнолабильных групп, например ацетатных (77(. Последние в условиях метилирования другими способами обычно замещаются на метоксилы. Во избежание этого явления все свободные гидроксилы превращают в ацетаты путем взаимодействия полисахарида (IV) c метилвиниловым эфиром в присутствии кислого катализатора. Затем модифицированное вещество (V) переводят в дезацетилированный продукт (VІ), после чего последний превращают с использованием одного из известных методов, в метильное производное, расщепление которого далее приводит к образованию мономеров(VІІ). Положение ацетильной группы определяется по месту нахождения метоксильной. Очень часто для защиты гидроксильной группы используют фенилиноционат (VІІІ).

13 SHAPE \* MERGEFORMAT 1415
Впервые этот метод был применен для определения расположения ацетильных групп в кислане березы Боувенгом в 1961 году. Японский исследователь М. Томада, как и другие исследователи, применил этот метод для определения расположения ацетильных групп в глюкоманнане, выделенном из корневищ Bletilla Striata.
Таким образом, применение методов защиты гидроксильных групп дает возможность определить расположение групп в нативном ацилированном полисахариде.
Метод по Хакомори является более эффективным методом метилирования (77(. Этот метод отличается мягкими условиями проведения процесса и дает высокий выход метилированного продукта. Исчерпывающее метилирование гидроксильных групп глюкоманнанов достигается путем многократного метилирования различными методами.
Существенным моментом при исчерпывающем метилировании полисахаридов является контроль за полнотой замещения гидроксилов на метоксилы, который осуществляется при помощи ИК-спектроскопии по отсутствию полосы поглощения в области 3400-3600 см-1. Обычно перметилаты бывают гигроскопичными веществами, поэтому для проверки наличия или отсутствия свободных гидроксильных групп их предварительно обрабатывают уксуснокислым ангидридом и затем анализируют спектроскопически на наличие сложноэфирных группировок.
Следующим этапом изучения строения метилированного полисахарида является гидролиз его гликозидных связей в условиях минимального частичного диметилирования и разрушения освобождающихся метилированных моносахаридов. Известно, что соляная кислота и метанольный раствор хлористого водорода (метанелизная смесь) обладают значительными разрушающими свойствами, серная кислота проявляет эти свойства в гораздо меньшей степени, а муравьиная – не вызывает диметилирования, но в жестких условиях может разрушить моносахарид (78(.
Предварительная идентификация метилированных сахаров, полученных гидролизом перметилатов, осуществляется при помощи хроматографии на бумаге (79( и тонкослойной хроматографии (80(.
Обнаружение метилированных сахаров проводят теми же реактивами, что и свободные моносахариды. Кроме того, часто используют ряд методов для выявления неметилированной гидроксильной группы при С4. Наличие свободной гидроксильной группы при С2 определяется положительной реакцией с хлористым трифенилтетразолием (80(.
Разделение смеси метилированных моносахаридов проводят с помощью препаративной колоночной хроматографии на различных адсорбентах (79-80( (порошок целлюлозы, окись алюминия, целит, уголь, смесь угля с целитом и силикагель). Для очистки продуктов используют препаративную бумажную хроматографию.
Периодатное окисление применяется для установления строения полисахаридов во всех случаях, когда используется малое количество исследуемого полисахарида, при этом получаются точные результаты (81(.
Периодатное окисление ( - гликольных группировок осуществляется за счет действия йодной кислоты и тетраацетата свинца. Значение этих окислителей для установления строения моно - , олиго - и полисахаридов трудно переоценить. Благодаря этим методам можно получить ценную информацию относительно положения связей, заместителей, числа и места разветвлений и степени полимеризации.
Йодная кислота способна количественно расщеплять (-гликольные группировки, когда в процессе окисления расходуется ее эквимолекулярное количество.
В процессе окисления выделяется муравьиная кислота и формальдегид, а полисахарид, в зависимости от строения, превращается в высокомолекулярный полиальдегид, в котором остаются нерасщепленными гликозидные связи.
Обычно окисление проводят в темноте при пониженной температуре в разбавленных водных растворах полисахарида при строго контролируемых значениях рН среды. Расход окислителя в ходе реакции строго контролируется через определенные промежутки времени в ходе реакции по появлению в реакционной среде муравьиной кислоты и формальдегида. Измерение расхода окислителя и выделившаяся муравьиная кислота свидетельствуют не только об установлении конца реакции, но и дают дополнительные сведения о строении углеводной цепи в случае хорошо изученного полисахарида.
Периодатное окисление иногда может являться «сверхокислением» или оно не протекает совсем из-за пространственных затруднений. Авторами работы (82( тщательно был изучен процесс сверхокисления и установлена последовательность этой реакции. Определено, что фактором, способствующим переокислению, является гидролиз сложного эфира муравьиной кислоты, образующегося при окислении восстановливающейся концевой группы. Сложный эфир муравьиной кислоты легко подвергается гидролизу в щелочной среде, а также в сильно кислой среде, но при рН-3-5 он является сравнительно устойчивым (82(. Полисахариды весьма неустойчивы и потому трудны для исследования структуры. Поэтому для установления структуры применяют различные способы: восстановление альдегидной группы до спиртовой и проведение гидролиза (распад по Смиту).
Распад по Смиту является наиболее удобным и распространенным в настоящее время вариантом периодатного окисления. Он позволяет судить о размерах циклов моносахаридов. В связи с этим распад по Смиту нашел широкое применение при исследовании самых различных классов полисахаридов.
Кислотный гидролиз полисахаридов является основным способом частичного расщепления, позволяет определить кольца моносахаридного состава и тип связи между ними (83-84(.
Частичное расщепление проводят для того, чтобы из полученных данных воссоздать структуру полисахарида. Для этих целей используют также частичный кислотный (85( и ферментативный гидролиз (86(.
Частичный кислотный гидролиз не одинаково действует на устойчивость гликозидных связей. Он зависит от типов связей и от природы моносахаридов. Например: остатки фруктозы в фуранозной форме не устойчивы в кислой среде. Выход моно- и олигосахаридов разной степени полимеризации соответствует разному времени протекания кислотного гидролиза.
Моносахаридные остатки более устойчивы в средних цепях, чем в концевых. К недостаткам частичного расщепления кислотным гидролизом можно отнести низкий выход олигосахаридов. При определении регулярности цепи полисахаридов частичный кислотный гидролиз является одним из основных этапов.
Авторами работы (87( были исследованы полисахариды, извлеченные из семян ливийского даты горячим 80%-ным этиловым спиртом (FІ) и фосфатным раствором (FІІ). После фракционирования и очистки ионообменной и гель-фильтрацией проведено метилирование с последующим гидролизом. В результате было определено, что полисахариды связаны между собой 14 связью и имеют линейную структуру.
Ферментативный гидролиз, являющийся одним из методов частичного расщепления полимерной цепи полисахаридов, дает информацию о характере гликозидных связей и об их конформации (88-89(. Этот метод является более мягким способом частичного расщепления полисахаридов при установлении их структуры.
Существуют специфические ферменты, которые постепенно катализируют процесс отщепления концевых моносахаридных групп или же способствуют отщеплению этих групп только на гликозидных связях.
Исследования полисахаридов частичным кислотным и ферментативным гидролизом показали, что гидролиз кислотами приводит к расщеплению фруктозана и образованию фруктозы, ди- ,три-, тетрасахаридов, а глюкоманнана к образованию маннозы, ди-,три-, тетрасахаридов, в то время как в результате ферментативного гидролиза расщепляется инулобиоза из глюкоманнана и нерасщепленным остается значительное количество исходного глюкофруктана и глюкоманнана (90(. Поэтому для конкретного изучения структуры исходного моносахарида желательно проведение исследования методами как кислотного, так и ферментативного частичного гидролиза.
Методу разделения олигосахаридов на колонке с древесным углем с последующей гель-хроматографией на сефадексе посвяшена работа (20(, где для разделения используют адсорбционную хроматографию на цеолите и угле (91( и бумажную хроматографию (79(.
Изучение способов разделения полученных олигосахаридов проводят с использованием физико-химических методов анализа и с определением моносахаридного состава (79(.
Развитие физических и физико-химических методов анализа послужило дополнительной основой для более глубокого исследования в области химии углеводов. Применение этих методов позволяет решать задачи, которые ранее могли бы считаться либо трудноразрешимыми, либо вообще неразрешимыми.
Внимание исследователей все более привлекают физико-химические методы анализа, позволяющие проводить не только идентификацию, но и выяснить структурные особенности углеводов. Такие методы как ИК - (92(, ПМР- (93( и 13С-ЯМР - спектроскопия (38,94( помогают в решении многих проблем в химии углеводов.
ИК - спектроскопия используется при определении производных по гидроксильным группам и для идентификации глюкоманнанов и фруктозанов, а также широко используется для их функционального анализа, выяснения в ряде случаев конфигурации, гликозидных связей, изучения межмолекулярных взаимодействий, получения данных о конформации (92(. Так например, для определения полноты метилирования снимают ИК - спектры: так исчезновение характеристического поглощения спиртовых гидроксилов свидетельствует о полноте метилирования.
Авторами статьи(51,95( изучены ИК - спектры глюкоманнанов салепа и эремуруса (11(. ИК - спектры глюкоманнанов по общему виду и положению пиков были почти идентичными. Так, полоса поглощения в области 873 см-1 относится к деформационным колебаниям экваториальной связи С2-Н маннопиронозных остатков в молекуле глюкоманнана, пик с частотой 892 см-1 возникает при деформационных колебаниях аксиальной связи С1-Н и характеризует наличие (- гликозидных связей.
При наличии в глюкоманнане карбоксильной и сложноэфирной группы наблюдается поглощение в области 1730 и 1240 см -1 . Если глюкоманнан очищен через медный комплекс, то вышеуказанные полосы становятся меньшей интенсивности или вообще отсутствуют.
При интерпретации спектров полисахаридных молекул необходимо принимать во внимание особенности строения полимеров, тип связи между звеньями, конформацию элементарного звена, поскольку в подобных соединениях конформационные изменения элементарных звеньев могут оказывать сильное влияние на характер полос поглошений в спектре. Несмотря на определенные сложности экспериментальный материал свидетельствует о значительных возможностях метода инфракрасной спектроскопии в изучении разнообразных химических и структурных превращений в углеводных молекулах.
ИК – спектроскопия используется для определения типов связей и функциональных групп, их пространственного расположения, конформации молекул фруктозанов. В ряде работ авторы (96-97( описали спектры моносахаридов типа инулина и левана. Полосы поглощения при 855 и 930 см-1 типичны для
· - (26) связи типа левана, соединяющие фруктофуранозные остатки со стандартным отклонением _+ 15см-1, а полосы поглощения в области 815, 880, 945см-1 типичны для
· - (21) связи, соединяющие фруктофуранозные единицы.
Анализ изменений химических сдвигов при переходе от моносахаридов к олиго - и полисахаридам требует учета равновесных концентраций вокруг гликозидных связей. Однако эффект от изменения конфигурации гликозидной связи обычно достаточно большой, чтобы различить
· - связанные звенья, несмотря на различия в равновесных концентрациях ротомеров.
Метод 13С - ЯМР-спектроскопии. В химии углеводов наиболее информативен метод 13С - ЯМР-спектроскопии [94]. Широко стали использовать метод ЯМР для изучения строения полисахаридов. Этот метод позволяет сделать существенные выводы и наметить дальнейшие пути химического использования.
При изучении большой серии однотипных глюкоманнанов и фруктозанов метод 13С - ЯМР дает возможность обойтись без трудоемких химических операций. В таких случаях достаточно было изучить только строение одного полисахарида, а строение других вывести путем сравнения их спектров.
При изучении глюкоманнанов Eremurus Comosus и Fuscus авторы работ (98( химическим путем установили их строения. Выделенные глюкоманнаны из этих растений представляют собой линейную цепь, состоящих из остатков D – маннопиранозы и D – глюкопиранозы, связанных между собой
· - (14) связями. Химические данные о строении глюкоманнана подтверждены результатами исследования этого глюкоманнана методом 13С - ЯМР-спектроскопии (98(.
Изучению спектров низших олигомеров предшествует расшифровка спектров глюкоманнана. Исходя из этого, в качестве модельных соединений для предварительного изучения были выбраны
· - метил–D–маннопиранозид, 4–0–метил–
·-D-маннопиранозид,
· – метил-целлобиозид. Результаты изучения полученных соединений методом 13С - ЯМР приведены в табл. 1.2.

Таблица 1.2 – Характеристика химических сдвигов 13С – ЯМР (- метил-Д-маннопиранозида, 4-0-метил-Д-маннопиранозида, (-метил-целлобиоза и глюкоманнана ( даны в м.д., относительно метанола)

Соединение
Остаток
С1
С2
С3
С4
С5
С6

Глюкоманнан

(-метил-D-маннопиранозид

4-0-метил-D-манно-пираноза

(-метил
целлобиозид
Man
Glc









В
Н
101,5
103,8



101,1



94,6

104,5
103,9
71,5
74,45



71,4



72,1

74,2
74,6
72,9
76,4



74,0



73,9

75,9
77,2
77,85
80,0



67,9



77,7

80,3
71,2
77,6
75,6



77,4



76,3

76,4
77,5
62,0
62,0



62,2



61,8

61,8
62,4


Примечание: Н – «невосстанавливающее» звено,
В – «восстанавливающее» звено.

Данные, приведенные в табл.1.2., позволяют уверенно определить
(-(1(4) связи между остатками маннозы и глюкозы.
Tomasuо и др. (98( в одной из первых работ по 13С – ЯМР, основываясь на сходстве спектров сахарозы и инулина, установили структуру фруктана.
Для установления структуры фруктозанов, в подтверждение химических анализов, можно привести расшифровку спектров 13С – ЯМР в работах Scumour (99] и Jarrell (100( (Табл. 1.3.).



Таблица 1.3 – Характеристика химических сдвигов 13С – ЯМР – спектров для олиго- и полисахаридов (98]


С1
С2
С3
С4
С5
С6

1
2
3
4
5
6
7


·-Д-фуранозид
Сахароза
1-Кестоза

Нистоза


Инулин
Леван


·-Д-пиранозид
Сахароза
1-Кестоза
Нистоза
Инулин
Леван

62,6
62,2
61,7
62,02
62,20
61,53
62,2
62,6
61,3

93,3
93,7
93,74
93,7
93,3

104,9
104,9
104,5
104,9
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
·
Как видно из данных, приведенных в табл. 1.3. спектры (-(2(1) связанных фруктофуранозных звеньев (инулина) и (-(2(6) связанных фруктофуранозных звеньев (в леване) и соответствующих атомов углерода, отличаются по положению сигналов. На основе 13С - ЯМР-спектроскопии можно выяснить соотношение фруктозы и глюкозы, а также отличить связанные фруктофуранозные остатки (-(2(1) и (-(2(6). В спектре также можно определить концевые сигналы
·-D-глюкопиранозида.
Таким образом, подводя итог всему описанному выше, следует указать на то, что для исследования глюкоманнана физические методы играют важную роль.



1.4. Примеры строения и функции глюкоманнанов и фруктозанов

Японским ученым М.Томада и другими (26( исследователями проведено изучение строения слизистого полисахарида из L.auratum, названного ими Lilium-А-глюкоманнаном. Мономерный состав глюкоманнана состоит из глюкозы и маннозы в соотношении 3:8 и имеет молекулярный вес 35700. В ИК- спектре имеются полосы поглощения, которые характерны для ацетильных групп. Количественное содержание в глюкоманнане О-Ас групп, определенных методом ГЖХ, составляет 5,1 %. Место локализации О-Ас групп (ІХ) было установлено по методу Хоррмана. В схеме 1.1. свободные гидроксилы превращаются в ацетали (Х) путем взаимодействия полисахарида с метилвиниловым эфиром в присутствии кислого катализатора (26(.
Схема 1.1.
13 SHAPE \* MERGEFORMAT 1415
Выделенный продукт дезацетилируют в (ХІ), а затем метилируют. Метильные производные (ХІІ) гидролизуют до мономеров (ХІІІ) и по методу расположения метоксильных групп определяют положение ацетильной группы.
Установлено, что ацетильные группы стыкуются в положениях С3 и С6 маннопиранозных остатков. Количественный анализ О-Ас групп показывает, что один приблизительно из восьми маннозных остатков имеет две ацетильные группы по гидроксилам С3 и С6.
Посредством частичного гидролиза было выделено и установлено строение шести олигосахаридов: глюкозил-манноза (XIV), маннобиоза (XV), маннотриоза (XVI), маннозил-глюкоза (XVІІ), маннозил-глюкозил-манноза (XVІІІ), маннотетроза (XIХ).
Glcp 1
·( 4 Manp; Manp 1
·( 4 Manp;
(XIV) (XV)
Manp 1
·( 4 Manp 1
·( 4 Manp; Manp 1
·( 4 Glcp;
(XVІ) (XVІІ)
Manp 1
·( 4 Glcp 1
·( 4 Manp; Manp 1
·( 4 Manp 1( 4 Manp 1
·( 4 Manp
(XVІІІ) (XIХ)

В результате частичного гидролиза установлено, что глюкоманнан имеет линейное строение, цепи, в которой связаны между собой (-1(4 связями. Их можно представить в виде двух повторяющихся участков:

Manp 1
·( 4 Glcp
·( 4 Manp и Manp 1
·( 4 Manp 1
·( 4 Manp 1
·( 4 Manp
(XХ) (XХІ)

При периодатном окислении на один ангидрогексозный остаток
расходуется 1,01 моль периодата натрия и выделяется 0,09 моль муравьиной кислоты. ГЖХ анализ продуктов распада по Смиту показал присутствие эритрита и маннозы (2,0 и 8,0 % соответственно). Результаты окисления
свидетельствуют о разветвленной структуре глюкоманнана, что было также подтверждено метилированием.
Метилирование проводили по методу Хакомори. В результате гидролиза были обнаружены: 2,3,4,6- тетра-О-Ме-D - манноза; 2,3,6-три-О-Ме-D- манноза; 2,3,6-три-О-Ме-D-глюкоза и 3,6-ди-О-Ме-D-манноза в молекулярном отношении 1,0:6,3:2,9:0,7.
Приведенные данные показывают, что изученный глюкоманнан в основном состоит из 1(( 4 связанных гексапиранозных остатков и имеет некоторые маннозные остатки, являющиеся точками ответвления (через С2), причем на одиннадцатый моносахарид цепи приходится один невосстанавливающийся концевой остаток D-маннозы.
Таким образом, из выше изложенных данных можно сделать вывод, что глюкоманнан состоит из остатков маннозы и глюкозы, связанных (-1( 4 связями, со значительными разветвлениями при С2 маннозных остатков. Этот глюкоманнан отличается от других глюкоманнанов по соотношению моносахаридов и молекулярным весам.
Большой интерес вызывают глюкоманнаны, обнаруженные в порошке конниаку, получаемого измельчением клубней растения Amorphallus Konyac, популярного пищевого источника в Японии. Порошок состоит из водорастворимого глюкоманнана, названного коньяк-маннаном. Этот полисахарид является (-(1( 4) – связанной молекулой, в которой последовательности из трех остатков маннозы разделяются остатками глюкозы. Молярное соотношение маннозы к глюкозе составляет 1,6:1 (105(.
Р.К. Рахманбердыева и др. выделили из корневища растений Р. Sewerzowii глюкоманнан и назвали его “северан” (57(. Мономер глюкоманнана состоит из глюкозы и маннозы в соотношении 1:15,4, молекулярный вес составил 59000. Гомогенность глюкоманнана оценивали с помощью метода гель-фильтрации. В продуктах периодатного окисления и распада по Смиту северана обнаружены эритрит и манноза при соотношении 14,5:1 соответственно, что указывает на 1( 4 связи между гексозными остатками и на наличие ответвления 1(3 или 1( 2 у некоторых маннозных остатков.
В результате метилирования северана по методу Хакомори, после кислотного гидролиза и последующего формолиза обнаружены 2,3,4,6-тетра-О-Ме-D-манноза, 2,3,6-три-О-Ме-D-глюкоза и следовые количества ди-О-метилгексоза. Соотношение 2,3,6-три-О-Ме-D-глюкозы и 2,3,6-три-О-Ме-D-маннозы 1:15,4 совпадают с соотношением свободных сахаров в гидролизате исходного глюкоманнана. Так как манноза содержится на невосстанавливающем конце
· - гликозидную связь определяли методом окисления хромовым ангидридом ацетилированного северана. Из северана при частичном кислотном гидролизе выделены четыре олигосахарида. Строение олигосахаридов установлено с помощью методов полного и частичного гидролиза до и после восстановления боргидридом натрия, метилирования, периодатного окисления и масс-спектрометрии. В результате были идентифицированы следующие олигосахариды: маннобиоза, маннотриоза, глюкозил-манноза и маннотетраоза. На основании вышеизложенных данных, этими авторами предложена для глюкоманнана из Р. Sewerzowii следующая линейная структура с повторяющимся звеном (ХХІІ):

[-
·-Д- Manp (1(4)-О-
·-Д- Manp (1(4)- О-
·-Д- Manp (1(4)- О-
·-Д- Manp (1(4)- О-
·-Д- Glcp(1(4)- О-
·-Д- Manp]
(ХХІІ)

Из E. Fusсus выделен глюкоманнан, который при гидролизе дает глюкозу и маннозу в соотношении 1:2, 6 со следами галактозы (46(. Полисахарид был подвергнут периодатному окислению, в результате чего на одно ангидридное звено была израсходована 1 моль периодата и выделено 0,0016 моль муравьиной кислоты. Эквивалентный расход периодата на обнаружение в продуктах распада по Смиту только эритрита указывает на линейную цепь 1( 4 связанных моносахаридов в пиранозной форме.

· - конфигурация гликозидных связей глюкоманнана установлена на основании ферментативного расщепления, ИК-спектроскопии и оптической активности.
В продуктах частичного кислотного гидролиза, наряду с олигосахаридами, обнаружена и целлобиоза (XXIV), указывающая на присутствие в цепи глюкоманнана, связанных между собой остатков глюкозы.

ХХІІІ
Глюкоманнаны E. Fusсus Vved. и E.Hissaricus Vved, хотя и имеют одинаковые углы удельного вращения, идентичные ИК-спектры, все же различаются между собой. Глюкоманнан E.Нissaricus (43, 44( состоит только из остатков глюкозы и маннозы в соотношении 1:1,5 и в продуктах частичного кислотного гидролиза не обнаружена целлобиоза. Таким образом, глюкоманнаны E.Fusсus и E.hissaricus являются подобными эремурусами.
Авторами работы (65( исследованы полисахариды, выделенные из луковиц Allium sativum. На основании экспериментальных данных и физико-химических характеристик доказано, что отдельные фракции фруктозанов состоят из остатков
·-D-фруктофуранозы и содержат оба типа (-(2(1) и (-(2(6) связей. Ими были предложены следующие структурные формулы:
(-D-Fruf-2( [6-(-D- Fruf-2-]2( (-1-(-D- Fruf-2-]4( 1-(-D- Fruf-2( 1-D- Fruf(1-2-D-Glcp
(-D-Fruf
(XXІV)
Впервые были выделены фруктозаны из растений родов Cousinia (C), Polycephala. По данным гель-хроматографии исходные фруктозаны полидисперсны. Фруктозаны были фракционированы на водную и спиртовую фракции. Водные фракции ВФ-3, ВФ-7 и спиртовые фракции СФ-7 изучены методами кислотного гидролиза, периодатного окисления, метилирования, ИК-, 13С-ЯМР-спектроскопии и установлено их строение и определено, что фруктозаны состоят из фруктофуранозных остатков (-(2(1) гликозидных связей типа инулина.

1.5. Применение глюкоманнанов и фруктозанов

Глюкоманнаны и фруктозаны являются важнейшими биополимерами. Они являются структурным материалом клеточных стенок, служат резервным питательным веществом и несут специфические функции, связанные с узнаванием клетками имунной системы чужеродных клеток. Эти важные биополимеры обладают разнообразной биологической активностью [1].
Полисахариды находят непосредственное практическое применение в многочисленных отраслях народного хозяйства. Они, обладая рядом уникальных свойств, весьма перспективны для практического применения в медицинской, фармацевтической, микробиологической, пищевой и других отраслях промышленности [101].
Исследованию полисахаридов уделяется большое внимание, благодаря интересному проявлению ими биологической активности. Они способны увеличивать неспецифическую резистентность у животных к инфекциям и оказывать влияние на рост злокачественных опухолей [1]. Кроме этого, они являются источником для получения Д-маннозы, одного из важнейших и необходимых манноз в микробиологической, химической, реактивной, медицинской и других отраслях науки и промышленности [31]. Фруктозаны являются запасными формами питательных веществ. Они поднимают сопротивляемость организма. Не токсичны, снижают холестерин в крови. Широко используются в пищевой промышленности для диетического питания [48].
Японскими исследователями интенсивно ведутся работы по получению глюкоманнанов, обладающих противораковым действием [102]. Глюкоманнаны с определенным молекулярным весом оказывают влияние на ход окислительно-восстановительного процесса в организме, причем активность зависит от структуры последнего. Стимуляцию лейконоэза вызывают полисахариды с молекулярным весом не менее 3000 [1]. Исследованиями глюкоманнанов эремурусов на их противоопухолевое действие, на стимуляцию регенеративных процессов в тканях печени при ее цирротических поражениях, гипохолестеринемическое действие показана возможность использования растворов глюкоманнана в качестве маркеров диких штаммов вируса японского энцефалита [103], а также возможность использования глюкоманнана в качестве кровозаменителей после частичного гидролиза, что обусловливается отсутствием токсичности, соответствующей консистенцией и стойкостью к
· - амилозе крови [18].
В.Н.Степаненко с сотрудниками [48] обнаружили близкое сходство глюкоманнана из эремуруса с гликогеном печени кролика по положению максимума поглощения окраски с йодом при сравнении интенсивности (глюкоманнан при 5300 А 0, гликоген печени кролика 5000 А0).
Глюкоманнан клубней Amorphophallus konjac (семейства Aracal) известен под названием “коньяк-маннан”. Он широко используется в пищу в Японии и других странах в виде измельченных клубней “коньяк-муки” [104]. Источником получения маннана и глюкоманнана за рубежом являются растения (скорлупа орехов, кокосовых пальм, рожкового дерева, каменных орехов, финиковых косточек, клубней орхидных “коньяк-муки», грибов). Интерес к этим полисахаридам за рубежом выразился в патентовании многих способов его использования [106].
Глюкоманнаны, выделенные из некоторых видов растений Amorphophallus [8, 11], широко используются в различных отраслях промышленности: являются лучшей добавкой к бумаге для улучшения ее прочности, применяются в кондитерской и фармацевтической промышленности – как диспергирующий агент и в резиновой – для расслаивания латекса [11].
Слизь, состоящая в основном из глюкоманнана, выделенная из корневищ Polyqonatum odaratum и P.falcatum, используется как укрепляющее средство [20, 57].
Изучая влияние глюкоманнана на регенерацию ткани печени на модели ССL4 – гепатоза у крыс, Авраменко М.Ш. и другие [107] установили, что глюкоманнаны, очищенные от белков и выделенные из Eremurus, усиливают физиологические процессы цирротических изменений ткани печени.
Eremurus Spectabilis, произрастающие в регионе Анталия в Турции, на протяжении многих лет использовалась в качестве пищевой добавки и в лечебных целях. Исследованы антимикробные, антиоксидантные и антирадикальные свойства метанольных, этанольных и водных экстрактов из E. Spectabilis. Самое высокое содержание фенолов было обнаружено в метанольном экстракте. В этанольном экстракте замечена самая высокая антирадикальная активность, а самая сильная антиоксидантная активность была обнаружена в метанольном экстракте. 12 видов бактерий было использовано для анализа антимикробной активности экстрактов. 1%-ные концентрации всех экстрактов не показали тормозящее влияние на любые бактерии [108].
Eremurus китайский Fedtch представляет особый вид и выращивается в Китае. Спиртовые экстракты из корней E. китайского обладают антиоксидантными и противоопухолевыми эффектами [109].
Eremurus Percicus используется в качестве антидиабетических агентов в иранской традиционной медицине [110].
В Китае и Японии [111] глюкоманнан традиционно используется в качестве пищевых добавок, полезных для здоровья. Это представляет большой интерес для медицины и намечает новую область практического применения глюкоманнанов и фруктозанов из растительного сырья.
Из Eremurus Percicus, произрастающих в Пакистане [112], выделено противомалярийное соединение 2-ацетил-1-гидрокси-8-метокси-3-метилнафталин, а из этилацетатного экстракта противоопухолевый препарат 1,5,8-thregydrothy -3-methyhy-lanthraguinone. Eremurus Percicus традиционно используется для лечения печени, желудка, при запорах и сахарном диабете.
Konjac глюкоманнан широко используется в ряде отраслей пищевой промышленности, химической технологии и нефтяного бурения Китая [113-114].
Глюкоманнан помогает снизить уровень холестерина (за счет снижения всасывания холестерина из желудочно-кишечного тракта), используется в фитотерапии как слабительное [115-117].
Анализируя литературные данные по глюкоманнанам и фруктозанам можно сделать следующее заключение.
На земном шаре произрастает много полисахаридсодержащих сорных растений, не находящих применения в человеческой жизни. Представители главных из этих полисахаридов глюкоманнаны и фруктозаны являются интересными природными соединениями, всестороннее исследование которых имеет огромную научную и практическую значимость.
Нами рассмотрены некоторые физико-химические характеристики глюкоманнанов и фруктозанов, выделенных из разных растительных веществ, приведены и обсуждены методы установления их структуры.
Глюкоманнаны и фруктозаны, выделенные из различных видов растений, отличаются между собой по соотношению содержания сахаров, молекулярной массе, степени полимеризации и содержанию О-Ас групп. Структура глюкоманнана имеет моменты линейной цепи, состоящие из остатков глюкозы и маннозы в пиранозном цикле.
Глюкоманнаны и фруктозаны в высших растениях в наибольшем количестве содержатся в подземных органах и играют важную роль в процессах их жизнедеятельности.
Изучение физико-химических свойств глюкоманнанов и фруктозанов, установление их химического строения, функций в растительных объектах является конечной целью рационального их использования в практической деятельности.
По мере исследования глюкоманнанов и фруктозанов открываются и расширяются спектры их возможного применения в различных отраслях промышленности.
ГЛАВА ІІ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Объекты и методы исследования

Объектом исследования стали растения рода Eremurus из семейства Liliaceae. Был определен углеводный состав 8 видов растений рода Eremurus, собранных в различные периоды вегетации и произрастающих по всей территории Кыргызстана: на холмах, пастбищах, пустырях и предгорьях.
Результаты наших исследований растений, собранных в одном и том же месте в разные годы, могут отличаться друг от друга, поскольку содержание углеводов зависят не только от места произрастания, но и от погодно-климатических условий.
Из корней и надземных частей растений E. Cristatus, собранных в фазе цветения – плодоношения, были выделены глюкоманнаны, фруктозаны, пектиновые вещества и D-манноза и изучены их физико-химические свойства.
Полученные экстракты после обработки растений этиловым спиртом упаривали на роторном испарителе при 35-40ОС. Бумажную хроматографию (БХ) проводили на бумаге «Ленинградская средняя» и filtrak FN-7 (ГДР) нисходящим и восходящим методом с использованием следующих систем растворителей [79]:
нормальный бутанол-пиридин-вода (6:4:3);
фенол, насыщенный водой (нижний слой) по объему;
нормальный бутанол-ацетон-вода (7:2:1).
С целью определения качественного состава изучаемого соединения тонкослойную хроматографию (ТСХ) моносахаридов и их производных проводили на силуфоле, для чего пластинки сушили при комнатной температуре и перед употреблением активировали в сушильном шкафу при 1100С в течение 10-15 минут [80]. При этом были использованы следующие системы растворителей:
бензол-ацетон (2:1);
хлороформ-метанол (9:1);
метил-этил-кетон, насыщенный 1%-ным водным раствором аммиака (30:4).
Обнаружение соединений проводили с помощью следующих реагентов:
кислый анилин-фталат;
периодат натрия;
марганцевокислый калий-бензидин;
концентрированная серная кислота;
смесь мочевины и соляной кислоты в 5%-ном этаноле.
Угол удельного вращения соединений определяли на сахариметре СУ-3 в трубке длиной 10 см и объемом 10 мл и на поляриметре Goergs, l=1 dm и 0,1 dm при 22оС.
Вязкость растворов полисахаридов измеряли на вискозиметре Оствальда (объем 10 мл) при 250С (
· = 0,84 мм).
ИК-спектры снимали на приборе UR-20 в таблетках с KBr и в вазелиновом масле [92].
Ультрацентрифугирование проводили на приборе МОМ-3170 при 5000 об/мин. Интервал съемки 5 мин, угол удельного вращения 450, температура 200С, концентрация-1%-ный водный раствор.
Спектры 13С-ЯМР снимали на приборе WR-60 Bruker с рабочей частотой по ядрам углерода 15,08 МГц. Готовили 3% - ные растворы в Д2О5, внутренний стандарт - метанол (50,15 м.д.). Химический сдвиг приведен в
· – шкале. Объем памяти 8/ч К, частота повторения импульсов 0,7 с, ширина спектра 3750 Гц, число накоплений 100-150 тыс. [94].

Количественное определение углеводов в растениях [119,66]

Для определения моно -, олиго - и полисахаридов воздушно-сухое сырье измельчали и просеивали сквозь сито по ГОСТу 214-700 с отверстиями 2мм. В круглодонную колбу емкостью 250 мл, снабженную обратным холодильником, помещали 5г сырья, приливали 150 мл 96%-ного этилового спирта и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа. Затем смесь отфильтровывали на воронке Бюхнера, а к оставшемуся сырью дважды приливали по 150 мл 82%-ного этилового спирта. Кипятили смесь в течение 15 минут, после чего ее снова отфильтровали через тот же фильтр.

Определение моносахаридов

Полученные спиртовые растворы объединяли и упаривали на водяной бане под вакуумом до полного удаления спирта. Оставшийся водный экстракт переносили в мерную колбу на 100 мл и доводили до метки дистиллированной водой. Затем из этого раствора отбирали аликвоту (10 мл), помещали ее в коническую колбу емкостью 250 мл и добавляли 10 мл раствора Фелинга I, 10 мл раствора Фелинга II и 20 мл дистиллированной воды. Смесь осторожно нагревали до кипения (в течение 3 минут) и кипятили ровно 2 минуты. Кипение должно быть умеренным для того, чтобы объем жидкости в колбе оставался примерно постоянным. По окончании кипячения колбу быстро охлаждали холодной водой до 200С, добавляли к смеси 10 мл 30%-ного раствора иодида калия и 10 мл 25%-ного раствора серной кислоты и сразу же титровали 0,1 н. раствором тиосульфата натрия до перехода коричневой окраски в желтую. После чего к смеси прибавляли 10 мл 1%-ного раствора крахмала и медленно дотитровывали раствор до перехода синей окраски в кремовую, присущую иодиду меди.
Параллельно в тех же условиях проводили контрольный опыт без добавления испытуемого раствора. По разности объемов раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование контрольного опыта и испытуемого раствора, находили количество миллилитров раствора тиосульфата натрия соответствующее количеству образовавщейся при анализе восстановленной меди.
Содержание маннозы в миллиграммах находили по таблице, учитывая тот факт, что 1 мл 0,1 н. раствора тиосульфата натрия соответствует 6,4 мг восстановленной меди (табл. 2.1.).
Содержание маннозы в пересчете на абсолютно сухое сырье в процентах (Х) вычисляли по формуле:
13 EMBED Equation.3 1415
где,
а – количество маннозы, найденное по табл. 2.1., в мг;
100 – разбавление раствора, в мл;
г– испытуемый раствор, взятый для титрования, в мл.

Таблица 2.1. – Характеристика соотношений количества маннозы и меди в мг

Объем 0,1н Na2S2O3, мл
Медь, мг
Манноза, мг

1
2
3
4
5
6,4
12,7
19,4
25,4
31,8
3,1
6,3
9,5
12,8
16,1



Определение олигосахаридов

В коническую колбу на 250 мл из оставшегося водного экстракта (после взятия аликвоты для определения моносахаридов) отбирали 50 мл, добавляли 5 мл 10%-ного раствора соляной кислоты и проводили гидролиз, выдерживая смесь на кипящей водяной бане в течение 45 минут. Затем гидролизат нейтрализовали раствором 10%-ного едкого натрия до рН=5,5 – 6 и фильтровали в мерную колбу на 100 мл, доводили до метки дистиллированной водой, перемешивали и оттуда отбирали 10 мл для титрования 0,1н раствором тиосульфата натрия.
Параллельно в тех же условиях проводили контрольный опыт без добавления испытуемого раствора. По разности объемов раствора тиосульфата натрия, израсходованного на титрование контрольного опыта и испытуемого раствора, находили количество миллилитров раствора тиосульфата натрия соответствующее количеству образовавщейся при анализе восстановленной меди.
Содержание маннозы в миллиграммах находили по таблице, учитывая тот факт, что 1 мл 0,1 н. раствора тиосульфата натрия соответствует 6,4 мг восстановленной меди.
Процентное содержание олигосахаридов в сухом сырье (х) вычисляли по формуле:
13 EMBED Equation.3 1415
где,
а – количество маннозы, найденное по таблице, мг;
б – разбавление раствора, мл
г – испытуемый раствор в мл, взятый для титрования;
д- количество раствора, добавленного до метки, мл.

Определение полисахаридов

Из мелко измельченных воздушно-сухих корней, оставшихся после трехкратного извлечения сахаров, отбирали навеску в 5г, заливали 200 мл воды и нагревали в течение 3 часов на сильно кипящей водяной бане. Затем остывший экстракт фильтровали в мерную колбу на 250 мл и доводили объем до метки дистиллированной водой. Из этого раствора отбирали 100 мл аликвоты, добавляли 5 мл или 10 мл 10 %-ной соляной кислоты и нагревали на кипящей водяной бане в течение 35 минут. После гидролиза раствор нейтрализовали 10%-ной щелочью до слабокислой реакции и раствор переносили в мерную колбу на 200 мл и доводили до метки водой. Из этого раствора отбирали аликвоту в 10 мл, помещали ее в коническую колбу емкостью 300 мл и добавляли по 10 мл жидкостей Фелинга I-II и 20 мл воды. Затем полученную смесь нагревали до кипения (не более 3 минут) и осторожно кипятили в течение 2 минут. По окончании кипячения колбу быстро охлаждали до 250С, добавляли 10 мл 30%-ного раствора иодида калия и 10 мл 25%-ного раствора серной кислоты и сразу же титровали 0,1н. раствором тиосульфата натрия до перехода коричневой окраски в желтую. Затем к смеси прибавляли 5 мл 1%-ного раствора крахмала и дотитровывали до полного исчезновения синей окраски. При этом смесь окрашивалась в кремовый цвет, присущий иодиду меди.
В совершенно аналогичных условиях, но без испытуемого раствора, ставили контрольный опыт. Число мл раствора тиосульфата натрия, пошедшее на титрование в основном опыте, вычитали из числа мл раствора тиосульфата натрия, израсходованного на контрольный опыт и по полученной разности, пользуясь таблицей, находили содержание сахара (фруктозы из фруктозанов и маннозы из глюкоманнана), исходя из того, что 1 мл 0,1н. раствора тиосульфата натрия соответствует 6,40 мг восстановленной меди (табл. 2.1.).
Процетное содержание маннозы в сухом сырье (х) вычисляли по формуле:
13 EMBED Equation.3 1415
где,
а- количество маннозы, найденное по таблице, г;
б- разбавление раствора, мл;
в – навеска сырья, г;
г – испытуемый раствор в мл, взятый для титрования;
100 – объем пробы, взятый для гидролиза в мл;
250 – объем пробы, взятый после гидролиза.
Выделение глюкоманнана

Из мелко измельченных воздушно-сухих корней растения брали навеску в 50г, заливали (1:10) кипящим этиловым спиртом. Через 30 минут фильтровали через бумажный фильтр и экстрагировали (1:20) водой при комнатной температуре в течение 3 часов. Экстракцию сырья водой повторяли дважды. Смесь фильтровали, водные экстракты объединяли и очищали от белков по методу Севага (бензол : метанол - 1:1). Осевшие белки отделяли центрифугированием и из раствора полисахарид осаждали (1:2) этиловым спиртом. Затем осадок отделяли фильтрацией через воронку Бюхнера и сушили на воздухе. Выход составил 48, 1% от сухого веса экстрагируемого сырья.

Определение молекулярной массы исходного глюкоманнана [125,126]

Навеску (0,02 г) глюкоманнана растворяли в 5 мл воды и вносили в колонку (1,2х65) с сефадексом G-150. Колонку предварительно калибровали пропусканием образцов декстранов с ММ 40000 (Ve=48,5 мл) и 80000 (Ve=28,5 мл). Элюент собирали по 2 мл. Определение ММ глюкоманнанов проводили фенол-серным методом.

Фракционирование глюкоманнана

Навеску в 2г глюкоманнана растворяли в 100 мл воды, перемешивая на магнитной мешалке, добавляли 50 мл 96%-ного этанола. Затем выпавший осадок отделяли центрифугированием, промывали ацетоном, эфиром и сушили в эксикаторе. Таким способом была получена 4 фракции.

Определение молекулярной массы отдельных фракций
Выделенные фракции глюкоманнана растворяли в 5 мл воды и пропускали через сефадекс G - 150 (1,2х65). Элюирование проводили как описано выше. Колонку калибровали с помощью декстранов с молекулярными весами 110000, 80000 и 40000. Свободный объем колонки V0 = 52 мл, Vе110000 = 28,5 мл, Vе 800000 = 48 мл, Vе 40000 = 62,5 мл.
Молекулярный вес фракции, определенный по калибровочной кривой, выражает зависимость объема выхода Vе от log Mn. Молекулярные веса глюкоманнанов фракций 2-3-4 равны, соответственно 68000, 50700, 34000.

Кислотный гидролиз глюкоманнана

Выделенные фракции 2,3,4 подвергали кислотному гидролизу 2н Н2SO4 при 1000С в течение 8 часов с последующей нейтрализацией ВаСО3. Бумажную хроматографию гидролизатов проводили на бумаге FN – 7 с использованием систем 1,2,3. Для проявления моносахаридов в качестве проявителя использовали анилинфталат. На хроматограммах кроме глюкозы и маннозы других моносахаридов обнаружено не было.


Периодатное окисление и распад по Смиту глюкоманнанов [56]

Навеску (0,2 г) образцов фракций 2-4 глюкоманнанов растворяли в 50 мл воды, добавляли 10 мл 0,25 М раствора периодата натрия. Параллельно ставили холостой опыт. Смесь выдерживали в темноте при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Через сутки отбирали пробы на анализ, расход периодата натрия определяли титрованием 0,1н. раствором тиосульфата натрия.
Через 192 часа прекращался расход периодата натрия и далее не менялся. Расход периодата натрия составил 0,93 моль, а количество выделившейся муравьиной кислоты было равно 0,06 моль.
По окончании периодатного окисления к раствору прибавляли 3 капли этиленгликоля для удаления избытка периодат-иона, затем смесь восстанавливали боргидридом натрия (0,1г). Восстановленную смесь фильтровали через бумажный фильтр, и полученный раствор подвергали диализу. Затем смесь пропускали через катионит КУ-2 (в Н+- форме) для получения нейтральной реакции раствора, который затем концентрировали под вакуумом. К концентрированному раствору прибавляли 2,0 мл 0,5н. раствора серной кислоты и гидролизовали на кипящей водяной бане в течение 3 часов. После гидролиза смесь нейтрализовали карбонатом бария, фильтровали через бумажный фильтр и концентрировали в вакууме. Остаток анализировали методом бумажной хроматографии (FN – 7, система 1,4, проявитель 1,4). В результате были обнаружены эритрит и следовые количества глицерина.

Метилирование по Хакомори [77]

Навеску (0,05г) глюкоманнана растворяли в 5 мл раствора диметилсульфоксида (ДМСО) и отдельно растворяли (0,02г) гидрида натрия в 2 мл ДМСО при температуре 45-500С до появления зелено-синего цвета, после чего его объединяли с раствором глюкоманнана и выдерживали при перемешивании на магнитной мешалке в течение 7-8 часов в токе азота, затем прибавляли 1 мл йодистого метила и оставляли в темноте на 10-12 часов. Смесь разлагали добавлением 3 капель 10%-ного раствора гипосульфита натрия и диализовали. Экстракцию раствора хлороформом проводили 5 раз, объединяли все экстракты и концентрировали до сиропа на кипящей водяной бане. Полноту метилирования проверяли с помощью тонкослойной хроматографии (система 2, проявитель - концентрированная Н2SO4). Для достижения исчерпывающего метилирования операцию повторяли дважды.

Формолиз и гидролиз перметилатов

В полностью метилированную концентрированную до сиропа смесь добавляли 5 мл муравьиной кислоты и нагревали на водяной бане в течение
одного часа. Затем к смеси прибавляли метанол и упаривали досуха. К сухому остатку приливали 3 мл 0,5н. серной кислоты и гидролизовали в течение 5 часов на кипящей водяной бане. После чего гидролизат нейтрализовали карбонатом бария до нейтральной реакции. Смесь фильтровали и концентрировали до сиропообразного состояния. Метилированные продукты анализировали с помощью метода тонкослойной хроматографии (система 1, реагент 1).
Во всех фракциях были идентифицированы следующие метилированные сахара: 2,3,6 - три - О - Ме - D- манноза, 2,3,6 - три - О - Ме - D - глюкоза, 2,3,4,6 - тетра - О - Ме - D- манноза и 2,3,4.6 - тетра - О- Ме – D - глюкоза.

Частичный кислотный гидролиз глюкоманнана

К навеске глюкоманнана (8 г) добавляли 110 мл 0.5 н. раствора серной кислоты и гидролизовали при температуре 90-95ОС в течение 2,5 часа на кипящей водяной бане. После чего гидролизат нейтрализовали карбонатом бария до нейтральной реакции и фильтровали. Полученный фильтрат упаривали до густого сиропа. Методом бумажной хроматографии в системе 1 (проявитель 1) обнаружили маннозу, глюкозу и семь олигосахаридов.

Гель-фильтрация смеси олигосахаридов

Смесь олигосахаридов (1г) растворяли в 50 мл дистиллированной воды и разделяли на колонке (1,5х60см) с сефадексом G-25 при промывании водой, собирая фракции по 2мл. Объемы элюентов полисахаридов равны соответственно: 1 - 82мл, 2 - 91мл, 3 - 102мл, 4 - 114мл. Контроль разделения производили фенол-серным методом. Фракции, соответствующие пикам на выходной кривой, объединяли и упаривали под вакуумом до сиропа, затем анализировали с помощью бумажной хроматографии (система 1. проявитель 1). Олигосахариды, содержащие фракции (1-4), разделяли препаративным методом.

Выделение фруктозанов [4]

Все спиртовые экстракты после осаждения глюкоманнана объединяли и упаривали до половины объема. Затем экстракт обрабатывали активированным углем при 70оС в течение 10 мин и фильтровали. Экстракт упаривали до густого сиропа и обрабатывали изопропиловым спиртом. Выпавший осадок отфильтровали, промывали изопропиловым спиртом, затем ацетоном, эфиром. Получили олигосахарид в виде порошка слегка желтоватого цвета, легко расплывающегося на воздухе.

Кислотный гидролиз фруктозанов

Навеску (0,02 г) олигофруктозанов растворяли в 5 мл 0,5% - ной соляной кислоты и гидролизовали на кипящей водяной бане в течение 45 мин. Гидролизат нейтрализовали карбонатом кальция, фильтровали и концентрировали под вакуумом. Хроматографию гидролизата проводили на бумаге «Ленинградская средняя» и FN - 7 в системах 1,2,3. Для его обнаружения использовали проявитель 1. На хроматограммах кроме глюкозы и фруктозы других сахаров не обнаружено.

Гель-фильтрация суммы фруктозанов

Навеску (0,05 г) суммы фруктозанов растворяли в 2 мл воды и вносили в колонку с сефадексом G-25. Колонку калибровали пропусканием известных декстранов. В результате фруктозаны оказались полидисперсными, т.е. имели 2 пика.
Фракционирование фруктозанов

К 100 мл 10%-ного раствора исходного фруктозана прибавляли последовательно по 50 мл раствора 96% - ного этанола в соотношении от 1:0,5 до 1:4. Фракции разделяли центрифугированием и последовательно промывали этанолом, ацетоном, после чего сушили на воздухе.

Определение молекулярной массы однородных фракций фруктозанов [125]

Навеску (0,02 г) отдельных фракций фруктозанов растворяли в 5 мл воды и вносили в колонку (1,2х54) с сефадексом G - 25. Колонку калибровали пропусканием образцов декстранов ММ 10000 (Ve= 31 мл), инулина 5600 (Ve= 48,8 мл) и раффинозы 504 (Ve= 57,8 мл). Элюент собирали по 2,5 мл. Обнаружение фруктозанов проводили фенол-серным методом. В результате было получено 2 фракции с ММ 1350 и 1020 соответственно.

Определение мономерного состава однородных фракций фруктозанов

Навеску отдельных фракций фруктозанов (0,1 г) растворяли в 5 мл 0,5% - ной соляной кислоты, гидролизовали на кипящей бане в течение 45 минут. Гидролизат нейтрализовали в вакууме. Остаток анализировали с помощью бумажной хроматографии (Ленинградская средняя и FN-7) в системе №1, используя трехкратное повторение. Обнаружение проводили реагентами №1. На хроматограммах, кроме глюкозы, фруктозы и сахарозы, были обнаружены также такие моносахариды, как кестоза, стахиоза и несколько неизвестных.

Определение фруктозы однородных фракций фруктозанов [119]

В мерную колбу пипеткой отбирали 5 мл исследуемого раствора, добавляли 5 мл 1% - ного спиртового раствора резорцина и 15 мл 30% - ного раствора соляной кислоты. В другую колбу вместо экстракта приливали 5 мл воды и остальные реактивы, как в опытной пробе (контрольный опыт). Содержимое в колбах перемешивали и помещали колбы на 20 минут на водяную баню, где поддерживали постоянную температуру. Замеряли интенсивность окраски на ФЭК - 56 с зеленым светофильтром (540 нм).
Контрольную пробу использовали в качестве эталона для сравнения. Содержание фруктозы в фруктозанах вычисляли по градуированному графику, составленному заранее.

Периодатное окисление и распад по Смиту однородных фракций фруктозанов

Навески (0,2 г) образцов фруктозанов растворяли в 50 мл воды, добавляли по 10 мл 0,25 М раствор периодата натрия. Смесь выдерживали в темноте при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Через сутки отбирали пробы на анализ. Расход периодата натрия определяли титрованием 0,01 н. раствором едкого натрия.
По окончании периодатного окисления избыток периодат - иона удаляли боргидридом натрия (0,1 г), фильтровали и полученную смесь подвергали диализу, затем нейтрализовали на катионите КУ - 2 (в Н+ - форме) до нейтральной реакции среды. Раствор концентрировали под вакуумом, после чего прибавляли 2,5 мл 0,5н. раствора серной кислоты и гидролизовали на кипящей водяной бане в течение 4 - х часов. После гидролиза смесь нейтрализовали карбонатом бария, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток анализировали методом бумажной хроматографии (FN - 7, системы - 1,3, реагент № 1, 2, 5).

Метилирование по Хакомори [77]

Навеску (0,02 г) фруктозана растворяли в 2 мл диметилсульфоксида (ДМСО). Отдельно растворяли (0,01 г) гидрида натрия в 2 мл ДМСО при температуре 40 - 50СО до появления сине - зеленого цвета, затем объединяли его с раствором фруктозана и выдерживали при перемешивании на магнитной мешалке в течение 5 - 6 часов в токе азота. Далее прибавляли 1 мл иодистого метила и диализовали. Полученный раствор экстрагировали по 4 - 5 мл хлороформом, объединяли все экстракты и концентрировали до сиропа. Полноту метилирования контролировали с помощью тонкослойной хроматографии (система №2, реагент № 4) и ИК - спектроскопией (отсутствие полос валентных колебаний гидроксильных групп). Для достижения исчерпывающего метилирования операцию повторяли дважды.

Формолиз и гидролиз перметилатов

Полностью метилированный продукт концентрировали до сиропа, добавляли 5 мл муравьиной кислоты, нагревали на кипящей водяной бане в течение одного часа, далее прибавляли метанол и упаривали досуха. Остаток гидролизовали 2,5 мл 0,5 н. раствора серной кислоты в течение 3 часов на кипящей водяной бане. После нейтрализации карбонатом бария смесь фильтровали и концентрировали до сиропа. Метилированные продукты анализировали методом тонкослойной хроматографии (системы № 1, 2, 3, реагент № 1,3). Во всех фракциях были идентифицированы следующие метилированные моносахариды: 2,3,4,6 - тетра - О - метил - D - глюкоза, 1, 3, 4, 6 - тетра - О - метил - D - фруктоза, 3, 4, 6 - три - О - метил - D – фруктоза.

Выделение пектиновых веществ (ПВ) [4]

Растения (корни) после выделения фруктозанов и глюкоманнанов обрабатывали смесью равных объемов 0,5% - ного раствора щавелевой кислоты и щавелекислого аммония (1:30) при 70Со в течение 3 часов. После фильтрации экстракцию шрота повторяли еще три раза. Экстракт объединяли, упаривали до половины объема, диализовали. Экстракт концентрировали до25%-ного содержания сухих веществ. ПВ осаждали ацетоном в соотношении 1:3. Через сутки осадок отделяли, промывали ацетоном, эфиром и сушили в эксикаторе.
Определение мономерного состава пектиновых веществ

Навеску (0,1г) ПВ растворяли в 5 мл воды, помещали в ампулы объемом 10 мл, прибавляли по 5мл 2н серной кислоты, запаивали и выдерживали на кипящей водяной бане в течение 72 часов при 95 – 100 0 С. По истечении этого времени содержимое ампулы нейтрализовали карбонатом кальция до рН=6,5, центрифугировали в течение 15 минут, фильтрат концентрировали до сиропа при 40ОС. Образцы сиропов анализировали с помощью бумажной хроматографии в системе1, обнаружение проводили реагентом 1. На хроматограммах с использованием свидетелей были идентифицированы глюкоза, манноза, ксилоза, рамноза и преобладающее количество галактуроновой кислоты.

Определение молекулярной массы пектиновых веществ

По 0,05г отдельных фракций пектиновых веществ пропускали через колонку (65.0х1,6), заполненную сефадексом G – 100, и элюировали водой. Через эту же колонку пропускали декстраны с ММ 20000,15000, 10000 и инулин (ММ=5600). Элюенты собирали по 2мл, анализировали фенол-серным методом. В результате выяснили, что полученные пектиновые вещества полидисперсны.

Фракционирование пектиновых веществ

2,5г исходного пектинового вещества растворяли в 100мл воде. К раствору добавляли 50мл этанола и перемешивали на магнитной мешалке в течение 5 минут. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали этанолом и ацетоном. К раствору добавляли последовательно несколько раз по 50 мл этанола до исчезновения мути. В результате были получены 3 фракции.

Периодатное окисление пектиновых веществ

Навески (0,15 г) образцов пектиновых веществ растворяли в 50 мл воды, добавляли по 10 мл 0,25 М раствора периодата натрия. Смесь выдерживали в темноте при комнатной температуре при постоянном перемешивании. Через сутки отбирали пробы на анализ. Расход периодата натрия определяли титрованием 0,01 н. раствором едкого натрия.
По окончании периодатного окисления избыток периодат - иона удаляли боргидридом натрия (0,1 г), фильтровали и полученную смесь подвергали диализу, затем ее нейтрализовали на катионите КУ - 2 (в Н+ - форме) до нейтральной реакции среды. Раствор концентрировали под вакуумом, после чего прибавляли 2,5 мл 0,5н. раствора серной кислоты и гидролизовали на кипящей водяной бане в течение 8 - часов. После гидролиза смесь нейтрализовали карбонатом бария, фильтровали и концентрировали в вакууме. Остаток анализировали методом бумажной хроматографии (FN - 7, системы - 1,4, реагент № 1, 4).

Выделение гемицеллюлозы [4]

С целью выделения гемицеллюлоз остатки сырья после извлечения пектиновых веществ экстрагировали 10%-ным раствором NаОН в соотношении сырье: растворитель – 1:10 при комнатной температуре в течение 24 часов при перемешивании. Экстракцию повторяли четырежды. После нейтрализации уксусной кислотой экстракт диализовали и концентрировали до содержания сухих веществ 25%, а затем осаждали ацетоном (1:3).

Определение сесквитерпеновых лактонов [66]

Для определения сесквитерпеновых лактонов 5 г сырья последовательно высушивали, измельчали и просеивали через сито с отверстиями 2 мм. Затем помещали его в круглодонную колбу, приливали раствор хлороформа в соотношении 1:3 и экстрагировали при комнатной температуре в течение 10 ч. Экстракцию повторяли трижды. Объединенный экстракт фильтровали, затем упаривали под вакуумом до полного удаления хлороформа и образования густого сиропа, после чего высушивали на воздухе.

Определение смолы и каучука [66]

5 г высушенного, измельченного и просеянного сырья помещали в круглодонную колбу емкостью 250 мл, снабженную обратным холодильником, приливали ацетон и нагревали на кипящей водяной бане. Смесь кипятили в течение 30 минут, затем фильтровали на воронке Бюхнера, а оставшееся сырье вновь подвергали двухкратной обработке ацетоном в течение 15 минут.
Ацетоновый экстракт переливали в заранее взвешенную, сухую круглодонную колбу и упаривали раствор до исчезновения ацетона. Остаток высушивали при 70ОС в сушильном шкафу в течение 3 часов. Остаток в виде густого сиропа вместе с колбой взвешивали и вычитали вес пустой колбы (общий вес А смолы). Затем в колбу с остатком густого сиропа приливали растворитель каучука – хлороформ. Экстракцию проводили при комнатной температуре в течение 12 ч. Хлороформовый экстракт переливали в заранее взвешенную, сухую круглодонную колбу и упаривали раствор до удаления хлороформа. Остаток высушивали при 50-60ОС в сушильном шкафу в течение 3 ч. Колбу с каучуком взвешивали, вычитали вес пустой колбы и находили вес каучука.
Вес смолы соответствует разнице между общим весом А и весом каучука.

Определение зольности [66]

В прокаленный до постоянной массы тигель помещали навеску 1г. Тигель ставили в муфельную печь и прокаливали при температуре 500ОС в течение 1 ч. После чего тигель с золой вынимали из муфеля, охлаждали в течение 5 мин на воздухе, а затем в эксикаторе и взвешивали.
Расчет зольности сырья производили по формуле:
13 EMBED Equation.3 1415
где, m1 – вес золы, г.
m – навеска сырья, г.

Определение жиров [66]

Предварительное высушенное, измельченное растительное сырье помещали в круглодонную колбу с обратным холодильником и экстрагировали петролейным эфиром на водяной бане в течение 1 часа. Экстракт фильтровали через бумажный фильтр. Экстракцию повторяли трижды. Объединенные экстракты помещают в заранее взвешенную сухую круглодонную колбу и отгоняли петролейный эфир. На дне колбы оставалось вещество, которое и является жиром этого растения.

Определение общего содержания алкалоидов [66]

Принцип метода основан на способности алкалоидов количественно осаждаться раствором кремневольфрамовой кислоты с образованием при этом комплексных солей. При сжигании осадка алкалоид сгорает, остается кремневольфрамовая кислота. На этом основании представляется возможным учесть количество чистого алкалоида.
10 г воздушно-сухого вещества помещали в коническую колбу на 500 мл и приливали 100 мл эфира, 50 мл дихлорэтана, 10 мл 15% - ного раствора аммиака, смесь хорошо встряхивали и оставляли на ночь для извлечения алкалоидов. Если отстоявшаяся жидкость над осадком будет недостаточно прозрачна, прибавляли еще несколько капель воды и встряхивали, благодаря чему наступало быстрое осветление. Затем жидкость фильтровали через воронку Бюхнера, осадок промывали эфиром, а фильтрат помещали в цилиндрическую делительную воронку и последовательно 3-4 раза встряхивали с 25 мл 1% - ной соляной кислоты, как можно полнее отделяя водный раствор кислоты. Алкалоиды переходили в раствор кислоты, образуя солянокислую соль.
Солянокислый экстракт, содержащий соли алкалоидов, переносили в коническую колбу на 250 мл и осаждали 20% - ным раствором кремневольфрамовой кислоты, прибавляя последний по каплям. Полученный осадок перемешивали, проверяли на полноту осаждения, прибавляя осторожно, по стенке 2-3 капли раствора кремневольфрамовой кислоты и оставляли стоять в течение ночи (18-20 ч.). Затем осадок отфильтровывали через асбест в тигль. Осадок кремневольфрамовой кислоты с алкалоидами промывали в тигле как можно малым количеством 1% - ной соляной кислоты, сушили при 100ОС до постоянного веса и сжигали в муфельной печи. Алкалоид сгорал и оставалось то количество кремневольфрамовой кислоты, которое связывало алкалоид.
Разность между весом осадка до и после прокаливания соответствует сухому весу алкалоида.
Процентное содержание алкалоидов в материале вычисляют по формуле:
13 EMBED Equation.3 1415
где, а – найденное количество алкалоидов в исследуемой навеске (после прокаливания тиглей),
н – навеска взятого для анализа материала.

Определение дубильных веществ [66]

Для анализа брали навеску измельченных растений и подвергали экстракции водой и 50%-ным раствором мочевины в течение часа при комнатной температуре. С помощью раствора мочевины извлекали дубильные вещества из растений полностью. К 1 мл опытного экстракта прибавляли 4 мл смеси (50% - ный раствор мочевины в 0,1 М ацетатном буфере), 1% - ный раствор гуммиарабика и 5% - ный раствор NH4Fe(SO4)2 . 12H2O (в соотношении 90:10:1) реактивов и после перемешивания определяли интенсивность окраски на фотометре при 680 нм. Окраска устойчива в течение двух часов и ее интенсивность пропорциональна концентрации дубильных веществ в интервале 40-400 мкг в 5 мл.

Определение общего азота [66]

0,1 г высушенного, измельченного сырья помещали в термостойкую колбу на 200 мл с длинным горлом, приливали 15 мл серной кислоты и каплю металлической ртути в качестве катализатора и нагревали сначала на слабом, затем на сильном пламени горелки. Жидкость в колбе вначале чернеет, а затем по мере окисления вещества светлеет и становится совершенно бесцветной. Для полноты окисления смесь нагревали еще 10 мин.
В колбу со смесью приливали 2 мл 0,01н серной кислоты, после отгона аммиака прибавляли 2 мл 5% - ного раствора KJ и 0,1 мл 4% - ного раствора KJO3. Через 5 мин добавляли 2 капли крахмального клейстера и выделившийся иод оттитровывали 0,01 н раствором гипосульфита натрия до обесцвечивания раствора, где 0,02 мл 0,01н раствора гипосульфита натрия будет соответствовать 0,0028 мг азота. 0,14 мг, умноженное на разницу в мл между количествами первоначально взятой кислоты и израсходованного гипосульфита натрия, дают количество азота.
ГЛАВА ІІІ. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Растения Eremurus относятся к роду Eremurus семейства Liliaceae. На территории СНГ насчитывается около 50 видов этих растений, причем 30% от видового их количества произрастает на территории Кыргызстана [3, 118].
Eremurus, произрастающие в Кыргызстане, распространены в основном в западных районах на высоте от 700 до 2800 м над уровнем моря и считаются сорняками пастбищ и сенокосов.
Eremurus характерны для флоры Средней Азии и применяются с древних времен. Название эремурусов трактуется по разному, например: кыргызы их называют «чырыч» или «кулун жал», «ширяч» - это по-узбекски, «ширях» - по-казахски и «шырыш» - по-таджикски [119]. Изучение биологии, физиологии и химии растений рода Eremurus проводилось А.П.Хохряковым и Д.А.Рахимовым [118, 42]. Вид E. Cristatus, произрастающий в Кыргызстане, с точки зрения химического состава и свойств еще не изучен.
Все части Eremurus содержат красители и они хорошо растворяются в воде. Сухие, измельченные в порошок, клубни Eremurus еще с древних времен использовались в Средней Азии для получения «ширяшного» клея, который использовался для окраски тканей, кожи, в сапожном деле, в строительстве при добавке к строительным растворам.
Химическое изучение растений рода Eremurus было начато под руководством Б.Н. Степаненко [9], а затем продолжено Д.А.Рахимовым и З.Ф.Исмаиловым [58]. Свойства, строение, а также динамика накопления эремурана изучались рядом учеными [40, 15, 45, 46, 18] и ими были намечены пути практического его использования.
В институте химии и химической технологии НАН КР и затем в Инновационном центре фитотехнологий велось систематическое изучение углеводов рода Eremurus, произрастающих на территории Кыргызстана, аналогично изучению структур и свойств растений вида E. Cristatus. К началу нашей работы сведения о структуре глюкоманнанов и фруктозанов в этих растениях отсутствовали. Установлено, что корни этих растений богаты на содержание олиго - и полисахаридов, поэтому нам представляло интерес проведение изучения полисахаридов, гомогенных фракций глюкоманнанов и фруктозанов, выделенных из этих растений.

3.1. Общая характеристика углеводного состава растений родов Eremurus, произрастающих в Кыргызстане

Нами были исследованы растения рода Eremurus, произрастающие в пределах Кыргызстана. Сырье было заготовлено в разные периоды вегетации и проведено сравнение [120].
Сырье после измельчения до размера 0,5-1,0 мм и просеивания сначала обрабатывалось 96%-ным, а затем 82%-ным этиловым спиртом. Далее в сгущенном спиртовом экстракте определялось наличие моносахаров, после чего проводился гидролиз спиртового раствора и было определено количественное содержание олигосахаридов. В шроте, обработанном водой, при последующем гидролизе были определены полисахариды.
В табл. 3.1. представлены данные [121, 122] о количественном составе углеводов по периодам вегетации растений рода Eremurus, произрастающих в Кыргызстане. Количественное содержание моно -, олиго - и полисахаридов было определено по методу [123], пектиновых веществ [ПВ] и гемицеллюлозы [ГЦ] по методике [4].
Таблица 3.1. – Характеристика углеводов в растениях рода Eremurus по периодам вегетации, %

Вид растения
Фаза развития
Иссле-дуемый орган
Моносаха-риды
Олиго-саха-риды
Поли-саха-риды
Сум-
ма
саха-ридов
ПВ
ГЦ

1
2
3
4
5
6
7
8
9

Э.Млечно-
цветный
E.Laktiflorus
Бутонизация


Цветение

Плодоно-
шение
Корни
Надземн. часть (н/ч)
Корни
Н/ч
Корни
Н/ч
11,9

16,4
5,3
8,8
3,1
4.1
23,7

14,3
17,7
14,0
14,9
10,8
8,1

7,0
22,1
4.2
28,8
3,7
43,7

37,7
45,1
27,0
46,8
18,6
3,1

2.0
4,2
1,7
0,6
1.0
4.9

4,6
4,8
4,3
3,9
4,2

Продолжение
Э.Кристатус
E.Cristatus
Бутонизация

Цветение

Плодоно-шение
Корни
(н/ч)
Корни
Н/ч
Корни
Н/ч
14,5
17,5
5,2
9,2
1,1
3,2
22,4
15,4
19,2
13,9
11,3
8,2
13,0
8.1
30,8
4,4
48,2
4,4
49,9
41,0
55,2
27,5
60,6
15,4
3,9
2,1
4,2
1,7
0,6
1,2
11,0
6,8
10,5
4,0
10,3
3,9

Э. Тяньшан-
ский
E. Tianschanicus
Бутонизация

Цветение

Плодоно-шение
Корни
(н/ч)
Корни
Н/ч
Корни
Н/ч
12,0
17,8
10,2
13,5
9,9
4,5
15,0
19,6
16,9
16,0
16,8
9,0
0,9
3,1
1,2
2,0
1,8
1,2
27,9
40,5
28,3
31,5
28,5
14,7
2,7
3,1
3,6
2,8
2,1
2,4
10,7
8,2
6,6
7,9
6,0
7,2

Э.Загорелый
E. Fuscus
Бутонизация

Цветение

Плодоно-шение
Корни
(н/ч)
Корни
Н/ч
Корни
Н/ч
11,3
19,2
5,0
8,7
3,3
3,7
20,0
14,4
16,2
11,0
12,3
9,3
12,1
7,9
26,2
4,7
34,0
4,3
43,4
41,5
47,4
24,4
49,6
17,2
2,1
3,3
3,1
2,9
2,0
2,5
6,7
7,1
6,2
6,9
6,8
5,9

Э. Регели
E. Regeli
Бутонизация

Цветение

Плодоно-шение
Корни
(н/ч)
Корни
Н/ч
Корни
Н/ч
12,1
18,0
4,9
8,9
1,4
3,3
12,0
15,1
18,2
12,7
10,1
8,8
3,6
8,8
33,3
5,0
40,8
4,2
44,7
41,9
56,4
26,6
52,3
16,3
2,5
2,2
2,3
2,2
2,0
2,3
9,1
5,1
7,8
5,2
7,0
4,7

Э. Согдийский
E. Sogdianus
Бутонизация

Цветение

Плодоно-шение
Корни
Н/ч
Корни
Н/ч
Корни
Н/ч
12,2
17,9
6,2
9,0
2,6
4,4
19,7
16,0
16,3
13,6
12,0
11,1
12,6
6,6
27,9
3,1
36,7
2,5
44,5
40,5
50,4
25,7
51,3
18,0
1,7
0,9
1,6
1,0
1,4
1,0
8,8
12,0
7,9
9,3
8,2
8,8

Э. Мощный
E. Rodustus
Бутонизация

Цветение

Плодоно-шение
Корни
(н/ч)
Корни
Н/ч
Корни
Н/ч
13,3
20,0
7,9
10,1
4,3
4,1
19,2
15,9
14,7
10,9
13,1
9,7
12,6
8,5
27,1
4,9
33,3
3,2
45,1
44,4
49,7
25,9
50,7
17,0
2,1
1,7
2,0
1,3
2,0
1,1
9,2
5,3
7,8
5,6
7,1
5,4

Э. Песчаный
E. Lutsus
Бутонизация

Цветение

Плодоно-шение
Корни
(н/ч)
Корни
Н/ч
Корни
Н/ч
12,0
21,0
4,7
11,3
3,0
2,7
20,1
17,0
17,1
12,2
12,5
7,1
13,3
5,5
26,0
4,0
34,4
2,2
45,4
43,5
47,8
27,5
49,9
12,0
2,2
1,6
2,0
1,2
1,9
1,0
7,9
5,2
6,1
5,3
5,9
6,2


Как видно из табл.3.1, во все периоды роста растений в корнях имело место увеличение содержания полисахаридов, достигая максимума в фазе плодоношения. Содержание моно - и олигосахаридов было выше, когда растения находились в стадии роста, и они представляли собой зеленую массу, в период цветения и плодоношения их содержание уменьшалось. В надземных частях растений накапливались преимущественно олигосахариды.
Максимальное содержание полисахаридов наблюдалось в корнях растений Е. Cristatus, Е. Regeli и Е. Sogdianus - 48,2; 40,8 и 36,7%, соответственно.
Для разделения углеводов, содержащихся в корнях растений E. Cristatus, была разработана универсальная схема [122].
Дополнительно проводились исследования по изменению содержания углеводов в корнях растений E. Cristatus в течение года [121] (табл.3.2.).

Таблица 3.2. - Изменение содержания углеводов в корнях E. Cristatus в течение года, %

Фаза развития
Дата сбора
Моносаха-риды
Олигосаха-риды
Полисаха-
риды

Розеточная форма
Март-апрель
2002г
11,1
22,8
10,6

Бутонизация
Апрель-май
6,0
20,3
13,5

Цветение
Май 2002г
4,6
18,9
31,5

Плодоношение
Июнь 2002г
0,8
8,8
47,9

Отмирание
Июль-август
2,3
16,9
28,8

Покой
Сентябрь-декабрь 2002г
2,4
11,6
15,9

Покой
Январь-февраль 2003г
8,0
23,2
5,6


Как показывают данные табл. 3.2. по мере роста и развития растения в корнях накапливались полисахариды, достигая максимума в фазе плодоношения (47,9%), после чего, вплоть до января-февраля их содержание постепенно уменьшалось до уровня 5,6%, так как имел место частичный их распад, о чем свидетельствует увеличение содержания олигосахаридов - до 22,8% в розеточной форме.
Таким образом, соотношение олиго - и полисахаридов играет важную роль в химических изменениях растений (переход полисахаридов к олигосахаридам) и охватывает весь цикл произрастания растений. Присутствие этих соединений составляет главную биологическую ценность в жизнедеятельности растений рода Eremurus.
Было также проведено изучение изменения содержания углеводов в корнях и надземной части (н/ч) этого растения при его хранении (2003, 2005 гг.) и в свежезаготовленном виде [124] (табл. 3.3.).
Таблица 3.3. - Характеристика углеводного состава при хранении, %

Фаза развития, год сбора
Исследуемые органы растений
Содержание углеводов



моносахариды
олигосахариды
полисахариды

Бутонизация
15.04.2003
Корни
Надземные части (н/ч)
2,0
1,2
13,0
7,0
4,2
0,1

Цветение
17.05.2003
Корни
Н/ч
2,0
1,8
8,9
5,7
16,2
0,2

Плодоношение
15.06.2003
Корни
Н/ч
0,9
2,0
5,1
1.8
19,8
0,1

Бутонизация
13.04.2005
Корни
Н/ч
6,2
2,1
18,2
12,7
8,3
0,4

Цветение
12.05.2005
Корни
Н/ч
4,3
2,6
18,8
7,0
32,0
0,9

Плодоношение
15.06.2005
Корни
Н/ч
1,9
5,5
10,9
3,2
46,0
0,3


Как видно из табл. 3.3. по мере роста растений в корнях увеличивается содержание полисахаридов, в это же время происходит уменьшение содержания моно - и олигосахаридов. В надземных частях содержание полисахаридов незначительно, а максимальное содержание олигосахаридов приходится на период бутонизации (18,2%).
Потери углеводов при хранении за один год в корнях в фазе бутонизации составляют: моносахариды – 2,0% , олигосахариды – 13,0% и полисахариды -4,0%, когда в свежезаготовленном сырье их содержание соответствует 6,2%, 18,2% и 8,3%. Таким образом, напрашивается вывод, что хранить сырье более года не рекомендуется, так как наблюдаются большие потери углеводов.
Далее нами было изучено содержание углеводов по периодам вегетации в различных органах растений [121-122, 124-125] (табл. 3.4.).
Растения [126] были собраны на одном и том же месте близ местечка Чер Ферганской долины Джалал-Абадской области и в селе Стрельниково Чуйской долины. Отбор проб на анализ производился от начала вегетации растения до его плодоношения. В каждом органе растения в зависимости от периода вегетации было определено содержание моносахаридов (МС), олигосахаридов (ОС), пектиновых веществ (ПВ), гемицеллюлозы (А) и (Б) (ГЦ) и
·- целлюлозы, в водных экстрактах - водорастворимых полисахаридов (ВРПС).
Полученные результаты приведены в табл. 3.4.

Таблица 3.4. – Характеристика динамики накопления углеводов в различные фазы развития в надземной и подземной частях растений Е. Cristatus, %

Дата и место сбора,
фаза развития
Исследуемый орган
МС
ОС
Полисахариды





ВРПС
ПВ
Гемицеллюлоза

· –цел-за







А
Б


1
2
3
4
5
6
7
8
9

2 апреля, Чуйская долина, ростки
листья
6,9
11,0
0,1
5,1
10,9
3,3
3,0

30 марта, Ферганская долина, ростки
листья
8,4
11,4
0,6
4,0
10,8
3,2
3,2

15 апреля, Чуйская долина, бутонизация
листья
4,3
16,5
1,7
4,2
12,1
3,9
4,1

12 апреля, Ферганская долина, бутонизация
листья
6,3
18,7
1,9
4,3
12,7
4,1
4,2

20 мая, Чуйская долина, цветение
листья
6,3
10,0
3,7
6,2
15.7
3,5
5,9

16 мая, Ферганская долина, цветение
листья
2,2
12,2
3,8
7,4
15,7
3,7
6,1

22 июня, Чуйская долина, плодоношение
листья
1,7
2,1
1,4
7,2
4,1
6,6
12,0


Продолжение

18 июня, Ферганская долина, плодоношение
листья
2,9
2,2
1,6
8,0
4,7
6,8
12,2

15 апреля, Чуйская долина, бутонизация
цветонос
12,6
20,2
0,09
2,4
5,1
14,2
6,3

12 апреля, Ферганская долина, бутонизация
-//-
13,8
21,0
0,1
2,7
5,3
14,4
6,4

20 мая,
Чуйская долина, цветение
-//-
6,7
3.7
0,3
1,7
6.6
7,6
14,8

16 мая,
Ферганская долина, цветение
-//-
6.9
3,9
0,5
1,8
6,7
7,5
15,0

22 июня, Чуйская долина, плодоношение
-//-
0.2
0.18
-
3,1
6,6
5,0
17,5

18 июня, Ферганская долина, плодоношение
-//-
0.2
0.2
0,01
3,2
6,7
5,1
17,7

15 апреля, Чуйская долина, бутонизация
стебли
2.4
4.6
2.2
8.1
5,3
6,2
4,2

12 апреля, Ферганская долина, бутонизация
-//-
2.6
4.8
2,6
8,2
5,5
6,3
4,0

20 мая,
Чуйская долина, цветение
-//-
1.1
0.6
1,9
8,8
5,1
5,1
5,3

16 мая, Ферганская долина, цветение
-//-
1.3
0.8
2,1
8,9
5,0
5,2
5,5

22 июня, Чуйская долина,
плодоношение
-//-
0.7
0.9
2,0
7,1
4,7
6,6
5,0










Продолжение


8 июня, Ферганская долина, плодоношение
стебли
0,8
0,9
2,2
7,2
4,3
6,5
5,2

2 апреля, Чуйская долина, ростки
корни
4,3
7,1
8,0
0,9
0,8
2,1
3,3

30 марта, Ферганская долина, ростки
-//-
6,7
10,8
10,6
1,3
1,2
2,7
3,6

15 апреля, Чуйская долина, бутонизация
-//-
4,2
18,1
11,3
1,8
2,2
3,1
7,3

12 апреля, Ферганская долина, бутонизация
-//-
6,4
21,2
13,7
2,4
2,4
3,7
7,8

20 мая,
Чуйская долина, цветение
-//-
6,3
18,4
32,7
2,9
3,4
6,1
9,0

16 мая, Ферганская долина, цветение
-//-
8,7
19,0
34,3
3,1
3,9
6,0
9,9

22 июня, Чуйская долина, плодоношение
корни
1,1
10,1
46,1
3,3
4,8
5,1
11,1

18 июня, Ферганская долина, плодоношение
-//-
0,9
12,6
48,9
4,0
5,4
5,5
13,0


Установлено, что в подземных органах растений полисахариды обнаруживаются на самых ранних фазах развития и подвергаются количественным изменениям на протяжении всего вегетационного периода, достигая максимального содержания в фазе плодоношения.
Как видно из данной табл.3.4. в количественном отношении в листьях, цветоносах и стеблях преобладают МС, ОС, ПВ, ГЦ и
· - целлюлоза, а полисахариды присутствуют в малом количестве. Преобладающее содержание олигосахаридов и полисахаридов наблюдается в корнях растений [121,122. 127].
Установлено, что содержание углеводов зависит от места произрастания растения. Так в растениях, произрастающих в Ферганской долине, содержание МС, ОС, ПВ, ВРПС и ГЦ выше, чем у растущих в Чуйской долине. Это, по-видимому, объясняется более благоприятными почвенно-климатическими условиями.
Установлено, что наибольшее количество пектиновых веществ в листьях содержится в фазе плодоношения – 8,0%, гемицеллюлозы (А) в фазе цветения – 15,7%, а гемицеллюлозы (Б) – в фазе плодоношения, так же как и
· – целлюлозы и равно, соответственно, 12,2 и 6,8%.
В цветоносах в фазе бутонизации достигает максимума содержание МС – 13,8%, ОС – 21,0% и ГЦ (Б) – 14,4%, причем преобладают олигосахариды и гемицеллюлоза Б.
В стеблях ПВ преобладают в фазе цветения (до 8,9%), ГЦ (Б) – в фазе плодоношения (до 6,6%). Количество же остальных сахаров равномерное.
Как видно из табл. 3.4., в корнях в основном содержатся олиго- и полисахариды. Количество полисахаридов начинает резко увеличиваться в фазе цветения, достигая максимума 46,1 – 48,9% в фазе плодоношения. В корнях основным продуктом являются полисахариды.
Для сравнения нами был подробно изучен химический состав корней E. Cristatus и установлено, что кроме углеводов в составе корней E. Cristatus еще присутствует ряд других веществ. Основным продуктом является глюкоманнан. Результаты приведены в табл. 3.5.



Таблица 3.5. – Характеристика химического состава корней растений E. Cristatus (фаза плодоношения)

Вещество
Содержание, %

Вода
Общий сахар:
в том числе,
моносахариды
олигосахариды
полисахариды:
глюкоманнаны
пектиновые вещества
гемицеллюлозы: А
-//- В
Несахаристые вещества:
алкалоиды
красящие вещества
сапонины
белковые вещества
дубильные вещества
эфирное масло
зола
смола
каучук
общий азот

75 - 80
72,2

1,1
9,2

48,9
4,0
4,0
5,0

0,04
2,5
2,8
2,0
2,5
1,7
10,8
1,2
0,7
3,2


Из табл. 3.5. видно, что в корнях растения E. Cristatus, кроме основных продуктов – углеводов, присутствуют еще ряд других веществ.

3.2. Общая характеристика полисахаридов из корней растений
E. Cristatus

Растения E. Cristatus были собраны 2006 г. в селе Стрельниково Чуйской долины в фазе плодоношения. Воздушно-сухое, измельченное сырье корня сначала обрабатывалось 96%-ным, затем 82%-ным кипящим этанолом для удаления олигосахаридов (низкомолекулярных соединений) и красящих веществ.
Сырье, оставшееся после обработки спиртом, было подвергнуто экстрагированию водой при комнатной температуре в течение 3 часов при соотношении 1:10, после чего раствор был отделен центрифугированием. К шроту была добавлена новая порция воды и проведено повторное экстрагирование. Объединенный экстракт был очищен от белков с помощью метода севага [128]. Выпавший белок был отделен центрифугированием. Затем из раствора при добавлении этанола был осажден полисахарид. После фильтрации и промывки, высушивание проводилось на воздухе. Выход продукта составляет 48%.
Водорастворимый полисахарид представляет собой порошок белого цвета, не дает качественной реакции с йодом, т.е. синего окрашивания, что указывает на отсутствие полисахарида типа крахмала.
Изучение полисахарида нами проводилось методом гель-хроматографии [129, 130], позволяющим определить его однородность. В результате исследования изучаемый полисахарид оказался полидисперсным. Мономерный состав и соотношение глюкозы и маннозы представлены в табл. 3.6.

Таблица 3.6. – Физико-химические характеристики фракций глюкоманнанов

Фрак-
ции
Общий объем прибав-ленного спирта, мл
Выход,
% к ВРПС
[
·]22Д град
(1,0,Н2О)


· отн
(с:1,0 Н2О),
t=220С
Молеку-лярный
вес
Соотношение
глюкозы и маннозы


1
2
3
4
50
100
150
200
2,1
68,5
29,0
6,0
-
-36,5
-36,7
-37,0
-
3,4
3,4
2,4
-
65700
64000
62400
-
1:2,9
1:3,0
1:2,95


Как видно из табл. 3.6. с уменьшением молекулярного веса фракции глюкоманнанов снижается относительная вязкость, а значение угла удельного вращения и соотношение глюкозы и маннозы увеличивается. Для дальнейшего изучения строения глюкоманнана нами была взята фракция Ф-2, являющаяся основным продуктом и имеющая наибольший выход.
Из остатков сырья последовательно были выделены водорастворимые полисахариды (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ) и гемицеллюлозы (ГЦ) А и Б. Для определения содержаний ПВ и ГЦ, чтобы не мешали примеси, сначала был удален ВРПС.
Для определения моносахаридного состава был проведен гидролиз полисахаридов соляной кислотой. Состав гидролизата был установлен с помощью БХ с использованием проявителя анилин-фталата и фотоколориметра. Содержание полисахаридов и соотношение моносахаридов в них приведены в табл. 3.7.

Таблица 3.7. – Характеристика полисахаридов в корнях растений E. Cristatus

Тип полисахаридов
Выход от воздушно-сухого сырья, %
Соотношение моносахаридов



Gal
Gle
Man
Xyl
Ara
Rham

ВРПС
ПВ
ГЦА
ГЦБ
48,1
4,6
3,3
5,1
-
3,4
2,7
2,4
1,0
1,0
1,0
2,0
2,9
следы
1,0
1,0
-
1,0
1,0
1,3
-
1,0
1,6
1,4
-
4,3
2,1
2,8


Как видно из таблицы 3.7., в составе ВРПС обнаружены глюкоза и манноза при соотношении 1,0: 2,9. В ПВ присутствуют преимущественно галактуроновая кислота, галактоза и рамноза, а также следы ксилозы и арабинозы, а в ГЦА и ГЦБ - имеет место набор сахаров.
Таким образом, нами установлено, что ВРПС, полученные из корней растений E. Cristatus, состоят из смеси полимеров.
3.3. Общая характеристика полисахаридов из надземной части растений
E. Cristatus

Надземные части растений E. Cristatus [125, 127] были собраны в фазе бутонизации и каждая их часть анализировалась отдельно. Воздушно-сухое, измельченное сырье было обработано 96%-ным этанолом для удаления низкомолекулярных соединений и красящих веществ. Моно - и олигосахариды были выделены экстракцией 82%-ным этанолом. В их составе с помощью бумажной хроматографии (БХ) в системе н. бутанол-ацетон-вода (7:2:1) восходящим методом, используя в качестве проявителя кислый анилин-фталат на бумаге Ленинградская средняя, были обнаружены глюкоза, галактоза, манноза и галактуроновая кислота.
Из остатков растения последовательно были выделены также водорастворимые полисахариды (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ) и гемицеллюлозы (ГЦ) А и Б.
Для определения моносахаридов полисахарид был гидролизован соляной кислотой. Состав гидролизата был установлен с помощью БХ с использованием проявителя анилин-фталата и фотоколориметра. Содержание полисахаридов и соотношение моносахаридов в них приведены в табл. 3.8.

Таблица 3.8.- Характеристика полисахаридов н/ч растений E. Cristatus и их моносахаридного состава

Тип полисахаридов
Выход от воздушно-сухого сырья, %
Соотношение моносахаридов



Gal
Gle
Man
Xyl
Ara
Rham

Листья ВРПС
ПВ
ГЦА
ГЦБ
Цветы ВРПС
ПВ
ГЦА
ГЦБ
Стебли ВРПС
ПВ
ГЦА
ГЦБ
2,7
4,25
2,95
3,75
2,6
3,3
2,2
2,8
3,2
4,0
2,7
3,1
-
5,15
2,0
3,95
-
6,3
1,2
1,0
-
6,9
2,2
1,0
2,75
1,0
1,6
6,2
1,8
-
3,0
1,6
2,0
-
2,0
1,4
4,84
следы
следы
1,0
3,6
-
1,5
1,4
4,4
-
1,7
1,3
-
2,45
1,8
1,14
-
1,0
1,3
1,9
-
3,0
1,0
2,6
-
-
следы
1,2
-
1,8
1,2
1,7
-
2,2
1,5
3,0
-
6,6
3,9
2,6
-
7,6
1,0
4,2
-
7,2
1,1
2,3


Из табл. 3.8. видно, что ПВ, ГЦА и ГЦБ состоят из нейтральных сахаров, а в ПВ содержится в большом количестве еще и галактуроновая кислота.
Таким образом, нами было выяснено, что содержание углеводов в листьях, цветоносах и стеблях находится в прямой зависимости от места произрастания, фазы развития, а также исследуемого органа растения. ПВ, ГЦ (А) и (Б) состоят из нейтральных сахаров и галактуроновой кислоты, подобно растениям сем. Liliaceae.
Из смеси измельченного сырья надземной части листьев, цветов и стеблей был выделен полисахарид, включающий в себя предварительную обработку (дважды) изопропиловым спиртом (для удаления моно -и олигосахаридов, красящих и низкомолекулярных сахаров), затем из водных экстрактов водорастворимые полисахариды.
Водорастворимый полисахарид представляет собой порошок слегка желтоватого цвета, он не дает качественной реакции с йодом, т.е. синего окрашивания, что указывает на отсутствие полисахарида типа крахмала. В продуктах его гидролизации 5% Н2SO4 и последующей нейтрализации при помощи БХ были обнаружены манноза и глюкоза, т.е. полисахарид является глюкоманнаном.

3.4. Изучение строения глюкоманнана из корней растений
E. Cristatus
Для дальнейшего изучения строения глюкоманнана, выделенного из корней растений E. Cristatus мы исследовали однородность полисахарида по методу гель – хроматографии на колонке на колонке (1,6х60 см), заполненной сефадексом G-200 и откалиброванной по набору свидетелей-декстранов с молекулярной массой 40000 (Ve - 38,5мл), 80000 (Ve - 30,5 мл) и 110000 (Ve - 22,5мл).
Д, нм
Ve, мл
Рис.3.1. Гель-фильтрация исходного полисахарида на сефадексе G – 200.
С целью получения однородной фракции 1% - ный водный экстракт глюкоманнана был фракционирован растворами этилового спирта различных концентраций. В результате получили 3 фракции.
Обнаружение глюкоманнанов в элюенте определялось фенол-серным методом [125-126]. По данным гель-фильтрации фракция Ф-2 является однородной (Рис. 3.2).
Д, нм
V, мл






























































































Ve, мл
Рис.3.2. Гель-фильтрация глюкоманнана из фракции Ф-2
на сефадексе G – 200.
Угол удельного вращения определяли на сахариметре длиной трубки 10 см. Для этого готовили 1% - ный водный раствор глюкоманнана, который показал на приборе отрицательное значение угла - 36,5. Фракция Ф-2 далее подвергалась кислотному гидролизу 2н. Н2SO4 в течение 16 часов. После нейтрализации с помощью бумажной хроматографии была обнаружены глюкоза и манноза. Согласно данным фотоколориметра их соотношение составило 1:2,9.

а) ИК-спектроскопия глюкоманнана из фракции Ф-2

При снятии ИК-спектров [92] фракции Ф-2 была установлена, что в ней присутствуют полосы поглощения при 815 см-1, отвечающие гексапиранозному кольцу и при 840 см-1 – экваториальным деформационным колебаниям
· – сахаров, полосы при 815 см-1 – характерны для деформационных колебаний аксиальных связей С-Н, полосы при 1240 см-1 указывают на сложноэфирную связь, а при 1635 см-1 отвечают адсорбционной воде, а полосы поглощения при 1730 см-1 характерны для карбонильного поглощения или остатков уроновых кислот в сложноэфирной группе [92] (Рис. 3.3).

Рис. 3.3. ИК-спектры глюкоманнана из фракции Ф-2, снятые на приборе UR- 20 с KBr. Выделенный из раствора глюкоманнан по соотношению моносахаров и молекулярному весу отличается от ранее описанных полисахаридов растений Eremurus [15, 18, 45, 47, 48].
Для определения строения углеводной цепи глюкоманнана из фракции
Ф-2 были использованы методы периодатного окисления, исчерпывающего метилирования, частичного гидролиза, а также физические методы, применяемые при установлении структуры соединений данного класса.

б) периодатное окисление глюкоманнана из фракции Ф-2

Периодатное окисление применяется практически во всех случаях при установлении строения полисахаридов. Это связано с простотой метода, небольшими затратами исследуемого вещества и получением достоверных результатов. Окисление, как правило, проводят в темноте при 22оС в разбавленных водных растворах при строго контролируемых значениях рН среды [20]. Окисление фракции Ф-2 было проведено при комнатной температуре 0,5М раствором NaJO4. Окисление протекала медленно и завершилась через 192 ч (8 суток), после чего оставшееся количество расход периодата не менялось (рис. 3.4.).

·

сутки
Рис.3.4. Периодатное окисление глюкоманнана из фракции Ф-2.
Расход периодата натрия составил 0,93 моля на 1 моль ангидрогексозного звена, а количество выделившейся муравьиной кислоты составило 0,06 моль.
После распада по Смиту [83] методом БХ был обнаружен в основном эритрит (I) и следы глицерина (II). Так как моносахариды не были обнаружены, то отсюда следует, что гексапиранозные остатки соединены между собой линейно и в основной цепи глюкоманнана Ф-2 преобладают
·-(14) гликозидные связи, а также присутствует основной продукт – эритрит, характерный для такого типа связи.

13 SHAPE \* MERGEFORMAT 1415


в) метилирование глюкоманнана из фракции Ф-2

Для определения типа связи между моносахаридами глюкоманнана из фракции Ф-2 и для подтверждения результатов периодатного окисления было проведено метилирование два раза по Хакомори [77]. Полнота метилирования контролировалась с помощью ТСХ на силуфоле. Продукты метилирования фракции Ф-2 были получены с выходом 82% , с коэффициентом угла удельного вращения [
·]22Д – 21,5о для Ф-2 (С.1,0:СНСL3). Перметилат – белый аморфный порошок, растворимый в тетрагидрофуране, хлороформе, ацетоне, но не растворимый в воде. Отрицательное значение угла удельного вращения перметилата указывает на
· - конфигурацию гликозидной связи. В его ИК-спектре отсутствуют полосы поглощения, присущие гидроксильным группам. Содержание метоксильных групп составляет 41%.
Как правило, метилированные продукты плохо растворяются в воде, поэтому до кислотного гидролиза метилированный глюкоманнан подвергали формолизу действием 90%-ной муравьиной кислотой при 100оС с последующим гидролизом 2н. раствором серной кислоты при 100оС.
В гидролизатах методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) были идентифицированы 2,3,6-три-О-Ме-D-манноза (ІІІ), 2,3,6-три-О-Ме-D-глюкоза (ІV), а также следы 2.3,4,6-тетра-О-Ме-D-маннозы (V) и глюкозы (VІ).


13 SHAPE \* MERGEFORMAT 1415

Соотношение 2,3,6-три-О-Ме-D-глюкозы и маннозы по данным фотоколориметра составляет 1:2,9 для фракции Ф-2. Образование следовых количеств тетра-О-Ме-гексозы соответствует результатам периодатного окисления и указывает на высокую степень полимеризации фракций глюкоманнанов. Присутствие обоих тетра-О-Ме-гексоз свидетельствует о том, что цепь глюкоманнана на невосстанавливающемся конце имеет как глюкопиранозные, так и маннопиранозные остатки и связаны они между собой
·-(14) связью.
Полосы поглощения ИК-спектров при 882см-1 глюкоманнана из фракции
Ф-2, а также результаты метилирования, указывающие на отрицательное значение угла удельного вращения, его перметилата указывают на присутствие
· - гликозидной связи между гексапиранозными остатками. С целью подтверждения этого нами был использован метод окисления хромовым ангидридом [131] ацетилированных глюкоманнанов, согласно которому окислению подвергаются
· - гликозидные связи, так как в продуктах окисления не была обнаружена гексоза.
Таким образом, результаты периодатного окисления, распада по Смиту и исчерпывающего метилирования, окисление хромовым ангидридом позволяют сделать вывод, что глюкоманнаны состоят из
·-(14) связанных остатков. На восстанавливающем конце глюкоманнана находится маннозный остаток. Глюкоманнаны из растений E.Cristatus отличаются от глюкоманнанов, выделенных из других растений, по молекулярной массе (ММ), содержанию маннозы и степени полимеризации.

г) анализ спектра 13С-ЯМР глюкоманнана из фракции Ф-2

Химическими методами было установлено, что глюкоманнан из фракции Ф-2 состоит из глюкозы и маннозы, т.е. имеет структуру с повторяющимися звеньями.
С целью подтверждения полученных химических данных нами была изучена структура глюкоманнана с помощью метода 13С-ЯМР-спектроскопии [94, 132]. Из рисунка 3.5. видно, что область резонанса исследуемого глюкоманнана составляет от 60 до 105 м.д. Первую серию образуют более интенсивные сигналы при 101,5; 78,0; 76,5; 74,3; 72,9 и 71,5 м.д., что в соответствии с результатами анализов полимеров указывает на мономерный состав. Эту серию сигналов необходимо отнести на счет резонансов атомов углерода маннозных остатков.

Рис. 3.5. Химические сдвиги 13С-ЯМР глюкоманнана из фракции Ф-2 растений E. Cristatus, снятые на приборе WR-60 Bruker (рабочая частота по ядрам углерода 15,08 МГц).

Химические сдвиги 13С-ЯМР глюкоманнана из фракции Ф-2 растений E. Cristatus (в м.д.) приведены в табл.3.9.
Таблица 3.9.
Химические сдвиги 13С-ЯМР глюкоманнана из фракции Ф-2 E. Cristatus (в м.д.)
Содержание
остатки
С1
С2
С3
С4
С5
С6


· – метил – Д – маннопираноза
4 – О - метил-Д-маннопираноза

· – метил-целлобиозид
Глюкоманнан
Ф - 2




В
Н
Man
Gle


101,1

95,2
104,4
103,8
101,5
103,7

71,5

72,2
74,3
76,5
71,5
74,4

74,03

73,8
75,5
77,1
72,9
76,3

68,1

77,6
80,0
71.2
77,9
80,1

77,2

76,2
76,3
78,2
78,0
75,7

61,6

61,8
61,8
62,5
62,0
61,6

В – восстанавливающий конец, Н – невосстанавливающий конец
Анализ сигналов атомов углерода
· – глюкопиранозидных остатков позволяет сделать вывод о типе замещений в этих остатках. Для незамещенных по С3
· – глюкопиранозных остатков характерен сигналы с химическим сдвигом ниже 77 м.д., по С4 или С6 остатках сигнал смещается за счет
· – эффекта глюкозилирования в более высокое поле. Сигналы малой интенсивности (при 103,7 и 80,1 м.д.) можно отнести за счет резонанса атомов углерода, присутствующих в образовании межзвеньевой связи [133]. Один из оставщихся сигналов этой серии должен принадлежать С5, тогда ни один из них не должен иметь химического сдвига ниже 77 м.д., следовательно, в глюкоманнане
· – глюкопиранозидные остатки замещены по С6 или С4. Окончательным подтверждением этого предположения является совпадение сигналов малой интенсивности химических сдвигов в спектре полисахаридов и модельного химического соединения
· – метил – D – целлобиозида [133], что следует из сопоставления химических сдвигов в полисахариде С1 и С2 - остатков на «невосстанавливающем» конце и С3 – С6 на «восстанавливающем» конце целлобиозида с химическими сдвигами в спектре полисахарида соответствующих атомов углерода
· – D – глюкопиранозидных остатков в полимере.
Таким образом, результаты периодатного окисления, распада по Смиту, исчерпывающего метилирования, кислотного гидролиза, ИК- и 13С-ЯМР-спектроскопии позволяют сделать вывод, что глюкоманнаны, выделенные из E. Cristatus, представляют собой полисахариды, в которых D – глюкопиранозы и D – маннопиранозы образуют линейную цепь из
·-(14) связанных остатков.
Манноза в полисахариде является преобладающим продуктом и отличается от глюкоманнанов, выделенных из других растений, по молекулярной массе (ММ), содержанию маннозы и степени полимеризации.

д) частичный кислотный гидролиз глюкоманнана из фракции Ф-2 [134]

Для дальнейшего изучения структуры глюкоманнана из фракции Ф-2 был использован частичный кислотный гидролиз, в виду того, что фракция Ф-2 составляет основную часть глюкоманнана.
После нейтрализации в гидролизатах с помощью бумажной хроматографии (БХ) были обнаружены - глюкоза, манноза и несколько олигосахаридов. Смесь олигосахаридов была препаративно разделена на фракции на колонке с сефадексом G-25.
В результате было получено 7 подфракций. Для дальнейших исследований были взяты фракции 1-4 олигосахаридов, так как выход остальных был незначительным (табл. 3.10.).
О строении фракций олигосахаридов (1-4) можно судить по выделенным продуктам полного и частичного кислотного гидролиза олигосахаридов до и после восстановления боргидридом натрия, периодатному окислению и исчерпывающему метилированию. Гидролиз проводился серной кислотой, так как она препятствует разрушению продуктов гидролиза.
Олигосахарид 1 при полном кислотном гидролизе дает D-глюкозу и D-маннозу в соотношении 1:1. Периодатное окисление [20] проводили периодатом натрия в течение 96 часов. В результате, периодатное окисление и распад по Смиту приводят к получению эритрита и следы глицерина. Моносахариды отсутствуют. По данным фотоколориметрии соотношение между ними составляет 1:1.

Таблица 3.10. - Характеристика кислотного гидролиза олигосахаридов глюкоманнана из фракции Ф-2

Олиго-сахари-
ды
Rf
Состав
моно-
меров
Соот-
ноше-шение
моно-
меров
СП
Тип и
конфи-гурация
связи
[
·]Д22 (град)
(1,0 H2O)
Строение

1
2
3

4

0,79
0,46
0,33

0,22

Glcp, Manp
Glcp, Glcp
Manp

Glcp, Manp

(1:1)
(1:1)
(1:1)

(1:2)

2
2
3

5


·- (14)

·- (14)

·- (14)


·- (14)

-3,0
-4,6
-5,2

-16,9

Glcp Manp
Glcp
( Manp)1 Manp

Manp Glcp
(Manp)1 Manp


Отсюда можно сделать вывод, что олигосахарид 1 является дисахаридом и имеет строение
· –D – глюкопиранозил - (14) – D - маннозы.
Олигосахарид 2 при кислотном гидролизе дает глюкозу и маннозу. При периодатном окислении в гидролизатах после восстановления олигосахарида боргидридом натрия обнаружены также D - глюкоза и сорбит.
В продуктах периодатного окисления обнаружены эритрит и следы глицерина. По данным фотоколориметрии соотношение между ними составляет (1:1). Метилированием по методу Хакомори [77] в гидролизатах идентифицированы следующие перметилаты: 2,3,4,6-тетра-О-Ме-D-глюкоза и 2,3,6-три-О-Ме-D-глюкоза в соотношении 1:1. Таким образом, установлено, что олигосахарид 2 является
· – D – глюкопиранозил - (14) – D - глюкозой, т.е. целлобиозой.
Олигосахарид 3 при полном кислотном гидролизе дает только D-маннозу. В гидролизатах после восстановления олигосахаридов обнаружены D-манноза и маннит. При периодатном окислении в продуктах распада по Смиту обнаружены глицерин и эритрит, соотношение которых между собой составляет 1:1. Метилированием олигосахарида после гидролиза получены перметилаты: 2,3,4,6-тетра-О-Ме-D-манноза и 2,3,6-три-О-Ме-D-манноза в соотношении (1:1). Отсюда следует, что изучаемый олигосахарид является маннобиозой, т.е.
· - D-маннопиранозил - (14) - D - маннозой.
Олигосахарид 4 при полном кислотном гидролизе дает 1 моль глюкозы и 2 моля маннозы в соотношении (1:2). В гидролизате восстановленного олигосахарида были обнаружены глюкоза, манноза и маннит. При периодатном окислении в продуктах распада по Смиту обнаружены глицерин и эритрит в соотношении 1:2. В результате метилирования по Хакомори, гидролиза метилированного олигосахарида и тонкослойной хроматографии получены 2,3,4,6-тетра-О-Ме-D-глюкоза и 2,3,6-три-О-Ме-D-манноза, соотношение которых по данным фотоколориметра составляет (1:2). Следовательно, олигосахарид 4 является трисахаридом,
· -D-глюкопиранозил-(14)-маннопиранозил-(14)-маннопиранозой.
Таким образом, выделенные из растений E. Cristatus однородные фракции Ф-2 глюкоманнана по результатам частичного гидролиза состоят из наборов сахаров, т.е. из дисахаридов, трисахаридов и тетрасахаридов. Глюкоманнаны E. Cristatus отличаются от глюкоманнанов, выделенных из других видов растений [47], по соотношению моносахаридов и степени полимеризации.

3.5. Изучение структуры фруктозана фракции Ф-2 из корней растений
E. Cristatus

В литературе имеются сведения о фруктозанах некоторых видов Eremurus [4], где авторами было изучено только количественное их содержание и мономерный состав. Тип связи между структурными компонентами был установлен только у фруктозанов, выделенных из E.Lactiflorus [135, 136].
Нами было проведено исследование фруктозанов, выделенных из корней E. Cristatus [137, 138]. Измельченные воздушно-сухие корни, заготовленные в Чуйской долине, предварительно обрабатывались этиловым спиртом, затем были проэкстрагированы водой при комнатной температуре. В водном растворе глюкоманнан осаждался спиртом. Затем маточный раствор после осаждения глюкоманнана из водного экстракта был сгущен и для удаления не углеводных компонентов был обработан уксуснокислым свинцом. Избыток свинца удаляли сернокислым натрием Na2SO4. Сгущенный раствор диализовался против тока воды для удаления низкомолекулярных сахаров. Диализованный раствор упаривался до густого сиропа, затем обрабатывался ацетоном, что превращало его в белый порошок. Выход полисахарида составляет 6,2% от воздушно-сухого сырья. Полученный полисахарид представлял собой гигроскопический белый порошок, легко растворимый в воде. В продуктах полного кислотного гидролиза помощью бумажной хроматографии были обнаружены только фруктоза и глюкоза. Следовательно, полисахарид является фруктозаном.
По данным гельфильтрации фруктозан оказался полидисперсным. Для получения гомогенной фракции фруктозан был разделен на колонке с сефадексом G-25, элюирован водой и в результате было получено 3 фракции фруктозанов 1-3. На рис. 3.6. показана гель-фильтрация фруктозана на сефадексе G-25.

Д, нм
V, мл
Рис.3.6. Гель-фильтрация фруктозана на сефадексе G-25

Для дальнейшего изучения были взяты фракции 2 и 3, так как они составляют основную часть фруктозана. При гель-фильтрации на сефадексе G-25 были получены однородные фракции (Рис. 3.6.) и при помощи калибровочной кривой, построенной на основе декстрана с молекулярным весом (МВ) 10000 (Ve – 31мл), инулина-5600 (Ve –48,8мл) и раффинозы-504 (Ve –67,8мл), определены их молекулярные веса, равные 1350 и 1020 что соответствует фруктозе и глюкозе (рис 3.7.).
Д, нм
V, мл
Рис 3.7. Гель-фильтрация фруктозана фракции 2 и 3 на сефадексе G-25.
М.в. фракции 2-1350 у.е., фракции 3-1020 у.е.
Характеристика фруктозанов фракций 2 и 3 приведена в табл. 3.11.

Таблица 3.11. – Физико-химическая характеристика фруктозанов

№ фрак-ции
фруктозан

Моносаха-ридный
состав
Конфи-гурация и тип связи
Моле-куляр-ный вес
Сте-пень поли-мериза-ции
Строение



Фрук-тоза
Глю-коза





2

3
Fruf6G

Fruf5G

88

82
12

18

·-(21)


·-(21)
1350

1020
7

5
glсp Fruf
[Fruf]4 Fruf
glсp Fruf
[Fruf]2 Fruf

Glсp*- глюкопиранозил, Fruf* - фруктофуранозил.
В ИК-спектрах фруктозанов фракций 2 и 3 (рис.3.8.) имеются полосы поглощения в области при 3600-3150 см-1 характерные для гидроксильной группы, при 945 см-1 – отвечающие колебанию фуранозного кольца, при 885 см-1 - колебанию
· - гликозидной связи, при 825 см-1 - колебанию гексапиранозного кольца, что соответствует связи
·-(21) типа инулина [138].


Рис. 3.8. ИК - спектры фруктозанов фракции 2 и 3

Для определения типа связи во фракциях 2 и 3 фруктозанов был использован метод метилирования по Хакомори [77]. Ввиду того, что метилированный продукт трудно растворяется в воде, перед проведением кислотного гидролиза был осуществлен частичный формолиз фруктозанов 90%-ной муравьиной кислотой при 1000С. В результате проведения кислотного гидролиза с помощью тонкослойной хроматографии на силуфоле были идентифицированы с помощью свидетелей 3,4,6-три-О-Ме-D-фруктоза (1), 1,3,4,6-тетра-О-Ме-D-фруктоза (3) и 2,3,4,6-тетра-О-Ме-D-глюкоза.
Результаты метилирования показали, что в изучаемой полимерной цепи фруктозанов имеются
·-(21) связанные фруктофуранозные остатки, что подтверждается присутствием основного продукта 3,4,6-три-О-Ме-D-фруктозы, характерного для такого типа соединений.
Результаты метилирования были подтверждены результатами периодатного окисления. Периодатное окисление было проведено [20] при комнатной температуре и завершено через 120 часов, после чего количество периодата натрия не менялось. Расход периодата натрия на окисление фруктозана составляет 1 моль NaJO4 на одно моносахаридное звено. В продуктах распада по Смиту с помощью бумажной хроматографии был обнаружен глицерин (4). Выделившаяся при этом муравьиная кислота составила 0,04 моль.












13 SHAPE \* MERGEFORMAT 1415


Результаты метилирования и периодатного окисления, распада по Смиту позволяют предположить, что структура фруктозанов из E. Cristatus состоит из фруктофуранозных гексозных остатков, связанных между собой
·-(21) связью.
Структура фруктозана, изученного химическими методами, подтверждена данными 13С – ЯМР спектроскопии (табл. 3.12.). В спектре 13С - ЯМР фруктозанов Ф-2 и Ф-3 (Рис.3.9. и 3.10.) приведены пики с химическими сдвигами, соответствующими остатками
·-(21) связанных фруктофуранозных единиц.
Химические сдвиги в 13С - ЯМР спектре фруктозана Ф-2 и Ф-3 из растений E. Cristatus (в м.д.) приведены в табл. 3.12.

Таблица 3.12. - Химические сдвиги в 13С - ЯМР спектров фруктозанов

Остаток
С1
С2
С3
С4
С5
С6

Ф-2

·-(21) связанных звеньев фруктозы

·-(21) связанных звеньев глюкозы

61,9

93,32

104,1

72,04

78,15

73,31

75,47

70,33

82,01

72,04

63,02

61,28

Ф-3

·-(21) связанных звеньев фруктозы

·-(21) связанных звеньев глюкозы

61,6

93,1

104,7

71,9

77,8

73,0

74,9

70,1

81,8

71,9

62,9

61,4


Данные 13С - ЯМР спектров подтверждаются результатами периодатного окисления и метилирования, так как присутствие химического сдвига в области 104,1 – 104, 7 м.д. углеродного атома С2 фруктофуранозного остатка и наличиесигналов в области 75,47-74,9 м.д., принадлежащими углеродному атому С4, характерны для инулинового типа соединений.
13 SHAPE \* MERGEFORMAT 1415

Рис. 3.9. Спектры 13С-ЯМР фруктозана фракции Ф-2, снятые на приборе WR-60 Bruker (рабочая частота по ядрам углерода 15,08 МГц).


13 SHAPE \* MERGEFORMAT 1415

Рис. 3.10. Спектры 13С-ЯМР фруктозана фракции Ф-3, снятые на приборе WR-60 Bruker (рабочая частота по ядрам углерода 15,08 МГц).
Установлено, что глюкоза находится на восстанавливающем конце полимерной цепи и присоединена к С2 фруктозы, на что указывают полосы поглощения химического сдвига
·-D- glсp (93,32 и 93,1 м.д.) характерные для такого типа связей [96].
Таким образом, данные периодатного окисления, распада по Смиту, метилирования, ИК- и ЯМР-13С спектроскопии свидетельствуют о том, что фруктозаны фракций 2 и 3, выделенных из E. Cristatus имеют
·-(21) связь, состоящую из фруктофуранозных остатков и относящуюся к типу инулина. Они отличаются между собой молекулярным весом, степенью полимеризации и содержанием количества фруктозы.

3.6. Пектиновые вещества из корней растений E. Cristatus

Для выделения пектиновых веществ (ПВ) из корней растений E. Cristatus было использовано сырье, оставшееся после извлечения глюкоманнанов [120]. Растение было заготовлено в селе Стрельниково. По методу описанному в работе [4] были получены пектины из E. Cristatus. Было проведено изучение содержания пектина в зависимости от фазового развития, моносахаридного состава. Содержание пектиновых веществ по периодам вегетации и их моносахаридный состав приведены в табл.3.13 [147].
Для определения мономерного состава выделенный пектин подвергали кислотному гидролизу 2,5%-ной серной кислотой при 95ОС в течение 36 часов. Методом бумажной хроматографии с последующим проявлением анилинфталатом и при сравнении с истинными свидетелями был обнаружен набор сахаров. Соотношение моносахаридов было определено титриметрическим методом [139]. Были определены относительные количества моносахаридов, причем в каждом случае минимальное содержание моносахаридов было принято за единицу.
Таблица 3.13. – Характеристика пектиновых веществ по периодам вегетации

Фаза развития
Иссле-дуе-
мый
орган
Выход
ПВ, %
Моносахаридный состав, %




Glc
Gal
Arab
Rham
Xyl
Gal.Ua

Розетка

Бутони-
зация
Цветение

Плодоно-шение
к
н/ч
к
н/ч
к
н/ч
к
н/ч
2,3
3,2
6,0
4,8
8,5
4,2
4,2
2,6
1,0
1,0
0,5
1,0
1,2
1,0
1,0
1,0
2,8
2,6
4,2
2,0
8,4
2,8
6,6
2,8
1,0
1,0
1,0
1,2
1,0
1,0
1,0
1,0
1,9
1,3
2,1
1,7
2,2
1,9
2,1
1,6
Следы
Следы
Следы
Следы
1,0
1,0
1,0
1,0
4,8
4,0
6,4
4,3
9,8
4,2
7,0
3,1


Как видно из табл.3.13., по мере развития растения в его корнях увеличивается содержание пектиновых веществ, достигая максимума в фазе цветения (8,5), а в надземной части - в фазе бутонизации (4,8).
Выделенные из корней пектиновые вещества представляют собой порошок слегка коричневатого цвета, хорошо растворимый в воде с образованием вязкого раствора.
Как видно из данной таблицы, во всех периодах в образцах преобладает содержание галактуроновой кислоты, галактозы и рамнозы, что свидетельствует о том, что выделенное вещество является пектином.
В ИК-спектре имеются полосы поглощения в области 3460 см-1 - характерные для валентных колебаний ОН - групп, полосы при 2915 см-1 отвечают валентным асимметричным колебаниям СН - групп, при 1730 см-1 – валентным колебаниям сложноэфирной карбонильной СООСН - группы, при 1320 см-1 – деформационным колебаниям гидроксильных групп, в области 1130 – 1015 см-1 – валентным колебаниям –С-О и –С-О-С – пиранозных и фуранозных колец, а при 945 см-1 и 825 см-1присущи для пектиновых веществ (Рис. 3.11.). Полосы поглощения в области 1130 и 1070 см-1 подтверждают наличие пиранозной формы галактуроновой кислоты.

13 SHAPE \* MERGEFORMAT 1415
Рис. 3.11. ИК-спектры ПВ из растений E. Cristatus, снятые на приборе UR-20 с KBr.

Анализ ПВ из растений E. Cristatus показал, что угол удельного оптического вращения , измеренного на сахариметре СУ-3с длиной трубки 10см, равен [
·]22Д = 180 – 181, а молекулярная масса соответствует числам 8900 – 19000.
Положительное удельное вращение галактуроновой кислоты [
·]22Д = +180 (С.0,3; 0,1н NaOH) свидетельствует об
·-конфигурации гликозидной связи между остатками галактуроновой кислоты.
Для получения однородных фракций ПВ нами было проведено фракционирование с добавлением спирта (табл. 3.14.). В результате было получено три фракции (Ф) с выходом Ф-1 = 34,6%, Ф-2 = 57,0% и Ф-3 = 8,2%. Фракции Ф-1 и Ф-2 однородны и составляют основную часть ПВ. В дальнейшем нами было проведено изучение этих 2-х фракций.

Таблица 3.14.- Характеристика отдельных фракций ПВ

Фрак-
ции
Вы-
ход, %
[
·]22Д
С.1,0
ММ
Мономерный состав сахаров





Glc
Gal
Ara
Xyl
Rham
Gal. Ua

Ф-1
Ф-2
34,6
57,0
178,5
180,0
19000
8900
1,0
1,0
2,3
1,8
1,2
1.1
1,0
1,0
1,2
1,2
5,2
5,4

Фракции Ф-1 и Ф-2 были гидролизованы 2н. раствором H2SO4 в течение 48 ч. После нейтрализации и фильтрации мономерный состав был определен с помощью бумажной хроматографии в системе н. бутанол-пиридин-вода (6:4:3), с использованием бумаги FN – 7 и время выдержки 20ч. В результате в составе были обнаружены глюкоза, галактоза, рамноза, арабиноза, ксилоза и преимущественное количество галактуроновой кислоты, представляющих собой набор сахаров.
Для выяснения типа связи нами было проведено периодатное окисление фракции Ф-1 в течение 15 суток. Расход периодата натрия составил 0,7 моль и после чего уже не менялся.
Реакционная смесь была восстановлена боргидридом натрия, затем подвергнута гидролизу 2н. раствором Н2SO4 в течение 8 ч при 1000С. После нейтрализации карбонатом кальция с помощью БХ были обнаружены галактоза, арабиноза, рамноза, галактуроновая кислота, а также эритрит (Rf= 0,77) и следы глицерина (Rf= 1,10). Сравнительно небольшой расход периодата натрия и присутствие неокисленных сахаров (моносахаридов) свидетельствует о разветвленной структуре ПВ. Образование эритрита обусловлено преобразованием в основной цепи D-галактопираноз, которые соединены между собой
·-14 связями. Образование глицерина происходило за счет слабых концевых остатков D-глюкозы.
Таким образом, установлено, что мономерный состав ПВ, выделенные из растений E. Cristatus, состоит из набора сахаров. Сахара отличаются между собой по количественному соотношению компонентов с преобладанием галактуроновой кислоты.
Данные ИК - спектроскопии, оптического угла удельного вращения и периодатного окисления свидетельствуют о наличии
·-14 галактопиранозных связей.
Таким образом, пектиновые вещества состоят из остатков D-галактуроновой кислоты, соединенных в цепи полигалактуроновых кислот.

13 SHAPE \* MERGEFORMAT 1415
3.7. Изучение строения глюкоманнана из надземной части растений E. Cristatus

Для получения однородного глюкоманнана проводилось его фракционное осаждение спиртом из водных растворов. В результате из надземной части растения было получено четыре фракции [125]. Данные фракционирования и свойства полученных фракций приведены в табл. 3.15. и 3.16.

Таблица 3.15 – Характеристика фракций глюкоманнана из н/ч E. Cristatus

Фракции
Общий объем прибавленного спирта (мл)
Выход
в % к ВРПС
Соотношение
глюкозы и маннозы


1
2
3
4
75
125
200
300
27
56
12
4
1:1,7
1:2,8
1:5,3
-


Из табл. 3.15. видно, что фракция Ф-2 составляет основную часть водорастворимого полисахарида, в связи, с чем и было проведено ее химическое изучение.
Глюкоманнан из фракции Ф-2 представляет собой порошок кремового цвета.
Для дальнейшего изучения структуры глюкоманнана из фракции Ф-2 был использован частичный кислотный гидролиз.
Выделенная однородная фракция (Ф-2) далее была подвергнута частичному кислотному гидролизу. После нейтрализации в гидролизатах с помощью бумажной хроматографии (БХ) и последующего проявления анилин фталатом были обнаружены глюкоза и манноза, являющимися глюкоманнаны и при использовании фотоколориметра было определено соотношение сахаров (табл. 3.15.).
Были определены углы удельного вращения этих однородных фракций. Они оказались отрицательными, что свидетельствует о наличии
· - гликозидных связей.
Также определена относительная вязкость фракций.
Молекулярные веса 4-х однородных фракций были определены по методу гель-хроматографии. Результаты приведены в табл. 3.16.

Таблица 3.16. - Характеристика однородных фракций глюкоманнана из н/ч E. Cristatus

Фракции
[
·]Д22 (град)
(1,0; H2O)

· отн. (1,0; H2O), tо-22оС
Молекулярный вес
ИК-спектры,
см-1

1
2
3
4
-21,0
-36,5
-43,5
-50,0
4,7
3,2
1,6
0,6
69000
42000
36000
-
3600, 3200, 1730, 1240, 870, 815


Как видно из табл. 3.15. и 3.16. с уменьшением молекулярного веса фракции глюкоманнанов снижается их относительная вязкость, а значение угла удельного вращения и соотношение глюкозы и маннозы увеличивается.
Таким образом, установлено, что глюкоманнан, выделенный из надземной части растений E. Cristatus, состоит из четырех однородных фракций.
В ИК - спектре имеются полосы поглощения в области 3600-3200 см-1, соответствующим гидроксильным группам, в области 1730-1240 см-1 -сложноэфирной группе, при 870 см-1 –
·-гликозидной связи, при 815 см-1 – гексапиранозному кольцу (рис. 3.12.).

Рис. 3.12. ИК-спектры глюкоманнана из фракции Ф-2 н/ч E. Cristatus, снятые на приборе UR-20 с KBr.

Периодатное окисление глюкоманнана из фракции Ф-2 проводят в темноте при 22оС в разбавленных водных растворах при строго контролируемых значениях рН среды и при постоянном перемешивании. Окисление фракции Ф-2 было проведено при комнатной температуре 0,5М раствором NaJO4. Окисление при этом протекает медленно и завершается через 168 часов (7 суток), количество же периодата натрия после завершения окисления не менялось (рис. 3.13.).

Д,
·

сутки
Рис.3.13. Периодатное окисление глюкоманнана из фракции Ф-2.

Расход периодата натрия составил 0,96 моль на 1 моль ангидрогексозного звена, а количество выделившейся муравьиной кислоты равнялось 0,06 моль.
После распада по Смиту с использованием метода БХ были обнаружены эритрит и следы глицерина. Моносахариды не были обнаружены, вследствие чего было определено, что гексапиранозные остатки соединены линейно и в основной цепи глюкоманнана Ф-2 преобладают
·-(14) гликозидные связи, которые характерны для основного продукта - эритрита.
Для выяснения типа связи между моносахаридными остатками глюкоманнана фракции Ф-2 и для подтверждения результатов периодатного окисления было проведено метилирование двухкратной повторности по методу Хакомори [77]. Полученный перметилат – слегка желтоватый аморфный порошок, хорошо растворимый в хлороформе, ацетоне, но не растворимы в воде. Угол удельного вращения соответствует величине [
·]22Д – 20о (С.1,0;СНСL3). Отрицательное значение угла удельного вращения перметилата указывает на
· - конфигурацию гликозидной связи. В его ИК-спектре отсутствуют полосы поглощения присущие гидроксильным группам, что означает то, что перметилат метилирован полностью.
Метилированные продукты плохо растворяются в воде, поэтому до кислотного гидролиза метилированный глюкоманнан подвергался формолизу действием 90%-ной муравьиной кислотой при 100оС с последующим гидролизом 2н раствором серной кислоты при 100оС.
В гидролизатах методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) были идентифицированы 2,3,6-три-О-Ме-D-манноза, 2,3,6-три-О-Ме-D-глюкоза, а также 2.3,4,6-тетра-О-Ме-D-манноза.
По данным фотоколориметра соотношение 2,3,6-три-О-Ме-D-глюкозы и маннозы составляет 1:2,8. Образование следовых количеств тетра-О-Ме-гексозы соответствует результатам периодатного окисления и указывает на высокую степень полимеризации фракций глюкоманнанов. Присутствие обоих тетра-О-Ме-гексоз свидетельствует о том, что цепь глюкоманнана на невосстанавливающемся конце имеет как глюкопиранозные, так и маннопиранозные остатки и связаны они между собой
·-(14) связью.
Полосы поглощения ИК- спектров при 882см-1 глюкоманнана из фракции
Ф-2, а также результаты метилирования, указывающие на отрицательное удельное вращение перметилата указывают на присутствие
· - гликозидной связи между гексапиранозными остатками. С целью подтверждения этого нами был применен метод окисления хромовым ангидридом [127] ацетилированных глюкоманнанов, согласно которому окислению подвергаются
· - гликозидные связи, в виду того, что в продуктах окисления не была обнаружена гексоза.
Таким образом, результаты периодатного окисления, распада по Смиту и исчерпывающего метилирования и окисление хромовым ангидридом позволяют сделать вывод, что глюкоманнаны состоят из
·-(14) связанных остатков. На восстанавливающем конце глюкоманнана находится маннозный остаток. Глюкоманнаны из растений E.Cristatus отличаются от глюкоманнанов, выделенных из других растений, по молекулярной массе (ММ), содержанию маннозы и степени полимеризации.
3.8. Усовершенствование способа получения глюкоманнана из
растений E. Cristatus

Планомерная систематическая химическая инвентаризация растений, повсеместно произрастающих на территории Кыргызстана, на содержание в них сахаров и сопутствующих им соединений позволила выявить широкораспространенные, дикорастущие и перспективные для дальнейшего изучения растения, обладающих высокой сахаристостью и которые могли бы стать сырьевым источником для выделения из них особо ценных химических веществ, таких как глюкоманнан, глюкоза, манноза и др.[141, 142].
Таковыми растениями оказались растения рода Eremurus [4, 36, 40, 42, 120], содержащие до 49,0 % глюкоманнана.
Задача нашего исследования заключалась в разработке способа выделения глюкоманнана путем усовершенствования известного и применяемого до настоящего времени способа с целью увеличения выхода целевого продукта.
Основными факторами, влияющими на процесс экстракции растительного сырья, являются: используемый растворитель, степень измельчения сырья, температура, разность концентрации основного вещества в сырье и в экстракте, длительность процесса экстрагирования и гидродинамические условия процесса [143, 146].
Глюкоманнан хорошо растворяется в воде. Вода отвечает всем требованиям, предьявляемым к растворителю. Это позволило выбрать ее в качестве экстрагента при извлечении полисахарида из корней Eremurus.
При изучении влияния степени измельчения сырья на процесс экстракции было установлено, что чем мельче частицы, тем короче путь прохождения молекулы полисахарида в экстрагент, приводящее к увеличению выхода извлекаемого продукта.
Для выбора оптимального режима экстракции использовали сырье, содержащее частицы различной величины. При водной экстракции глюкоманнана из растительного сырья существенное влияние на процесс оказывает распределение веществ между двумя фазами: твердой (сырье) и жидкой (экстрагент). Для диффундирования глюкоманнана в растворитель требуется определенное время контакта фаз, которое будет тем меньше, чем больше поверхность соприкосновения реагентов. Переход полисахарида в экстрагент осуществляется до наступления равновесия фаз. При экстракции из корней Eremurus, измельченных до величины частиц 4,0 мм, равновесие в системе сырье – экстрагент не наступает даже при 2-х часовом контакте фаз. При величине частиц 0,1 мм уже через 30 минут наступает равновесное состояние. По истечении двухчасовой экстракции во всех опытах имеет место снижение глюкоманнана за счет его деполяризации (рис. 3.14.). При повторных экстракциях глюкоманнана (t=600 С, соотношение сырья и экстрагента 1:30) истощение сырья измельченностью 4,0 мм наступает после 5 – ти кратной повторяемости, в то время как при его измельченности до 0,1 мм истощение сырья наступает уже после 3 – х разовых повторностей (рис. 3.15).
V, %

время
Рис. 3.14. Зависимость выхода глюкоманнана от времени экстракции (t=600 С, соотношение сырья и экстрагента 1:30) и степени измельчения сырья


%

Размер сырья
Рис. 3.15. Зависимость выхода глюкоманнана от измельченности сырья (t=600 С, соотношение сырья и экстрагента 1:30, время экстракции 30 минут)

V, %

Кратность экстракции
Рис. 3.16. Зависимость выхода глюкоманнана от кратности экстракции (время экстракции 30 минут)

Как видно из рис. 3.14. - 3.17. выход глюкоманнана зависит от времени, кратности и температуры экстракции, размера сырья.
%

T0, C
Рис. 3.17. Зависимость выхода глюкоманнана от температуры экстракции (соотношение сырья и экстрагента 1:30, время экстракции 30 минут)
%

соотношение
Рис. 3.18. Зависимость выхода глюкоманнана от соотношения сырья и растворителя (время экстракции 30 минут)

Как видно из рис. 3.14. - 3.17. выход глюкоманнана зависит от времени, кратности и температуры экстракции, размера сырья.

%

соотношение
Рис. 3.19. Зависимость выхода глюкоманнана от соотношения сырья и растворителя (t=600 С, время экстракции 30 минут)

Как видно из рис. 3.19., оптимальным соотношением сырья и растворителя является соотношение 1:30.
При изучении влияния температуры на экстракцию глюкоманнана было установлено, что с повышением температуры экстракции уменьшается вязкость раствора, благодаря чему происходит более легкое продвижение молекул полисахарида. Повышение температуры также способствует переходу в экстракт и других соединений, что ускоряет деполимеризацию молекулы. Определено, что оптимальной температурой является t=600 С (рис. 3.17.).
Таким образом, в результате проведенных исследований получения глюкоманнана найдено, что оптимальными являются следующие факторы:
измельченность сырья – 0,1 мм,
время экстракции – 30 минут,
количество экстракций – одна,
температура экстракции – 600С,
соотношение сырья и экстрагента – 1:30.
Глюкоманнан, имея широкий аспект применения и огромную сырьевую базу, промышленностью СНГ не выпускается. Известно [4], что по методике получения глюкоманнана для очистки от белков и других примесей используется трихлоруксусная кислота, а по методу Севага смесь бензола и метанола.
В табл. 3.17. приведены сопоставительный анализ между известным и усовершенствованным нами способами получения глюкоманнана.

Таблица 3.17. - Характеристика сопоставительного анализа получения глюкоманнана


Известный способ [4]

Усовершенствованный способ

1
2

3
4
5
6
7
8


9

10

11
12

13

14
15
Измельчение корней
Обработка этанолом 96% 10 кратным (присутствие СаСО3)
Фильтрация
Обработка водой 1:20-50, 3ч.
Центрифугирование
Обработка водой 1:20-50, 3ч.
Центрифугирование
Объединение обоих экстрактов, осаждение белков 50%-ной трихлоруксусной кислотой
Отделение осевших белков центрифугированием
Обработка трихлоруксусной кислотой повторно
Центрифугирование
Промывание трихлоруксусной кислотой.
Осаждение глюкоманнана этанолом
Фильтрация глюкоманнана
Сушка глюкоманнана
Выход готового продукта 20%
1
2

3
4
5
6
7


8
9

10
11
Измельчение корней
Обработка этанолом 96% 10 кратным
Фильтрация
Обработка водой 1:10
Фильтрация
Обработка водой 1:10
Осаждение белков и др. примесей 1:0,5 этанолом (дробным осаждением)
Фильтрация
Осаждение глюкоманнана этанолом 1:1,5
Фильтрация глюкоманнана
Сушка глюкоманнана
Выход готового продукта 48,0%




Так как глюкоманнан является пищевым продуктом, нами при его выделении были исключены все химические реактивы и растворители кроме спиртов (этиловый, метиловый и изопропиловый).
Полученный глюкоманнан представляет собой хорошо растворимый в воде белый порошок, имеющий следующие характеристики, Т пл. - 1880С, [
·]22Д = - 36,8 (С.1,0;Н2О), моносахаридный состав включает в себя глюкозу и маннозу в соотношении 1:2,9.
Преимуществом усовершенствованного способа является повышение чистоты и выхода целевого продукта (в известном 20%, а усовершествованном 48,0%), упрощение, исключение ряда стадий (в известном 15 стадий, а усовершествованном 11), исключение из процессов всех химических реактивов и растворителей по сравнению с ранее известным способом.

3.9. Усовершенствование способа получения D-маннозы из растений E. Cristatus

Ассортимент выпускаемых в стране сахаров реактивной квалификации крайне ограничен, а потребность в них растет. Поэтому организация промышленного выпуска новых, еще не освоенных в стране сахаров имеет важное народнохозяйственное значение.
Одним из важнейших реактивных сахаров является D – манноза. D – манноза используется в микробиологической практике для распознавания болезнетворных микроорганизмов кишечной группы, холерного вибриона Эль-Тор и др.
D – манноза также широко используется в фармацевтической и медицинской промышленности для синтеза препаратов противоракового действия, фармацевтической промышленностью в СНГ не выпускается. К настоящему времени известен только ряд препаративных способов получения D – маннозы из малодоступного сырья.
Один из известных способов получения D – маннозы заключается в том, что исходное сырье (корни Eremurus) подвергают кислотному гидролизу, затем нейтрализуют углекислым барием, после чего отделяют целевой продукт осаждением фенилгидразином с последующим разложением фенилгидразина маннозы ацетоном [144].
Авторами работы [145] был предложен другой способ получения
· – D – маннозы из корней Eremurus Lenaidai Vved.Однако недостатком этого метода является трудоемкость технологического процесса и низкий выход целевого продукта (12,8%).
Высокое содержание глюкоманнана в E. Cristatus позволяет использовать это растение в качестве технического сырья для получения D – маннозы. Это дало возможность предложить простой способ получения D – маннозы непосредственным гидролизом растительного сырья.
Для нахождения оптимального режима выделения маннозы был изучен в лабораторных условиях процесс кислотного гидролиза глюкоманнана непосредственно в растительном сырье [146], в зависимости от продолжительности гидролиза, температуры, концентрации кислоты, соотношения сырья и раствора кислоты. Определение содержания редуцирующих сахаров в гидролизате производилось по Макену – Шоорлю, соотношение глюкозы и маннозы – хроматографическим методом. Выделение маннозы из растительного сырья в большой степени зависит от полноты гидролиза полисахарида, трудность же проведения гидролиза связано со строением глюкоманнана.
При кислотном гидролизе сырье подвергается мацерации, поэтому степень его измельчения на процесс гидролиза не оказывает существенного влияния.



%
Соотношение

Рис. 3.20. Зависимость содержания углеводов в гидролизате от соотношения сырья и раствора 1,0%-ной серной кислоты (температура 1000С, время гидролиза 1 час)

Установлено, что оптимальными условиями гидролиза являются отношение сырья к раствору серной кислоты, равные 1:6 (рис. 3.20.). Продолжительность гидролиза также оказывает существенное влияние на выход углеводов и маннозы, при этом было найдено, что лучшие результаты получены при 1-часовом ведении процесса (рис. 3.21.). С увеличением температуры повышается содержание сахаров и маннозы в гидролизате (рис. 3.22.). Как видно из данных рис. 3.23. приемлемой концентрацией является 1%-ная серная кислота.
%

время
Рис. 3.21. Зависимость содержания углеводов в гидролизате от времени гидролиза (соотношение сырья и 1,0%-ной серной кислоты 1:6)
%

То

Рис. 3.22. Зависимость выхода углеводов от температуры экстракции.



%
С

Рис. 3.23. Зависимость содержания углеводов в гидролизате от концентрации серной кислоты (t=1000С, соотношение сырья и 1,0%-ной серной кислоты 1:6, время гидролиза 1 час)

После проведения процесса гидролиза полученную смесь фильтруют, фильтрат упаривают под вакуумом до содержания сухих веществ 78%. Остаток обрабатывают смесью этилового спирта и ацетона (1:1) при соотношении сироп-растворитель 1:1 при 500С в течение 30 мин. Затем фильтрат упаривают до сиропа, а сироп растворяют в уксусной кислоте при соотношении 1:2 при комнатной температуре, дают затравку и кристаллизуют. Выход составляет 15,2% [146].
В табл. 3.18. представлен сопоставительный анализ между известным и усовершенствованным нами способами получения D-маннозы.

Таблица 3.18. – Характеристика сопоставительного анализа получения
D-маннозы


Известный способ [145]

Усовершенствованный способ [146]

1
2

3

4

5
6

7


8


9
10


11

12


13
14
15

16

17
18
19
Измельчение корней
Обработка корней изопропиловым спиртом (1:5), 1ч.
Гидролиз корней 2,5%-ным Н2SO4 в течение 2,5ч.
Нейтрализация СаСО3 до рН=4,5
Выдержка 30 мин. при 600С
Фильтрация
Упарка до содержания сухих веществ 80% (до сиропа)
Добавление смеси изопропилового спирта и метанола в количестве 1,5:1 по объему сиропа
Выдержка при 500С, 50 мин.
Снижение температуры до 200С, 24 ч. на кристаллизацию
Фильтрация кристаллов
Промывка смесью равных количеств изопропилового спирта и метанола
Добавка 20%-ного раствора серной кислоты, выдержка 30 мин.
Нейтрализация СаСО3 до рН=4,5
Добавка изопропилового спирта 1:2 по объему
Выдержка 3 часа
Фильтрация
Упарка до сиропа до содержания сухих веществ 87%
Растворение сиропа уксусной кислотой при соотношении 1:3
Охлаждение до 200С
Кристаллизация в течение 3 ч.
Фильтрация
Выход 12,8%
1
2

3

4
5

6


7
8
9

10


11
12

Измельчение корней
Обработка корней этиловым спиртом (1:5), 1ч.
Гидролиз корней 1,25%-ным Н2SO4 в течение 1ч.
Фильтрация
Упарка до содержания сухих веществ 78% (до сиропа)
Добавление смеси этилового спирта и ацетона в количестве 1:1 по объему сиропа
Выдержка при 500С, 30 мин.
Фильтрация
Упарка до содержания сухих веществ 78% (до сиропа)
Растворение сиропа уксусной кислотой 1:2 при комнатной температуре
Кристаллизация в течение 3 ч.
Фильтрация
Выход 15,2%






Преимуществом усовершенствованного способа является повышение чистоты и выхода целевого продукта (в известном 12,8%, а усовершествованном 15,2%), исключение ряда стадий (в известном 19 стадий, а усовершествованном 12) по сравнению с ранее известным способом.
Растение E. Cristatus можно использовать в качестве технического сырья для получения D – маннозы.


D-манноза представляет собой белый кристаллический порошок.
Формулы: Эмпирическая – С6Н12О6
Структурная -



Т пл.129-1310С, [
·]22Д =+14,4 (С.5,0 Н2О)
Количество нерастворимых в воде веществ составляет 0,03%.




3.10. Острая токсичность глюкоманнана из растений E. Cristatus

На кафедре биотехнологии и химии Кыргызского национального аграрного университета им. К.И.Скрябина д.в.н. Арзыбаевым М. и аспирантом Исаевым М.А. были проведены испытания на острую токсичность водорастворимого полисахарида - глюкоманнана, выделенного из растений E. Cristatus.
Опыты проводили на клинически здоровых 36 белых мышах обоего пола с живыми массами по 19-21 г., которые содержались в одинаковых условиях и не подвергались ранее токсическому воздействию. Препарат глюкоманнана применяли однократно перорально в трех дозах:
- первая группа получала препарат в дозе 0,5 мл/кг;
- вторая группа – в десять раз больше (5,0 мл/кг);
- третья – в сто раз больше (50 мл/кг).
Объем вводимого препарата и воды не превышал 1,0 мл.
Каждой опытной группе соответствовала контрольная, где мышам вводили стерильную питьевую воду в объеме, аналогичном дозе применяемого препарата глюкоманнана для опытных животных.
Для введения препарата глюкоманнана использовали инъекционный шприц с обрезанной и отшлифованной иглой. Мышам вводили препарат натощак после 10 – часовой голодной выдержки. Корм животным задавали через 2-3 часа после введения препарата глюкоманнана. Наблюдения за животными вели в течение 14 дней, при этом первые 5 часов опыта состояние мышей контролировали каждые 30 минут. В течение всего периода учитывали клиническое состояние, аппетит, поведение, реакцию на внешные раздражители, массу тела и их сохранность.
В результате проведенных исследований установлено, что препарат глюкоманнан во всех испытанных дозах не проявляет токсическое действие на мышей. В этой связи не удалось установить LD 50 (минимальную летальную дозу), так как за весь период наблюдения в опытных и контрольных группах клинических признаков токсикоза и гибель животных не наблюдали (табл. 1).
При вскрытии мышей после опыта, каких либо изменений со стороны внутренних органов не обнаружено.
Таблица 1
Результаты испытаний острой токсичности препарата глюкоманнана из растений E. Cristatus
Доза
мл/кг
Группы
Число животных
Результат




Выжило, гол.
Пало, гол.

0,5

5,0

50,0

опытная
контрольная
опытная контрольная
опытная
контрольная
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
6
0
0
0
0
0
0


На основании проведенных исследований можно сделать заключение, что глюкоманнан, полученный из растений E. Cristatus, является нетоксичным препаратом. При испытании его в дозах в дозах в 10 и 100 раз превышающих лечебно-профилактические, не отмечено негативного влияния на организм теплокровных животных.
Нетоксичность глюкоманнана является предпосылкой для разработки на его основе противомикробных препаратов для нужд медицины. Это подтверждает перспективность дальнейшего изучения глюкоманнана в этом направлении. Рекомендуется использовать глюкоманнан из растений E. Cristatus в медицинской, фармацевтической, микробиологической, пищевой и других отраслях промышленности.





ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Проведено химическое исследование количественного состава углеводов по периодам вегетации подземных и надземных органов 8 видов растений рода Eremurus, произрастающих на территории Кыргызстана.
Результаты химического исследования показали, что во все периоды роста растения в корнях происходило увеличение содержания полисахаридов, достигая максимума в фазе плодоношения. Установлено, что в надземных частях растений накапливались преимущественно олигосахариды.
Установлено, что максимальное содержание полисахаридов имело место в корнях растения E. Cristatus. В качестве перспективного объекта для химического изучения и практического использования было выбрано растение E. Cristatus рода Eremurus.
Были проведены работы по исследованию динамики накопления углеводов в подземной и надземной частях E. Cristatus в различные фазы развития и определению их качественного и количественного моносахаридного состава. Выявлено, что для растений E. Cristatus характерно наличие глюкоманнанов с преобладанием содержания их в подземных органах растений в фазе плодоношения.
Установлено, что содержание углеводов в растениях находится в прямой зависимости от фенофазового состояния, места произрастания, срока хранения, а также исследуемого органа растения.
Была дана характеристика химического состава корней растения E. Cristatus. Найдено, что в фазе плодоношения в корнях этого растения кроме углеводов содержатся алкалоиды, красящие вещества, сапонины, белковые вещества, дубильные вещества, целлюлоза и др.
В результате подбора оптимальных условий была разработана последовательная схема разделения углеводов и изучены физико-химические свойства выделенных моносахаридов, олигосахаридов, водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ и гемицеллюлозы.
Из остатков сырья, оставшегося после обработки спиртом, последовательно были выделены водорастворимые полисахариды, пектиновые вещества и гемицеллюлозы.
Водорастворимые полисахариды (глюкоманнаны) по результатам гель-хроматографии являются полидисперсными, согласно данным бумажной хроматографии глюкоманнаны состоят из глюкозы и маннозы.
Для изучения строения глюкоманнана было проведено их фракционирование. В результате фракционирования глюкоманнана, выделенного из корней E. Cristatus, было получено 4 фракции.
Методом кислотного гидролиза и бумажной хроматографии был определен моносахаридный состав полисахаридов. В составе ВРПС были обнаружены глюкоза и манноза при соотношении 1,0:2,9. Определено, что в ПВ присутствуют преимущественно галактоза и рамноза, а в ГЦА и ГЦБ – набор сахаров.
Для дальнейшего изучения были отобраны фракции Ф-2 и Ф-3, составляющие основные части глюкоманнана. По методу гель-хроматографии была установлена однородность фракции Ф-2.
Для получения дополнительных сведений о свойствах глюкоманнана был проведен анализ исходного и очищенного продукта и проведено сравнение между ними. По данным гель-хроматографии исходные и очищенные глюкоманнаны являются полидисперсными соединениями.
Также были изучены полисахариды, выделенные из надземной части растений E. Cristatus в фазе бутонизации. С помощью кислотного гидролиза и бумажной хроматографии был определен моносахаридный состав полисахаридов надземной части растения.
Установлено, что ПВ, ГЦА и ГЦБ состоят из нейтральных сахаров, а в ПВ преимущественным продуктом является галактуроновая кислота.
Было проведено изучение кинетика экстракции глюкоманнана из растительного сырья в зависимости от степени его измельчения, длительности экстрагирования и температуры, что позволило предложить выгодный способ получения целевого продукта, обеспечивающий его максимальный выход.
Методами кислотного гидролиза, периодатного окисления по Смиту, метилирования по Хакомори, ИК- и 13С-ЯМР – спектроскопии, измерением угла удельного вращения, определение молекулярной массы были изучены отдельные фракции глюкоманнанов из E. Cristatus. Показано, что выделенные глюкоманнаны представляют собой полисахариды, в которых D – глюкопираноза и D – маннопираноза образуют линейную цепь из
·-(14) связанных остатков, а фруктозаны имеют
·-(21) связь, состоящую из фруктофуранозных остатков и относятся к типу инулина. Глюкоманнаны из растений E.Cristatus отличаются от глюкоманнанов, выделенных из других растений, по молекулярной массе (ММ), содержанию маннозы и степени полимеризации.
Из корней растения E. Cristatus были выделены пектиновые вещества и изучено их содержание в зависимости от фазового развития, моносахаридного состава и установлено наличие
·-(14) галактопиранозных связей.
Впервые выделены и доказаны структура глюкоманнанов, фруктозанов, пектиновых веществ из E. Cristatus, изучены их физико-химические свойства и особенности их структуры. Впервые установлено, что глюкоманнаны из растений E. Cristatus представляют собой полисахариды, в структуре которых присутствуют
·-(14) гликозидные связи. Впервые выделены фруктозаны из корней растения E. Cristatus и исследована их структура Установлено, что эти фруктозаны полидисперсны и для них характерна
·-(21) связь типа инулина. Впервые из корней растения E. Cristatus были выделены также пектиновые вещества и определеноих содержание в зависимости от фазового развития, их моносахаридный состав и установлено наличие
·-(14) галактопиранозных связей.
Было проведено усовершенствование способа получения глюкоманнана и Д-маннозы из растения E. Cristatus, имеющий ряд преимуществ перед ранее известными.
Глюкоманнаны из растения E. Cristatus является нетоксичным соединением.

ВЫВОДЫ

1. Изучен углеводный состав сорных растений рода Eremurus семейства Лилейных флоры Кыргызстана. Установлено, что для растений E. Cristatus характерно наличие глюкоманнанов с преобладанием его содержания в подземных органах растений в фазе плодоношения. Это позволяет предложить корни E. Cristatus в качестве основного сырья для получения глюкоманнана и D-маннозы.
2. Методами кислотного гидролиза, периодатного окисления по Смиту, метилирования по Хакомори, ИК- и 13С-ЯМР – спектроскопии, измерения угла удельного вращения, определения молекулярной массы изучены отдельные однородные фракции глюкоманнанов из E. Cristatus. Приведены новые сведения об углеводном составе растений E. Cristatus. Доказано, что выделенные глюкоманнаны растений E. Cristatus состоят из линейной цепи
·-(14) связянных остатков D – глюкопиранозы и D – маннопиранозы.
3. Впервые выделены фруктозаны из спиртовых растворов корней растений E. Cristatus. Установлено, что выделенные однородные фруктозаны состоят из фруктофуранозных остатков и связаны между собой
·-(21) связью типа инулина.
4. Впервые из корней растений E. Cristatus были выделены пектиновые вещества, изучено их содержание и установлено наличие
·-(14) галактопиранозных связей.
5. Усовершенствованы способы получения глюкоманнана и Д-маннозы. Преимущества усовершенствованных способов заключаются в повышении чистоты и выхода целевого продукта, упрощении, ускорении и исключении из технологического процесса химических реактивов и растворителей. Фармако-токсикологическими исследованиями установлено, что глюкоманнаны из растения E. Cristatus является нетоксичным, безвредным соединением. Это дает возможность создавать на их основе новые медицинские препараты, направленные на лечение различных болезней.

CПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

Степаненко, Б.Н. Химия и биохимия углеводов (полисахариды) [Текст] / Б.Н.Степаненко. – М.: Высш. шк., 1978. – 159 с.
Квасюк, Е.И. Курс лекций по химии и биохимии углеводов [Текст] /Е.И.Квасюк, С.Б.Бокуть – Минск.: МГЭУ им. А.Д.Сахарова, 2008. – 107 с.
Флора Киргизской ССР. Определитель растений Киргизской ССР [Текст] /сост. Р.Ю.Рожевиц, Е.В.Никитина, Л.И.Попова и др. – Фрунзе: Изд. КиргФАН СССР, 1951. – Т. 3: Ароидные-Орхидные. – 150 с.
Афанасьева, Е.М. Полисахариды некоторых видов Eremurus [Текст]
/ Е.М.Афанасьева // Растительные ресурсы. – 1972. – № 8, вып.2. – С.192-199.
Пашнинина, Т.Г. Ритмы развития некоторых видов Эремурусов (Eremurus bieb) в условиях Чуйской долины [Текст] / Т.Г.Пашнинина // Материалы 1 Междунар. биол. конгр. Кыргызстана ( Бишкек, 2012, 24-25 сент.). – Бишкек, 2012. – С. 70.
Оленников, Д.Н. Методика количественного определения группового состава углеводного комплекса растительных объектов [Текст] /Д.Н. Оленников, Л.М.Танхаева // Химия растительного сырья. – 2006. – № 4. – С. 29-33.
Сафаров, Е.Х. Физиолого-биохимические особенности эфемероидов эремуруса гиссарского (Eremurus Hissaricus Vved) и эремуруса мощного (Eremurus robustus Rgl) [Текст]: автореф. дис. канд. биол. наук / Е.Х.Сафаров. – Душанбе, 2006. – 23 с.
Шербухина, Н.К. Резервный глюкоманнан высших растений [Текст] /Н.К.Шербухина // Успехи биол. химии. – 1970. – Т.11. – С. 226-249.
Степаненко, Б.Н. Резервные галактоманнаны и глюкоманнаны семян, луковиц и корневищ [Текст] // Успехи химии. – 1961. – Т.30, вып.5. – С. 626-644.
Шербухин, В.Д. Водорастворимые глюкоманнаны корней видов Eremurus. Bieb [Текст] / В.Д.Шербухин, Е.М.Афанасьева, А.А. Кузнецова // Растительные ресурсы. – 1984. – Т.20, № 3. – С. 416-430.
Оленников, Д.Н. Методика количественного определения суммарного содержания полифруктанов в корнях лопуха (Arctium SPP.) [Текст] / Д.Н.Оленников, Л.М.Танхаева // Химия растительного сырья. – 2010. –№ 1. – С. 185-120.
Рахманбердыева, Р.К. Сезонная динамика содержания и состава углеводов в Cardaria repens (Schrenk) Jarm [Текст] / Р.К.Рахманбердыева // Растительные ресурсы. – 2003. – Т.39, № 1. – С. 76-79.
Барбакадзе, В.В. Выделение и исследование глюкоманнана из луковиц пролески [Текст] / В.В.Барбакадзе, И.Л.Таргамадзе, А.И.Усов //Биоорганическая химия. – 1996. – Т.22, № 1. – С. 58-61.
Поле, А.Я. Выделение и общая характеристика полисахаридов из пижмы обыкновенной, мать-и-мачехи и лопуха войлочного [Текст] / А.Я.Поле, Р.Г.Оводова, С.В.Попов // Химия растительного сырья. – 1999. – № 1. – С. 33-38.
Об эремуране – новом полисахариде из корней Eremurus Regelii [Текст] / Б.Н.Степаненко, О.Н. Пономарева, Е.М.Афанасьева, Р.О. Баксова // Докл. АН СССР. – 1956. – Т.3, № 3. – С.152-155.
Hamilton, J.K. The Hemicelluloses of Western Red Cedar; The Constition of a Glucomannan [Text] / J.K. Hamilton, E.V. Partlow // J. Amer. Chem. Soc. – 1958. – Vol. 80. – P.4880-4885.
Carr, C.W. Dialusis [Text] / C.W. Carr // Phys. Metods in chem. Anal. – 1961. – № 4. – Р. 1-43.
Степаненко, Б.Н. О химической природе эремурана – нового полисахарида из корней Eremurus Regelii [Текст] / Б.Н.Степаненко, Е.М.Афанасьева, Р.А.Баксова // Биохимия. – 1958. – Т. 23, № 5. – С. 713-720.
Кочетков, Н.К. Методы химии углеводов [Текст] / Н.К.Кочетков. – М.: Мир, 1967. – С.161-162.
Tomoda, M. Plant mucilage.V. Isolation and carakterization of a mucous Polysaccaride «Falcaton», from Polygonatum falcatum Rhiromes [Text] / M. Tomoda, S. Nakatsuka // Chem. Pharm.Bull (Tokyo). – 1972. – Vol. 20. – Р. 2491-2495.
Кочетков, Н.К. Методы химии углеводов [Текст] / Н.К.Кочетков. – М.: Мир, 1967. – С.24, 225, 285, 294, 442-488.
Whistler, R.L. Fractinal Precipitation with Ethanol [Text] / R.L. Whistler, J.L. Sannella // Metods in Carbohydrate chemistry //Acad Rres. – New York, London, 1965. – Vol.5. – P.34-36.
Meier, H. On the structural of cell walls and cell wall mannans from vory Nuts and from dates [Text] / H. Meier // Biochim et Biophus asta. – 1958. – Vol. 28, № 2. – P.229-240.
Achtardjiev, C.Z. Glucomannan from the tubers of Arum orientale [Text] / C.Z. Achtardjiev, M.A. Koleva // Phytochemistry. – 1973. – Vol.12, № 12. – P. 2897-2910.
Koleva, M.A. Jsolation of an alec trophoretically homegencous glucomannan using glutaraldehyde-insolybised coucana – Valin A. [Text] / M.A. Koleva, C.Z. Achtardjiev // Carbohyd. Res. – 1973. – Vol. 31, № 1. – P. 142-145.
Tomoda, M. Plant mucilages Х. Isolation and characterization of a mucous polysaccharide «Wilium A-glucomannan» from the bulb of Liliumauratum [Text] / M. Tomoda, S. Kaneko, S. Nakatsuka // Chem. Pharm. Bull (Japan). – 1975. – Vol. 23, № 2. – P. 430-436.
Rebrers, P.A. The constitution of Hes Mannan [Text] / P.A. Rebrers, F. Smith // Amer. Chem. Soc. – 1954. – Vol. 76. – P. 6097-6102.
Kato, K. Studies of the chemical structure of konjak – mannan Part. ІІ. Isolation and characterization of oligosaccharides from the enzymatic hydrolyzate of the mannan [Text] / K. Kato, T. Watanabe, K. Matsuda //Agr. and Biol. Chem. – 1970. – Vol. 34, № 4. – P. 333-539.
Барбакадзе, В.В. Исследование глюкофруктана из луковиц гадючьего лука (мышиного гиацинта), Muscari szovitsianum Baker (Liliaceae) [Текст] / В.В.Барбакадзе, И.Л.Таргамадзе, А.И.Усов // Биоорганическая химия. – 1996. – Т.22, № 6. – С. 441-445.
Хамидходжаев, С.А. Распространение и исследование полисахаридов у представителей семейства Amaryllidaccae jaumest Hrceaire [Текст] / С.А.Хамидходжаев, Д.А.Рахимов, З.Ф.Исмаилов // Узб. биол. журн. – 1979. – № 5. – С.42-44.
Plant mucilages ХХVІІ. Isolation and characterization of a mucous polysaccharide, Narcissus – T –glucomannan from the bulls of Narcissus tazetta var. chinensis [Text] / M. Tomoda, M. Jokoi, A. Torigoc, K. Maru // Chem. Pharm. Bulb (Japan). – 1980. – Vol. 28 (ІІ). – P. 3251-3257.
Hayashi, K. Carbohydrates of the bulb of Licoris radiate (І) glucomannan [Text] / K. Hayashi, Y. Nagata, T. Mizumo // Chem. Absts. – 1955. – Vol. 49. – P. 4802.
Plant Mucilages. ХХХІІІ – An Acctyl - Rich Mucilage. «Licoris – S -glucomannan», from the Bulbs of Licoris sguamigera [Text] / M. Tomoda, N. Shimizu, K. Shimiada et al. // Chem. Pharm. Bulb. – 1983. – Vol. 31, № 11. – P. 3878-3882.
Andrews, P. Mannose contoining polysaccharides. Part ІV. The glucomannan of Lily Bulbs [Text] / P. Andrews, L. Hough, I.K.N. Iones // I. Chem. Soc. – 1956. – P. 181-188.
Thompson, I. L. The glucomannan of bluebell seed (Scylla nonscripta L) [Text] / I.L. Thompson, I.K.N. Iones // Cand.J. Chem. – 1964. – Vol. 42, № 5. – P. 1088-1091.
Полисахариды представителей сем. Liliaceae [Текст] / Д.А.Рахимов, А.О.Арифходжаев, А.Джаббаров, З.Ф.Исмаилов // Химия природных соединений. – 1980. – № 6. – С. 823-824.
Channe, D. Belkaradi Nenchsiddalah studu of the Strukture of Aloe vera [Text] / D. Channe //Carbohyd. Res. – 1979. – Vol.72. – P. 201-205.
Mandal, C. Structure of the glucomannan isolated from structure of the Aloe barbadensis Miller [Text] / C. Mandal, A. Das // Carbohyd. Res. – 1980. – Vol. 87. – P. 249-256.
Goldberg, R. Stude de a activite mannosidasique des grains d Asparagus officinalis L. [Text] / R. Goldberg // C.r.Acad. Sei. – 1969. – Vol. 269, № 15. – P. 1419-1422.
Рахимов Д.А. Полисахариды растений рода Eremurus [Текст] / Д.А.Рахимов, М.И.Игамбердиева, З.Ф.Исмаилов // Химия природных соединений. – 1976. – № 1. – С. 85-86.
Шербухин, В.Д. Установление последовательности в цепи глюкоманнана из клубнекорней E. Comosus O.Fedtch [Текст] /В.Д.Шербухин, Н.К.Шербухина, Б.Н.Степаненко // Растительные ресурсы. – 1976. – Т. 12, вып.4. – С.559-564.
Полисахариды некоторых видов сем. Liliaceae [Текст] / Д.А.Рахимов, З.Ф.Исмаилов, К.Тайжанов, С.А.Хамидходжаев // Химия природных соединений. – 1976. – № 6. – С. 651-652.
Изучение структурных фрагментов глюкоманнана E. Hissaricus [Текст] / В.Д. Шербухин, Н.К. Шербухина, Л.Г. Вейтина, Б.Н. Степаненко //Докл. АН СССР. – 1970. – Т. 191, № 6. – С.714-715.
Шербухин, В.Д. Резервный полисахарид E. Hissaricus Vved [Текст] / В.Д.Шербухин, Н.К.Шербухина // Растительные ресурсы. – 1970. – Т. 6, вып. 2. – С.186-192.
Шербухин, В.Д., Шербухина Н.К., Степаненко Б.Н. О резервном полисахариде клубнекорней E. Fuscus Vved. – Л., Наука. – 1970. – Т.6. – Вып. 1., С. 76-86.
Шербухин, В.Д. Строение дисахаридов из глюкоманнана E. Fuscus [Текст] / В.Д.Шербухин, Н.К.Шербухина, В.Л.Кириллина // Докл. АН СССР. – 1970. – Т. 200, № 6. – С. 1473-1475.
Рахимов, Д.А. Углеводные компоненты E. Turkestanicus [Текст] / Д.А.Рахимов, М.И.Игамбердиева, З.Ф.Исмаилов // Химия природных соединений. – 1973. – № 3. – С. 423-424.
Степаненко, Б.Н. О резервном полисахариде клубнекорней Eremurus Spectabilis Bieb [Текст] / Б.Н.Степаненко, К.Давлетмурадов // Растительные ресурсы. – 1966. – Т. 2, № 2 – С. 206-212.
Andrews, P. Mannose containing Polysaccarides Part ІІІ. The polysaccharides in the seets of iris Ochroleuca and J. sibirica [Text] / P. Andrews, L. Hough, I.K.N. Iones // J. Chem. Soc. – 1953. – P. 1186-1192.
Рахимов, Д.А. Полисахариды Iris. глюкоманнана Iris Sogdiana [Текст] / Д.А.Рахимов, М.И. Игамбердиева, З.Ф. Исмаилов З.Ф. // Химия природных соединений. – 1979. – № 4. – С. 466-471.
Шербухина, Н.К., Степаненко Б.Н., Шербухин В.Д. Изучение строения водорастворимых полисахаридов салепа и полисахарида эремурана [Текст] / Н.К.Шербухина, Б.Н.Степаненко, В.Д.Шербухин // Растительные ресурсы. – 1969. – Т. 5, № 3. – С. 398-406.
Daloul, M. Recherches sur les polysaccharides des Orchidees. 1. Etude des glucomannanes du Salep de Syrie [Text] / M. Daloul, F. Petek, J.E. Courtrais // Bull. Soc. Chem. boil. – 1963. – Vol. 45, № 12. – P. 1247-1254.
Courtrais, J.E. Recherches sur les polysaccharides des Orchidees. 2. Etude des glucomannanes de quatre especes d1 Orchidees francaises [Text] / J.E.Courtrais, M. Daloul, F. Petek // Bull. Soc. Chem. boil. – 1963. – Vol. 45, № 12. – P. 1255-1260.
Tomoda, M. Plant mucilages VІІ. Six oligosaccharides abtained from oderatan and falkatan by Partial acid hydrolysis [Text] / M.Tomoda, S. Nakatsuka, N. Saton // Chem. Pharm. Bulb (Japan). – 1973. – Vol. 21. – P. 2511-2516.
Арифходжаев, Ф.О. Полисахариды Polygonatum. ІІІ. Выделение и характеристика полисахаридов P. Roseum [Текст] / Ф.О.Арифходжаев, Д.А.Рахимов, З.Ф.Исмаилов // Химия природных соединений. – 1980. – № 2. – С. 246-247.
Рахманбердыева, Р.К. Выделение и характеристика глюкоманнанов Р. Рolyanthemum [Текст] / Р.К.Рахманбердыева, Д.А.Рахимов, Е.С.Кондратенко // Химия природных соединений. – 1982. – № 3. – С. 393-394.
Рахманбердыева, Р.К. Выделение и характеристика глюкоманнанов Р. Рolyanthemum [Текст] / Р.К.Рахманбердыева, Д.А.Рахимов, Е.С.Кондратенко // Химия природных соединений. – 1982. – № 5. – С.576-578.
Рахимов, Д.А. Полисахариды Роlygonatum ІV. Изучение структуры Роlygonatum Sewerzowii [Текст] /Д.А.Рахимов, Р.К.Рахманбердыева, З.Ф.Исмаилов // Химия природных соединений. – 1978. – № 5. – С. 555-559.
Смирнова, Н.И. Структура и свойства глюкоманнана из Эремурус ИАЭ и E. Zangezuricus: определение локализации ацетилгрупп в макромолекулах [Текст] / Н.И.Смирнова, Н.М.Местечкина, В.Д.Щербухин // Прикладная биохимия и микробиология. – 2001. – Т. 37 (3). – С.332.
Smirnova, N.I. Localization of acetyl Groups in the Macromolecule of Glucomannan Obteined from Rooms of Eremurus Zangezuricus [Text] / N.I.Smirnova, N.M. Mestechkina, V.D. Scherbukhin // Applied Biochemistry and Microbiology. – 2002. – Vol. 38 (5). – P. 467-469.
Буханова, У.Н. Методика определения суммы фруктозанов и фруктозы в сборе «Лорполифит» [Текст] / У.Н.Буханова, Д.Н. Попов, Н.Г.Селезенев // Фармация. – 2013. – № 1. – С. 22-24.
Beck, B.H.F. Inylinhaltuge pflanzen als Roustoffgwelle [Text] / B.H.F.Beck, W. Praznik // Starch starke. – 1986. – Vol. 38, № 11. – P. 391-394.
Nelsons, D. Fructans[Text] / D. Nelsons, W.G. Spollen //Shysiologia Plantanem. – 1987. – Vol. 71, № 4. – P. 512-515.
Методы химии углеводов [Текст] / под ред. Н.К.Кочеткова. – М.: Мир, 1967. – 512 с.
Углеводы Allium. Новый тип глюкофруктана из Allium Sativum [Текст] / М.А.Ходжаева, З.Ф. Исмаилов, У.С.Кондратенко, А.С. Шашков //Химия природных соединений. – 1982. – № 1. – С. 246-247.
Биохимические методы анализа растений [Текст] / под ред. М.Н. Запрометова. – М.: Иностр. лит., 1970. – 625 с.
Олиго- и полисахариды некоторых видов растений сем. Сложноцветных [Текст] / К.Турдумамбетов, З.Ажыбаева, Г.К.Усубалиева и др. // Изв. НАН Кырг. Респ. – 2011. – № 4. – С. 49-53.
Турдумамбетов, К. Олиго- и полисахариды растений C. Tianschanica и установление их химической структуры [Текст] / К.Турдумамбетов //Изв. НАН Кырг. Респ. – 2008. – № 3. – С. 34-37.
Маликова, М.Х. Полисахариды Ungeria. ХІ. Исследование глюкофруктанов Ungeria Vvedens Kyi [Текст] / М.Х.Маликова, Д.А. Рахимов, У.С. Кондратенко // Химия природных соединений. – 1983. – № 1. – С. 100-103.
Газожидкостная хроматография углеводов [Text] / под ред.Ю.С. Оводова. Владивосток. – 1970 – 136 с.
Михеев, А.Д. Содержание и моносахаридный состав водорастворимых полисахаридов корней некоторых видов Eremurus bieb, интродуцированных в Пятигорск [Текст] / А.Д.Михеев, Н.И. Смирнова, В.Д. Шербухин // Растительные ресурсы. – 2003. – Т. 39, № 2. – С.69-71.
Дудкин, М.С. Гемицеллюлозы [Текст] / М.С.Дудкин, В.С.Громов. – Рига: Зинатне, 1991. – 488 с.
Ананьина, Н.А. Полисахариды клубней георгины простой (Dahlia Single L.) [Текст] / Н.А.Ананьина, О.А. Андреева, Э.Т. Оганесян // Химия растительного сырья. – 2008. – № 2. – С.135-136.
Химия биологически активных природных соединений [Текст] / под ред. Н.А.Преображенский, Р.П. Евстигнеева. – М.: Химия, 1976. – 456 с.
Vitovskaya, G.A. Structure of extracellular heteroglycans of some cryptococus species [Text] / G.A.Vitovskaya, G.M. Samarkina, A.S. Shashkov // J. Biol. Chem. – 1988. – Vol. 10. – P. 405-412.
Кочетков, Н.К. Химия углеводов [Текст] / Н.К.Кочетков, А.Ф.Бочков, Б.А.Дмитриев. – М.: Наука, 1967. – 672 с.
Hakomori, S. N.A. Rapid permethylation of glucolipid and polysaccharides, catalyzed by methylsulfinul corbonion in dimethilsulfoxside [Text] / S. N.A. Hakomori // J. Biochem (Tokyo). – 1964. – Vol. 55. – P. 205-208.
Dass, N.N. Strukture of the D-Fructan isolated from Yarlie Bulbs (Allium sativum L.) [Text] / N.N. Dass, A. Sas // Carbohyd. Res. – 1978. – Vol. 64. – P. 155-167.
Хроматография на бумаге [Текст] / под ред. И.М. Хайса, К. Мацека. – М.: Мир, 1962. – 508 с.
Хроматография в тонких слоях [Текст] / под ред. Э. Шталя. – М.: Мир, 1965. – 508 с.
Lindber, Jonkgren J. Degration based upon periodate oxidation. – In: Adv. Carbohyd. Chem. And Biochem. – N-Y-SFr-Z [Text] / J. Lindber, Jonkgren, S. Sveusson //Acad. Press. – 1975. – Vol. 31. – P. 200-211.
Фудситяси, С. Окисление периодатом [Текст]: пер. с яп. / С.Фудситяси // Татнакусицу какусан косс. – 1968. – № 11. – С. 136-142.
Иванов, Н.Б. Общая характеристика полисахаридов коры лиственницы [Текст] / Н.Б.Иванов, Р.Г.Оводова, В.А.Бабкин // Химия растительного сырья. – 2006. – № 1. – С.15-20.
Rolf, D. Yrax. Analysis of the Sinkage Positions in D-fructofuranosyl Reridus by the Reductive-cbavage Method [Text] / D.Rolf, R. Yary //Carbohyd. Res. – 1984. – Vol.131, № 1. – P. 17-28.
Свиридов, А.Ф. Химические методы частичного расщепления полисахаридов [Текст] / А.Ф.Свиридов, О.С.Чижов // Биоорганическая химия. – 1976. – Т.2, № 3. – С. 315-350.
Выделение и общая характеристика полисахаридов пижмы обыкновенной [Текст] / А.Я.Поле, Р.Г. Оводова, А.С. Шашков, Ю.С. Оводов // Биоорганическая химия. – 2001. – № 1. – С. 52-56.
Isolation and structure analysis of glucomannan from the Seeds of Libyan dates [Text] / O.Ishrud, M. Zahid, V.U.Ahmad, Y.Pan // J. Agric Food chem. – 2001. – Vol. 49 (8). – P. 3772-3774.
Goldberg, R. Structural features of the cell-wall polysacharides of Asparagus officinalis seeds [Text] / R.Goldberg, L. Gillou, V.Michen //Carbohydrate Research. – 1991. – Vol. 210. – P. 263-276.
Ovodova, R.G. Structural Studies on Pectin from Marsh Cinquefoil Comarum palustre L. [Text] / R.G.Ovodova, D.A. Bushneva, Yu.S. Ovodov et al. //Biochemistry. – 2005. – Vol. 70. – P. 867-877.
Shydez, H.E. The Palteru of Action of Inulinase from Saccharomyces fragilis on Inulin [Text] / H.E. Shydez // Y. Biol. Chem. – 1962. – Vol. 237. – № 8. – P. 2438-2441.
David, S., Feindol. Isolation of sucsos and other related oligosaccharides from a partial acid hydrolisate of inulin [Text] / S. David // Biochem I. – 1956. – Vol. 22. – P. 196-197.
Жбанков, Р.Г. Инфракрасные спектры и структура углеводов [Текст] / Р.Г.Жбанков. – Минск: Наука и техника, 1972. – 456 с.
Gorin, P.A.I. Assignament of signals of the carbon-13 magnetic resonance Spectrum of a silcted polysaccharide comments on methodology [Text] / P.A.I. Gorin // Carbohyd Res. – 1975. – Vol. 39, № 1. – P.3-10.
Шашков, А.С. Спектроскопия 13С-ЯМР в химии углеводов и родственных соединений [Текст] / А.С.Шашков, А.С.Чижов // Биоорганическая химия. – 1976. – Т. 2, № 4. – С. 437-497.
Aspinall, G.O. Polysaccharide methodology and plant polysaccharides [Text] / G.O. Aspinall, A.M. Stephen // Carbochydrates, London. – 1973. – P.285-317.
Verstracten, L.M.Y. Infrared spectra of some 2-ketoses [Text] / L.M.Y. Verstracten //Anal. Chem. – 1964. – Vol. 36, № 6. – P. 1040-1044.
Suzuki, M. Fructosan in the timothy haplocorm [Text] / M. Suzuki //Can. J. Bot. – 1968. – Vol. 46. – P. 1201-1206.
Jelka, Tomosis. Yenning and Corneris P.J. Ylandemans. Evidence for a sindle type of linkage in a fructofuranan from Lolum perenne [Text] / Jelka, Tomosis, J. Harold // Carbohyd. Res. – 1978. – Vol. 62. – P. 127-133.
Scymour, F.R. Struktural analysis of levans by use of 13C – n.m.r. spectroscopy [Text] / F.R. Scymour, R.D. Knopp, J.E. Jweig // Carbohyd. Res. – 1979. – Vol. 72. – P. 229-239.
Manifestation of anomeric form, ring structure and linkage of the –C- n.m.r. spectra of oligomers and polymers containing D-fructose, maltulose, isomaltulose, surcore, leucrose, 1f-kectose, hystose, unulin and grass levan [Text] / H.C.Jarrel, T.F. Conway, P. Mayna, J.C.P. Smith J // Carbohyd. Res. – 1979. – Vol. 76. – P. 45-57.
Источник инулина практического значения [Текст] / Н.В.Плеханова, В.И.Иванов, Е.П.Крысин и др. // Химия и физико-химия углеводов. – Фрунзе, 1968. – С. 33-34.
Пат. № 50. Япония. Способ получения полисахаридов, обладающих противораковой активностью [Текст]. – 39121: 15.12.75.
Басс-Шадчей, Х.Ф. Изучение взаимосвязи химической структуры и биологической активности полисахаридов дрожжевой оболочки [Текст] / Х.Ф.Басс-Шадчей, А.А.Зейдака // Тез. докл. VІ Всесоюз. конф. по химии и биохимии углеводов. – М., 1977. – С.23.
Степаненко, Б.Н. Углеводы: успехи в изучении строения и метаболизма [Текст] / Б.Н.Степаненко. – М.: Б.и., 1968. – 300 с.
Хотимченко Р.Ю. Разработка фармакологических средств на основе низкомлекулярных пектинов и альгинатов для антитоксической терапии. [Текст]: дисс. канд. биол. наук / Р.Ю. Хотимченко – Владивосток, 2015. – С. 15.
Колева, М.В. Ацетолиз на глюкоманнан О2 щелирон от грудките на Аrum orientale [Текст] / М.В.Колева // Фармация. – 1979. – Т. 29, № 4. – С. 24-29.
Влияние глюкоманнана на регенерацию ткани печени на модели CCL4 – гепатоза у крыс [Текст] / М.М.Авраменко, В.А. Одинокова, Б.Н.Гладышев, Е.М.Афанасьева // Тез. докл. V Всесоюз. конф. по химии и биохимии углеводов. – М., 1972. – С. 3-4.
Volatile Compounds and Bioactivity of Eremurus Spectabilis (Ciris), a Turkish Wild Editle Vegetable [Text] / K.Karaman, B. Polat, I. Ozturk et al. // Journal of Medicinal Food. – 2011. – № 14 (10) – P. 1238-1243.
Novel physiological properties of ethanol extracts from Eremurus chinensis Fedtsch, roots: in vitro antioxidant and anticancer activities (Chine) [Text] / H.Hiao, Y. Wand, G.Xiang, L. Yuan // Food Funet. – 2012. – № 3. – P. 1310-1318.
Asparpanah, I. In vitro antiglucation activity of Eremurus percicus (Jaub Et Sp.) [Text] / I. Asparpanah, G. Arnin, M. Pavviz //African Journal of Biotechnology. Iran. – 2011. – Vol. 10 (54). – P. 11287-11289.
Glucomannan, a promising polysaccharide for biopharmacentical purposes [Text] / M. Alonso-Sande, D. Teijeiro-Osorio, C. Remunan-Lopez, M.I. Alonso // European Journal of Pharmacentics and Biopharmacentics. – 2009. – Vol. 72. – P. 453-462.
Eremurus Persicus, a new source of medicinally important compounds (Pakistan) [Text] / S.S.Khan, V.U.Ahmad, N.Sabe, R.B.Tareen // Pak. J. Bot. – 2011. – Vol. 43 (5) – P. 2311-2313.
Xe, Х.J. Textural and rheological properties of hydrolyzed Konjac Glucomannan and Kappa-Carrageenan: Effect of molecular weight, total content, pH and temperature on the mixed system [Text] / X.J. Xe, H.X. Wang, X.J.Gin. // J. Food Agric. – 2012. – Vol. 24 (3). – P. 200-207.
Saravanan. Anti-diabetic and anti-hyper Lipidemic activities of glucomannan isolated from Arallcarla Cunninghamii Seeds [Text] / C.T. Kumar, M. Lokesh, B. Gobinath, D. Kumar // Journal of Chemical and Pharmaceutical Sciences – 2013. – Vol. 6. – P. 204-209.
Konjac supplement alleviated hypercholesterolemia and hyperglycemia in type 2 diabetic subjects – a randomized double-blind trial [Text] / H.L.Chen, WH.Cheng, TS. Tay et al. // J. Am. Coll Nutr. – 2003. – № 22 (1). – P. 36-42.
Traditional uses and potential heath benefits of Amorphophallus konjac K. Koch ex [Text] / M.Chya, T.C. Baldwin, T.I. Hocking, K. Chan // N.E.Br. Journal of Ethnopharmacology. – 2010. – № 128 (2). – P. 268-278.
Effect of dietary Supplementation with glucomannan on plasma total cholesterol and low density lipoprotein cholesterol in hyper-cholesterolemic children [Text] / F.Martino, E.Martino, F.Morrone et al. // Nutr Metab Cardiovasc Dis. – 2005. – № 15(3). – P. 174-80.
Хохряков, А.П. Эремурусы и их культура [Текст] / А.П.Хохряков. – М.: Наука, 1965. – 128 с.
Сахобиддинов, С.С. Дикорастущие лекарственные растения Средней Азии [Текст] / С.С .Сахобиддинов. – Ташкент: Фан, 1948. – 216 с.
Турдумамбетов К. Углеводы растений рода Эремурус (глюкоманнаны, фруктозаны, пектиновые вещества и Д-манноза) [Текст]: моногр. / К.Турдумамбетов, Г.А.Бакирова. – Бишкек: Б.и., 2012. – 85 с.
Турдумамбетов, К. Углеводсодержащие растения рода Эремурусов, произрастающие в Кыргызстане [Текст] / К.Турдумамбетов, Г.А.Бакирова, А.Бердикеев // Проблемы и перспективы развития химии и химической технологии в Кыргызстане. – Бишкек, 2003. – С. 115-118.
Бакирова, Г.А. Углеводы корней Эремурус Гребенчатый [Текст] / Г.А.Бакирова, К.Турдумамбетов, Г.Усубалиева // Материалы III-й научно-практ. конф.: «Проблемы образования и науки», посвящ. 2200-летию Кырг. государственности. Нарын. гос. ун-т. – Бишкек, 2004. – С.158-160.
Методы биохимического исследования растений [Текст] / А.И.Эрмаков, В.В.Арасимович, Н.П.Ярош и др. – Л.: ВО Агропромиздат, 1987. – 430 с.
Бакирова Г.А. Изменение содержания углеводов в растениях Eremurus Сristatus в зависимости от сроков их хранения [Текст] / Г.А.Бакирова, К.Турдумамбетов // Проблемы и перспективы развития химии и хим. технологий в Кыргызстане. – Бишкек, 2003. – Вып. 7, ч.2. – С.119-122.
Бакирова, Г.А. Углеводы надземной части растений E. Cristatus [Текст] / Г.А.Бакирова // Изв. НАН Кырг. Респ. – 2010. – № 1. – С. 86-88.
Углеводы компонентов E. Cristatus [Текст] / Г.А.Бакирова, К.Турдумамбетов, Г.Усубалиева и др. // II Междунар. научно-практ. конф.: «Перспективы развития научно-инновационной деятельности». – Бишкек, 2010. - С. 64. (Тез. докл.).
Бакирова, Г.А. Общая характеристика углеводного состава листьев растений Eremurus Cristatus [Текст] / Г.А.Бакирова // Наука. Образование. Техника. Кыргызско-узб. ун-т. – Ош. – 2009. – № 1, ч. 1. – С. 136-137.
Кочетков, Н.К. Методы химии углеводов [Текст] / Н.К.Кочетков. – М.: Мир, 1967. – С.261.
Детерман, Г. Гель-хроматография [Текст] / Г.Детерман. – М.: Мир, 1970. – 250 с.
Calorimetric method for determination of sugars and related substances [Text] / M.Dubeis, K.A.Gilles, I.Homilton et al. //Anal. Chem. – 1956. – Vol. 28, № 3. – P. 350-356.
Hoffman I. Determination of the anomeric configuration of sugar residues in acetylated oligo-and polysaccharides by oxidation chromium trioxide in acetic acid [Text] / I.Hoffman, B.Linberg, S.Svensson // Acta Chem. Scand. – 1972. – 26. – P. 661-666.
Турдумамбетов, К. Глюкоманнаны растений Eremurus Cristatus [Текст] / К.Турдумамбетов, Г.А.Бакирова, Г.К.Усубалиева // Хим. журн. Казахстана. – 2007. – № 4. – С. 123-130.
Application of catalytic, hydrogen-deuterium exchande in 13C-n.m.r. Spectroscopy [Text] / F.Balza, N.Syr, G.N.Hamer tt al. // Carbohyd. Res. – 1977. – Vol. 59, № 1. – P.7-11.
Бакирова, Г.А. Частичный кислотный гидролиз глюкоманнан из E. Cristatus [Текст] / Г.А.Бакирова // Изв. НАН Кырг. Респ. – 2010. – № 2. – С. 108-110.
Рахимов, Д.А. Полисахариды Eremurus. ХХ. Фруктоолигосахариды из Е. Lactiflorus [Текст] / Д.А.Рахимов, А.Джумамуратова, Е.С.Кондратенко // Химия природных соединений. – 1984. – № 6. – С. 788.
Джумамуратова, А. Полисахариды Eremurus. ХVІІ. Структура глюкофруктана Е. Lactiflorus [Текст] / А.Джумамуратова, Д.А.Рахимов, Е.С.Кондратенко // Химия природных соединений. – 1983. – № 5. – С. 100-101.
Турдумамбетов, К. Фруктозаны Эремурус Кристатус [Текст] / К.Турдумамбетов, Г.А.Бакирова, Г.К.Усубалиева // І Междунар. научно-практ. конф.: «Перспективы развития научно-инновационной деятельности». – Бишкек, 2008. – С. 45. (Тез. докл.).
Бакирова, Г.А. Фруктоолигосахариды из клубней E. Cristatus [Текст] / Г.А.Бакирова, К.Турдумамбетов, Р.А.Гончарова // Изв. НАН Кырг. Респ. – 2011. – № 3. – С. 109-112.
Бузина, Г.В. Метод количественной и качественной характеристики [Текст] / Г.В.Бузина, О.Ф.Иванова, Л.Б.Сосновский //Хлебопекарная и кондитерская пром-сть. – 1965. – № 4. – С. 15.
Филиппов, М.П. Инфракрасные спектры пектиновых веществ [Текст] / М.П.Филиппов. – Кишинев: Штиинца, 1978. – 76 с.
Плеханова, Н.В. Углевод-и алкалоид-содержащие растения флоры Киргизии [Текст] / Н.В.Плеханова // Изучение препаратов растительного и синтетического происхождения. – Томск, 1978. – С.10-11.
Алкалоидоносные растения Киргизии [Текст] / Н.В.Плеханова, Е.В.Никитина, Дж. Саргазаков, А.И.Ботбаев. – Фрунзе: Илим, 1975. –
56 с.
Муравьев, И.А. Технология лекарств [Текст] / И.А.Муравьев. – М.: Медицина, 1980. – 390 с. (Ч.2: Технология галеновых препаратов).
Степаненко, Б.И. Получение кристаллической Д-маннозы из нового сырьевого источника-полисахарида эремурана [Текст] / Б.И.Степаненко, Р.А.Баксова // Биохимия. – 1961. – Т. 26, вып. 5. – С. 855-857.
А.с. № 833250. Способ получения Д-маннозы [Текст] / Н.В.Плеханова, А.Бердикеев, Г.П.Федорченко, А.В.Зенченко. – 2.02.1981.
Пат. № 1001. Кыргызская Республика. Способ получения
·-Д-маннозы [Текст] / К.Турдумамбетова, Г.А.Бакирова, Ж.Джорупбекова, З.Б.Бекмуратов. – 30.11.07.
Бакирова Г.А, Фруктозаны и пектиновые вещества, содержащиеся в двух видах растений [Текст] / К.Турдумамбетов, Д. Джорупбекова, Г.А.Бакирова, З.С.Ажибаева, Р.А.Гончарова //Известия Вузов. – 2014. – № 5. – С. 16-18.








ПРИЛОЖЕНИЯ








13 PAGE \* MERGEFORMAT 141615


13PAGE 14115




13 PAGE \* MERGEFORMAT 142115


13 PAGE \* MERGEFORMAT 1414015


H

H

O

H

H

O

H

O

A

c

C

H

2

O

A

c

C

H

2

C

H

-

O

-

C

H

3

H

O

H

R

O

O

A

c

C

H

2

O

A

c

M

e

O

N

a

O

H

O

H

H

R

O

H

O

H

C

H

2

O

H



ІV









V

(

V

I

I

)

O

H

H

O

H

O

H

H

O

H

H

O

M

e

C

H

2

O

M

e





VІІІ

І

O

H

H

H

O

H

H

O

M

e

C

H

2

O

M

e



VІІ



H

+

O

O

H

H

O

H

H

O

H

O

A

c

C

H

2

O

A

c

C

H

2

-

C

H

-

O

-

C

H

3

O

H

O

H

O

R

O

A

c

H

C

H

2

O

A

c

M

e

O

N

a

O

H

O

H

H

O

R

H

O

H

C

H

2

O

H

(



ІХ



(



Х

I

)

(

Х

I





)

O

H

H

O

H

O

H

H

O

H

H

O

N

e

C

H

2

O

N

e

(

X

ІІІ)

O

H

H

H

O

H

H

O

N

e

C

H

2

O

N

e

(



X

ІІ)

O

N

e

J

O

O

H

O

H



H

C

H

2

O

H

O

O

C

H

2

O

H

O

H

O

H

O

O

H

O

H

C

H

2

O

H

O

O

n

J

O

4

-

B

H

4

H

+

C

H

O

H

C

H

2

O

H

C

H

O

H

C

H

2

O

H

C

H

2

O

H

C

H



O

H

C

H

2

O

H

+

I

I

I

O

O

H

O

H



Н

C

H

2

O

H

O

O

C

H

2

O

H

O

H

O

H

O

O

H

O

H

C

H

2

O

H

O

O

n

C

H

3

J

H

+

O

H

O

O

C

H

3

O

C

H

3

C

H

2

O

C

H

3

H

,,O

H

O

O

C

H

3

O

C

H

3

C

H

2

O

C

H

3

H

,O

H

O

C

H

3

+

+

O

O

C

H

3

O

C

H

3

C

H

2

O

C

H

3

H,

O

H

O

C

H

3

O

H

O

O

C

H

3

C

H

2

O

C

H

3

H

,,O

H

O

C

H

3

I

I

I

I

V

V

V

I

O

C

H

2

O

H

H

O

O

H

H

H

O

H

O

H

O

H

O

C

H

2

H

O

H

O

O

O

H

O

H

H

O

H

2

C

H

O

R

O

H

O

H

H

O

H

2

C

H

H

O

H

n

J

O

4

-

H

C

O

H

C

O

O

C

H

2

O

H

H

H

C

O

H

C

O

O

H

O

C

H

2

H

O

O

H

O

H

H

H

O

R

H

C

O

H

C

O

O

H

O

H

2

C

H

n

H

O

C

H

2

O

C

H

2

O

H

H

O

C

H

2

H

H

2

C

O

H

H

2

C

O

H

O

H

O

C

H

2

O

O

H

O

H

H

O

H

2

C

H

H

O

R

H

O

H

2

C

C

H

2

O

H

O

H

O

H

2

C

n

C

H

2

C

H

2

O

C

H

2

O

H

C

H

2

O

C

H

2

O

C

H

2

O

H

B

H

4

C

H

2

O

C

H

2

O

C

H

2

O

H

H

+

H

C

O

O

H

+

C

H

2

O

H

C

H



O

H

C

H

2

O

H



Root Entry

Приложенные файлы

  • doc 7028949
    Размер файла: 3 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий