Diversity in the oxidation of substrates by cytochrome P450 2D6: lack of an obligatory role of aspartate 301-substrate electrostatic bonding //Biochemistry.


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
Министерство здравоохранения Российской Федерации

Государственное бюджетное образовательное учреждение

высшего профессионального образования

ПЕРВЫЙ МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ

УНИВЕРСИТЕТ имени И.М. СЕЧЕНОВА



На правах рукописи


АБДРАШИТОВ

Руст
ем Хамзиевич


РАЗРАБОТКА МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕН
НОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПИНОЛИНА
И ЕГО
МЕТАБОЛИТА МЕТОДОМ LC/MS/MS



14.04.02


Фармацевтическая химия, фармакогнозия


Диссертация

на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук



Научный руководитель:

докт
ор фармацевтических наук, профессор

Раменская Галина Владиславовна




Москва


2016

2


ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ









5

ВВЕДЕНИЕ











6

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ








11

1.1.

Система метаболизма (биотранс
формации) лекарственных средств

11

1.1.1.

История изуч
ения метаболизма лекарственных препаратов



11

1.1.2.

Системы и фермент
ы, участвующие в метаболизме ЛС



13

1.1.2.1.

Основные фазы метаболизм
а. Суперсемейство цитохром Р450

13

1.2.

Функциональные особенности и полиморфизм изофермента
CYP

2
D
6

21

1.2.1.

β
-
блокаторы как субстрат
CYP

2
D
6






24

1.2.2.

Метаболизм антипсихотических ЛС с участием CYP

2D6



25

1.2.3.

Влияние заболеваний печени на активность CYP 2D6



26

1.3.

Методы

определения

активности СУР

2
D
6 (фенотипирование)


27

1.3.1.

Количественное опре
деление дебризохина и спартеина



30

1.3.2.

Колич
ественное опреде
ление трамадола






31

1.3.3.

Количес
твенное определение метопролола





31

1.3.4.

Количественн
ое определение декстрометорфана




32

1.4.

Определение активности CYP

2
D
6 по отношению

пинолин/6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин





33

1.4.1.

Скрининг эндогенных субстратов
CYP

2
D
6





33

1.4.2.

Физические, химические и
биохимические свойства пинолина


34

1.4.3.

Существующи
е методики определения пинолина




36

1.4.3.1.

Определение
ex vivo









36

1.4.3.2.

Определение
in

vivo









37

1.5.

Метод ВЭЖ
Х
-
МС/МС









39

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВ
АНИЯ)

42

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ







42

2.1. Оборудование и материалы








42

2.1.1.

Материалы











42

2.1.1.1. Стандарты определяемых веществ






42

3


2.1.1.2. Биологическая матрица








42

2.1.1.3. Реактивы











42

2.1.2.

Оборудование










42

2.2. Разработанная методика









43

2.3. Дизайн фармакологической части







44

ГЛАВА 3. ОСНО
ВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ



46

3.1

Разработка

методики определения отношения пинолин и

6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин






46

3.1
.
1. Выбор внутреннего стандарта







46

3.1.2. Пробоподготовка










47

3.1.2
.1. Отбор проб. Пробоподготовка







47

3.1.2.2. Пробоподготовка плазмы крови







48

3.1.2.3. Пробоподготовка мочи








50

3.1.2.4. Вывод
ы по результатам пробопоготовки





51

3.1.3. Хроматографические условия







52

3.1.4. Масс
-
спе
ктр условия









54

3.2. Валидация

методики

определения пинолин
а

и

6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин






55

3.2.1. Параметры пригодности хроматографической системы



55

3.2.1.1. Сел
ективность










56

3.2.1.2. Линейность зависимости отклика от концентраций определяемых

в
еществ












57

3.2.1.2.1. Получение данных для построения калибровочного графика


58

3.2.1.2.2. Построение калибровочного графика






58

3.2.1.2.3. Оценка
линейности









58

3.2.1.3. Оценка правильности и прецизионности методики




62

3.2.1.4. Оценка предела количественного определения




63

3.2.1.5. Эффект матрицы









64

3.2.1.6. Стабильность анализируемых веществ






66

3.2.1.6.1. Стабильность стан
дартного раствора






66

4


3.2.1.6.2. Стабильность пинолина и его метаболита в составе

биологической матрицы при хранении в замороженном состоянии


67

3.2.1.6.3. Стабильность пинолина и его метаболита после пробоподготовки

68

3.2.1.7. Тест на разведение









70

3.3. Зависимость активности

изофермента

CYP

2
D
6
и

изменения
отношения

пинолина и 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина


71

3.3.1. Изучение влияния почечной патологии на

активность

изофермента CYP 2D6










73

3.3.2. Изменение активности изофермента CYP 2D
6 под дей
ствием

ингибиторов и индукторов









75

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ










77

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ









79




















5


СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

CYP



cytochrome P450


цитохром Р450

НЛР



нежелательные лекарственные реакции

LC/MS/MS



ВЭЖХ
-
МС/МС


высокоэффективная жидкостная хроматографи
я с
тандемным

масс
-
спектрометрическим детектированием

ЛС


лекарственное средство

FDA



Food

and

Drug

Administration



Управление по санитарному надзору за
качеством пищевых продуктов и медикаментов

MEG
X



m
onoethylglycinexylidide



моноэтил
-
глицин
-
ксилиди
т

HPLC



ВЭЖХ


высокоэффективная жидкостная хроматография

М1


моно
-
О
-
дезметилтрамадол

ДНК



дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР


п
олимеразная цепная реакция

ТФЭ



твердофазная экстракция

MRM



multiple

reaction

monitoring



мониторинг

множественных

реакц
ий

EMA



European

Medicines

Agency



Европейское агентство лекарственных
средств









6


ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы

С проблемой частого развития нежелательных лекарственных реакций
сталкивается каждый врач и частично решить данную проблему позволяют
персон
ализированные подходы к фармакотерапии. Одним из инструментов
персонализированной медицины является изучение фармакокинетики
лекарственных средств.

Одним из основных фармакокинетических процессов, определяющих
индивидуальный фармакологический ответ, являет
ся метаболизм, или
биотрансформация лекарственных средств. Большой вклад в метаболизм многих
ксенобиокиков вносит система цитохрома

P
450
, которая состоих из множества
изоферментов, отвечающих за биотрансформацию как экзогенных
,

так и
эндогенных веществ. Од
нако в метаболизме лекарственных средств принимают
участие ферменты семейств I, II, III. Наиболее важными для метаболизма ЛС и
хорошо изученными изоферментами цитохрома Р450 являются следующие

изоферменты:

CYP

1A1, CYP

1A2, CYP

2A6,

CYP

2B6,

CYP

2D6, CYP

2
C9, CYP

2C19, CYP

2E1, CYP

3A4 [
11
].

Определение активности того или иного фермента метаболизма ЛС по
фармакокинетике его специфического субстрата («маркерного» субстрата) и его
метаболита
называется

фенотипиров
ание
м
. Существуют методики определения
изоферментов с применением экзогенных или эндогенных «маркеров».

В настоящее время
за рубежом
для оценки активности
CYP 2D6

в научных
целях широко используется экзогенное вещество декс
трометорфан. Данный тест
обладае
т

рядом выраженных недостатков, таких как необходимость
внутривенного

или перорального

введения препарат
а, применение которого

сопряжено с риском развития НЛР. Также декстрометорфан в виде
монокомпонентного препарата не зарегистрирован на территории РФ, что

делает
практически невозможным его применение

в клинической практике
.

В связи с этим более перспективны методы оценки активности
CYP 2D6

по
концентрации в биологических жидкостях эндогенного субстрата и его
7


метаболита. Такими субстратами являются пинолин
и его метаболит 6
-
гидрокси
-
1, 2, 3, 4,
-

тетрагидро
-
β
-
карболин, которы
й

образуются преимущественно под
действием
CYP 2D6

[
55
]. Поскольку определение эндогенного вещества
исключает необходимость введения какого
-
ли
бо лекарственного средства, то у
пациентов не будут развиваться НЛР и такая методика будет более безопасной
для больного.

Все вышесказанное определяет актуальность настоящего исследования.

Цель исследования



разработать методику

количественного определени
я
пинолина и его метаболита методом LC/MS/MS для оценки активности
изофермента CYP

2D6

с целью рационализации фармакотерапии
.

Задачи исследования:

1.
Выявить и теоретически обобщить, согласно результатам отечественных и
зарубежных литературных источнико
в,
данные, отражающие применение

различных методик определения активности изофермента CYP

2D6 методом
ВЭЖХ
.

2.
Подобрать оптимальные условия количественного определения пин
олина
и 6
-
гидрокси
-
1, 2, 3, 4,
-
тетрагидро
-
β
-
карболин
а

в биологических жидкостях
методом

LC/MS/MS
.

3.
Провести валидацию разработанной методики
.

4.
Изучить активность CYP

2D6 у пациентов с помощью разработанной
методики
.

5.
Изучить изменение активности CYP

2D6 у пациентов при приеме
ингибиторов активности данного изофермента.

6.
Сделать вывод

о возможности использования данной методики для
определения изменений активности при приеме ингибиторов активности
CYP
2D6
.

Научная новизна.

В данной работе впервые представлены разработанные и
валидированные методики количественного определения
пинолина
и его
метаболита 6
-
гидрокси
-
1, 2, 3, 4,
-
тетрагидро
-
β
-
карболин
а

в плазме крови и моче
человека

в диапазоне концентраций от 250 до 1500

пг/мл
. На основании
8


экспериментальных данных сделан вывод о возможности определения активности
CYP

2D6 у пациентов с помощ
ью разработанной методики. Также применение
данной методики количественного определения возможно при назначении
ингибиторов изофермента
CYP

2
D
6.

Методология и методы исследования.

В ходе выполнения работы

были
применены методы

пробоподготовки с твердофазно
й экстракцией и
высокоэффективной жидкостной
хроматографии с
тандемным

масс
-
спектрометрическим детектированием.

Теоретическая и практическая значимость результатов исследования.
Разработанные биоаналитические методики были внедрены в практическую
деятельно
сть
в лаборатории клинической фармакологии ФГБУ ГНЦ «Институт
иммунологии» ФМБА России и в филиале «Клиническая фармакология»
ФГБУН
НЦБМТ ФМБА России
.

Степень достоверности результатов исследования.

Первичные

данные,
полученные в результате проведения наст
оящего исследования,

получены при
помощи современных методов анализа, являются

достоверными и точными, что
подтверждено в ходе проведения процедуры

валидации. Использованное в работе оборудование имело действующие

свидетельства о поверке и зарегистрировано

в Реестре средств измерений,

что
позволяет считать результаты исследования достоверными.

Апробация работы.


Апробация работы проведена на заседании кафедр
ы
фармацевтической и
токсикологической химии

им. А.П. Арзамасцева

фармацевтического факультета
Первог
о МГМУ имени И.М. Сеченова (2016 г.).


Основные положения работы и результаты исследования доложены на
научном совете НИИ Фармации «Достижения и перспективы молодых ученых
НИИ Фармации» (Москва, 2014 г.), научном совете НИИ Фармации «Достижения
и перспекти
вы молодых ученых НИИ Фармации» (Москва, 2015 г.), на Конгрессе
Европейской академии аллергологии и клинической иммунологии (EAACI)
(Барселона, 2015 г.).

9


Личный вклад автора.

Автору принадлежит ведущая роль в

проведении
экспериментальных исследований, анал
изе и обобщении

полученных результатов.
Автором лично проведена разработка, валидация

методик определения

пинолина и его метаболита в плазме крови человека и в
моче

методом
ВЭЖХ
-
МС
/МС
, статистическая обработка результатов,

изучена
активность CYP

2
D
6
. Вклад

автора является определяющим на всех этапах

исследования: от постановки задач, их экспериментально


теоретической

реализации до обсуждения результатов в научных публикациях, докладах и

внедрения в практику.

Соответствие диссертации паспорту научной специ
альности

Научные положения диссертации соответствуют формуле

специальности
14.04.02 «Фармацевтическая химия, фармакогнозия».

Результаты проведенного
исследования соответствуют области исследования

специальности, конкретно
пункту 4 паспорта специальности

«Ф
армацевтическая химия, фармакогнозия».

Публикации

По мате
риалам диссертации опубликовано 14 работ, из них 2



в

изданиях из
Перечня ВАК

и 1


в издании, включенном в базу
Scopus

и
Web

of

Science
.

Связь темы исследования с проблемным планом фармацевтических

наук

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы

кафедры
фармацевтической и токсикологической химии Первого МГМУ

имени И.М.
Сеченова "Совершенствование образовательных технологий

додипломного и
последипломного медицинского и фармацевтическо
го

образования". Номер
государственной регистрации: 01.2.011.68237.

Положения, выносимые на защиту

1.

Разработанные методики количественного определения пинолина и его
метаболита 6
-
гидрокси
-
1, 2, 3, 4,
-

тетрагидро
-
β
-
карболин
а

в плазме крови и моче с
помощью м
етода ВЭЖХ
-
МС/МС.

2.

Результаты валидации разработанных методик, выводы по полученным
результатам.

10


3.

Результаты определения активности
CYP

2
D
6

у пациентов с помощью
разработанной методики.

4.

Результаты использования данной методики для определения изменений
актив
ности при приеме индукторов активности
CYP 2D6
.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на
89

страницах машинописного

текста,
состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части,

6

общих
выводов и списка литературы. Диссе
ртация включает
35

таблиц и
13

рисунков.
Библиографический список содержит
101

источников, из них
82

на

иностранных
языках.





















11


ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1.

Система метаболизма (биотранс
формации) лекарственных средств

1.1.1.

История изучения
метаболиз
ма лекарственных препаратов

Первые эксперименты по изучению метаболизма ЛС были впервые
проведены и опубликованы более 180 лет назад, сначала на собаках в 1824 году и,
затем, на людях в 1841 году

[
99
,
92
]
. Данные эксперименты заложили основу
современного понимания биотрансформации путем установления теории, что в
организме протекает ряд химических реакций с экзогенным соединением для
выведения его с мочой в химически модифицированной форме. Тем не м
енее,
исследования метаболизма были ограничены сложностью изолирования и
идентификации предполагаемых метаболитов. Однако существенный прогресс в
области органической химии и аналитических методов привел к продвижению в
исследованиях фармакокинетики и мета
болизма ксенобиотиков.

Первой опубликованной реакцией метаболизма была реакция конъюгации с
глицином. В 1841 и 1842 году, двое ученых независимо друг от друга приняли
бензойную кислоту и, по сообщению исследователей, наблюдали данный
конъюгат в моче «в оби
льном количестве» и «без видимых вредных последствий»
[
92
,
56
]
. Выделенное соединение было схоже с бензойной кислотой, но при
изучении строения молекулы было обнаружено, что в составе так же был азо
т.
Идентифицировал это соединение, как гиппуровую кислоту, конъюгат глицина с
бензойной кислотой, французский ученый по имени Дессень
[
35
]
.

При дальнейшем исследовании бензойной кислоты было обнаружено, что
окисление предшеств
ует конъюгации. После приема коричной кислоты,
наблюдали выведение гиппуровой кислоты

[
41
,
100
]
. Но механизм этих
преобразований не был изучен, поскольку в ту эпоху, организм считался просто
сосудом
, в котором проходят химические реакции. Многие реакции для химиков
были «абсолютно загадочными», потому что, вне организма, эти реакции
проходили в очень жестких условиях либо вообще были невозможны

[
29
]
.
Например, когда в 186
7 году
Schultzen

и
Naunyn

опубликовали определение
12


фенола в моче людей и собак, которые принимали бензол, окисление бензола до
фенола в условиях лаборатории считалось невозможным. На сегодняшний день
провести реакцию по преобразованию бензола в фенол можно

только в жестких
нефизиологических условиях

[
67
]
.

В 1887 после приема ацетата пиридина у собак в моче был обнаружен
N
-
метил пиридин, таким образом, была описана реакция метилирования
[
52
]
. Кроме
т
ого, в 1887 году
Jaffe

и

Cohn

впервые обнаружили вещество, сопряженное с
уксусной кислотой

[
54
]
. Затем, в 1893 году
Cohn

подтвердил, что
N
-
ацетилирование является основной реакцией конъюгации

[
28
]
.

В ходе проведенных экспериментов было обнаружено, что выделяемые
соединения гораздо менее токсичные, чем исходные соединения. К 1893 году
накопилось достаточно доказательств для внедрения в научную литературу
термина «детоксикация»
[
70
,
1
]
.

В
XIX

веке считалось, что вещества модифицируются организмом в крови.
Но вначале ХХ века, сторонники теории трансформации веществ в органах
смогли подтвердить свои предположения с помощью таких методов, как резек
ция
печени, перфузия печени и почек лабораторных животных. О том, что в печени
проходит реакция конъюгации с глюкуроновой кислотой стало известно
благодаря методу с применением серий перфузированных органов собаки
(например, печени или селезенки).

Системат
изировал накопившиеся труды по изучению метаболизма в 1947
году
Welshman R.T. Williams
. Именно
Williams

предложил разделить реакции
метаболизма на 2 фазы, что привело к появлению до сих пор известных терминов
«
I

фаза» и «
II

фаза»
[
98
]
.

Благодаря достижениям в области аналитических и биохимических методов
анализа, начиная с 1950
-
х годов, ускорились темпы изучения метаболизма.
Например, распределительная хроматография позволила дифференцировать ЛС
от метаболитов. Возможности абс
орбционной спектрофотомерии также
улучшили как количественное, так и качественное определение ЛС и
13


метаболитов. Впервые были выяснены кофакторы ферментативных реакций и
были установлены ферментативные пути биосинтеза кофакторов. В конце 1950
-
х
и начале 196
0
-
х была открыта и охарактеризована система ферментов цитохрома
Р450, с помощью которой происходит микросомальное окисление ЛС и
стероидных гормонов

[
68
,
58
,
73
,
72
]
.

В 1983 году из печени человека были выделены, идентифицированы и
охарактеризованы основные компоненты цитохрома Р450

[
95
]
. Определение
точной структуры метаболитов и их количественное определение ста
ло
возможным благодаря развитию методов масс
-
спектрометрии и спектроскопии
ядерного магнитного резонанса.

Несмотря на то, что направление по изучению метаболизма считают зрелым,
достижения техники двигают вперед исследования по данной тематике.
Фармацевтич
еская индустрия стимулирует к развитию большинство направлений
современных технологических разработок, в том числе высокоразвитые
аналитические инструменты. Также с развитием «геномной эры» были изучены
генетические основы метаболизма ЛС среди индивидов и
популяций. В будущем
изучение метаболизма будет зависеть от появления и развития новых технологий.

1.1.2.

Системы и ферменты, участвующ
ие в метаболизме ЛС

1.1.2.1.

Основные фазы метаболизм
а. Суперсемейство цитохром Р450

Основная функция метаболизма ЛС заключается в том, ч
тобы облегчить
выведение соединений из организма, таким образом, предотвращая
нежелательное накопление чужеродных соединений или потенциально токсичных
концентраций эндогенных соединений. Эта физиологическая функция
описывается количественными фармакокинет
ическими терминами −

биодоступность и клиренс. Биодоступность показывает количество принятого
ЛС, которое достигло системного кровотока, т. е. количество абсорбированного
ЛС минус пресистемный метаболизм. Степень выведения ЛС из системного
кровотока и ско
рость постсистемного метаболизма характеризует клиренс.
Биодоступность и клиренс в совокупности влияют на общее воздействие ЛС на
14


организм и количественно характеризуются площадью под фармакокинетической
кривой (
AUC
) (рис. 1).


Рис
унок

1

-

Фармакокинетич
еская кривая (
a
) и путь перорального ЛС (
b
).

Каждое соединение обычно биотрансформируется через ряд параллельных
и/или последовательных реакций, через так называемый метаболический путь и,
при этом, на разных стадиях образуются различные соединения. Общий
метаболизм любого соединения является суммой всех доступных путей
метаболизма ЛС. Условно реакции метаболизма можно разделить на «
I

фазу» и
«
II

фазу».

I

фаза метаболизма включает в себя функциональные реакции (окисление,
восстановление, гидролиз). С помощь
ю этих реакций вводятся новые полярные
функциональные группы, изменяются существующие группы с повышением
полярности или гидролизуются закрытые полярные группы.

II

фаза характеризуется реакциями конъюгации (глюкуронирование,
сульфонирование, конъюгация с г
лицином/глютамином/глютатионом,
ацетилирование, метилирование). После конъюгации резко увеличивается
полярность соединения, что способствует лучшему выведению.

15


Следует отметить, что все реакции биотрансформации проходят в очень
мягких условиях: нейтральный

рН, приблизительно 37°С, водный растворитель и
атмосферное давление. Только благодаря ферментам, участвующим в реакциях в
качестве катализаторов, реакции протекают в таких условиях.

При определении биодоступности и фармакокинетики ЛС следует учитывать
р
оль различных семейств ферментов, которые участвуют в его метаболизме.
Оценивают метаболизм ЛС по тем ферментам, которые проявляют большую
активность по отношению к субстрату.

В реакциях
I

фазы метаболизма в качестве катализаторов участвуют
различные класс
ы ферментов. Поскольку изоферменты суперсемейства
цитохрома Р450 широко представлены в организме, они доминируют среди
других ферментов по вкладу в биотрансформацию ЛС. Подсемейства
CYP

1,
CYP

2
и
CYP

3

метаболизируют большинство ЛС и ксенобиотиков
[
46
,
97
]
. Два
важных класса ферментов локализованы в эндоплазматическом ретикулуме,
рядом с цитохромом Р450: флавин
-
содержащие монооксигеназы, которые
участвуют в реакциях
N
-

и
S
-
окисления и
уридин
-
5
-
дифос
фат

глюкуронилтрансфераз
ы, которые катализируют конъюгацию с
уридин
-
5
-
дифосфорной глюкуроновой кислотой. В дополнение к этим
семействам, существуют
N
-
ацетил трансферазы, сульфотрансферазы, глутатион
трансферазы, алкоголь дегидрогиназы и альдегид дегидрогин
азы. Почти все
метаболические пути включают один или несколько ферментов


большинство
включают цитохром Р450.

Цитохром Р450 является одним из наиболее важных семейств ферментов,
которые участвуют в регуляции фармакологически активных, токсичных и
потенциа
льно токсичных ксенобиотиков. Ферменты цитохрома являются
мембранно
-
связанными гемопротеинами, которые соединяются с гладким
эндоплазматическим ретикулумом. Известно, что субстратами цитохрома
являются соединения с различными функциональными группами, кото
рые
подвергаются метаболизму путем окисления.

16


Цитохром делится на подсемейства в зависимости от общей аминокислотной
последовательности. Более 50 различных изоферментов идентифицированы у
человека. Среди них проявляют активность в метаболизме большинства Л
С
следующие изоферменты:
CYP

1
A
2, 2
A
6, 2
B
6, 2
C
8, 2
C
9, 2
C
19, 2
D
6, 2
E
1, 2
J
2, 3
A
4,
3
A
5, 4
F
2, 4
F
3
a
, 4
F
3
b

и

4
F
12
. Фактически CYP 1A2, 2C8, 2C9, 2C19, 2D6 и

3A4

являются наиболее важными изоферментами при определении
фармакокинетических параметров.

Эта номенклат
ура используется не только у человека, но и у других видов.
Как правило, у различных видов изоферменты имеют схожие между собой
структуру, функции и название, но, важно отметить, что они не идентичны
человеческим формам. Даже небольшое различие в аминокисл
отной
последовательности может повлиять на сродство к субстрату и на способность
фермента метаболизировать субстрат и/или регион специфичное место молекулы.
Изучая метаболизм, следует обращать внимание на стадии биотрансформации,
которым подвергается субст
рат, а также определять ферменты, под действием
которых происходят такие трансформации. Фармакокинетические показатели,
полученные в испытаниях
in

vivo

на мышах или других лабораторных животных,
не всегда коррелируют с показателями человека. Для прогнозиро
вания
фармакокинетики ЛС у человека нужно проводить анализ на разных видах
животных, а также учитывать данные, полученные в испытания
in

vitro

и
in

silico

[
84
,
89
]
.


Как семейство, несколько изоферм
ентов вместе участвуют в окислении и
биотрансформации сложных соединения. Однако у отдельных изоферментов есть
тенденция к большей селективности к субстратам с определенными свойствами,
что позволяет дифференцировать их (табл.
1)

[
64
,
65
]
.

CYP

1
A
1
часто участвует в
метаболизме арильных углеводов
[
40
]
. У CYP 1A1 и

CYP

1A2

частично совпадает
сродство к субстратам; однако,
CYP

1A2

преимущественно метаболизирует
полицикличе
ские ароматические углеводы. Как CYP 1A1, так и

CYP

1A2

участвуют в биотрансформации проканцерогенов в канцерогены. Было показано,
17


что

CYP

1A2

является основным ферментом, метаболизирующим такие ЛС, как
фенацетин и теофиллин.
CYP

2A6

отдает предпочтение бо
лее мелким,
нейтральным, менее липофильным молекулам, таким как кетоны и нитрозамины.
CYP

2C9 и CYP

2C19

могут метаболизировать кислые молекулы.
CYP

2C9

участвует в реакциях О
-
деметилирования фенольных радикалов, окислении
ароматических метил радикалов, ра
дикалов, содержащих атом серы,
N
-
деалкилировании

[
84
]
. Напротив, CYP 2D6 может метаболизировать основные
молекулы с атомом азота (флуоксетин, нортриптилин, декстрометорфан и
буфуралол), а также катализирует реакции О
-
деметилиро
вания, окисления метил
радикалов и фенол О
-
деметилирования.
CYP

2E1

эффективен в
биотрансформации малых молекул (этанол, ацетаминофен, халотан и пара
-
нитрофенол), а
CYP

3A4



больших, липофильных молекул (симвастатин,
тестостерон, кортизол, циклоспорин и м
идазолам)

[
47
,
64
]
. Также
CYP

3A4

проявляет активность при
N
-
деалкилировании, гидроксилировании
ароматических систем и окислении радикалов, содержащих серу.

Изофермент

Свойство субстрата

Пример субс
трата

CYP1A1, 1A2

Плоская липофильная;
нейтральная или основная
молекула

Фенацетин, дапсон, такрин,
рамелтеон, кофеин,
теофиллин

CYP2C9

Кислотная молекула
средних размеров

Диклофенак, варфарин,
толбутамин, лозартан

CYP2C19

Основная молекула
средних раз
меров

(
S
)
-
мефетоин, омепразол

CYP 2D6

Основная молекула
средних размеров с
протонируемым атомом
азота

Флуоксетин,
декстрометорфан,
нортриптилин, буфуралол

CYP2E1

Маленькая, нейтральная
молекула

Паранитрофенол, этанол,
хлорзоксазон

CYP3A4

Большая, липофи
льная
молекула

Тестостерон, циклоспорин А,
нифедипин, мидазолам,
симвастатин, кортизол

Таблица 1
-

Цитохром Р450 и его субстратная селективность.

18


3
D

структура белка субстрата уникальна для каждого изофермента и, таким
образом, контролируются участки связы
вания с лигандами. Субстраты и
ингибиторы должны быть в состоянии вступить во взаимодействие со
связывающим участком. Несмотря на то, что у лиганда и активного центра белка
есть конформационная гибкость, исследования показали, что эта гибкость
ограничена а
томными, водородными и прочими связями. Таким образом, каждый
изофермент ограничен диапазоном лигандов, которые могут взаимодействовать с
активным центром, и эти ограничения определяют субстратную, ингибиторную и
региоселективность каждого изофермента цито
хрома Р450.

Селективность изофермента относится к способности активного центра
связаться с лигандом. Например, потенциальный лиганд не сможет связаться с
активным центром, если он не подходит по структуре связывающему или
каталитическому участкам. Также мо
жет быть, что лиганд подходит по размеру,
но у него нет дополнительных функциональных групп, необходимых для
связывания с изоферментом. С помощью рационального изучения лигандов,
окисленных конкретными изоформами цитохрома Р450 можно разработать
надежные п
араметры для прогнозирования специфичности

[
63
,
90
]
. По данным
исследования подготовлено древо решений для прогнозирования селективности
основных изоферментов (рис.

2).

19



Рисунок 2

-

Древо решений д
ля прогнозирования селективности изофермента
цитохрома Р450.

На базе быстро развивающихся компьютерных технологий, ученые
разрабатывают методы прогнозирования селективности изоферментов
in

silico
. С
помощью этих методов определяются участки, которые подвер
гаются
метаболизму посредством цитохрома

[
101
]
. Разработано и валидировано
компьютерное обеспечение, которое позволяет быстро обработать несколько
сотен молекул потенциальных ЛС и выявить какие участки молекулы будут
метаболизи
роваться, каким изоферментом, а также какие возможные метаболиты
будут образовываться
[
26
]. Данные, полученные
in

silico
, облегчают дальнейшее
изучение ЛС
in

vitro

и
in

vivo
.


Белки
-
переносчики эндогенных веществ и ЛС.

За после
днее десятилетие наблюдается повышенный интерес к роли белков
-
переносчиков в распределении веществ в организме. На сегодняшний день
Все
потенциальные
субстраты

Планарная молекула
(ароматическое
кольцо)

CYP1A2

Большая
молекула

Средняя
молекула

Маленькая
молекула

Нейтральная
или
основная

Нейтральна
я,
основная

или
кислотная

CYP2E1
или
CYP2A6

Кислотная

Нейтральная

Основная

CYP3A4

CYP2C8

CYP2C9

CYP26^

CYP2C19

Да

Да

Да

Да

Да

Да

Да

Да

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Нет

Да

20


известно, что белки
-
переносчики могут играть ключевую роль в фармакокинетике
ЛП. При ингибировании или индукции белков
-
пере
носчиков могут проявляться
НЛР, снижение эффективности или межлекарственные взаимодействия [
24
,
93
].

Белки
-
переносчики представлены различными семействами либо
индив
идуальными переносчиками (таблица 2).

Семейство

Генное семейство

Ген

АВС переносчики

Белок полирезистентности

MDR1/P
-

gp

MRP1

MRP2

MRP3

MRP4

Экспортная помпа желчных солей

BSEP

Белок резистентности рака молочной
железы

BCRP

К
отранспортн
ый

белок натрия таурохолата

NTCP

Переносчики
растворенных веществ

Олигопептидные переносчики

PEPT 1

PEPT 2

Органические анион
-
транспортирующие

полипептиды



OATP
-

A/OATP1A2

OATP
-

B/OATP2B1

OATP
-

C/OATP1B1

OATP8/OATP1B3

OATP
-

D/OATP3A
1

OATP
-

E/OATP4A1

OATP
-

F/OATP1C1

Переносчики органических катионов

OCT1

OCT2

OCT3

Новые переносчики органических катионов

OCTN1

OCTN2

Переносчики органических анионов

OAT1

OAT2

OAT3

OAT4

Таблица 2
-

Семейства белков
-
перено
счиков.

21


Из всех белков
-
переносчиков, представленных в таблице 2, наиболее изучен
гликопротеин
-
Р. Ген
MDR
1 экспрессируется в различных тканях организма.
Гликопротеин
-
Р локализуется на внешней мембране энтероцитов, в клетках
проксимальных почечных канальцев,

желчных канальцев, на границе
гематоэнцефалического барьера и т.д [
53
]. Гликопротеин
-
Р выводит из клеток
ксенобиотики обратно в кровоток или в почечные канальцы, тем самым защищая
организм от экзогенных веществ
. Поскольку экзогенными веществами являются и
ЛП, гликопротеин
-
Р обуславливает резистентность организма к ним и вносит
большой вклад в их фармакокинетику.

Межлекарственные взаимодействия наблюдаются при ингибировании или
индукции активности гликопротеина
-
Р
. Классическим примером такого
взаимодействия выступают дигоксин и такие ингибиторы гликопротеина
-
Р, как
кинидин, кларитромицин или аторвастатин. При приеме этих ЛП происходит
усиление эффекта дигоксина и повышается частота возникновения НЛР,
поскольку гли
копротеин
-
Р не выводит дигоксин из организма. Проблема
межлекарственных взаимодействий особенно остро стоит у лекарств с узким
терапевтическим окном. К таким ЛП относятся, например, дигоксин,
противоопухолевые препараты и иммуносупрессоры [
83
,
82
].

При дальнейших исследованиях важной областью изучения остается
понимание и предсказание межлекарственных взаимодействий, которые
опосредованы белками
-
переносчиками. Несмотря

на то, что в изучении
механизмов регулирования белков
-
переносчиков было сделано много открытий,
данная область также является перспективной.

1.2
.Функциональные особенности и полиморфизм изофермента CYP

2
D
6

Среди десятков изоферментов цитохрома Р450, котор
ые участвуют в
биотрансформации ксенобиотиков, изофермент CYP

2
D
6

является одним из
наиболее важных ферментов, осуществляющих метаболизм лекарственных
средств. По данным различных исследований CYP

2
D
6

участвует в метаболзме от
15 до 25 % лекарств
[
11
,
25
,
31
]
. Изофермент в основном экспрессируется в
22


печени, но он так же локализуется в легких и сердце. Особенностью данного
изофермента является его высокая межвидовая и вну
тривидовая вариабельность
активности, причиной которой является генетический полиморфизм. Такой
полиморфизм может приводить к 30


40 кратной разнице в клиренсе препаратов,
что приводит к выходу концентрации из терапевтического окна
,

как по нижней,
так и п
о верхней границе

[
12
]
. Как следствие, такие различия в активности CYP

2
D
6

могут привести не только к серьезным НЛР (например, при
антидепрессантной терапии), но также может наблюдаться отсутствие
фармакологического эффекта (на
пример, отсутствие анальгетического эффекта
опиоидных препаратов).

Основываясь на проявлениях фенотипа, генотипы можно разделить на 3
подгруппы: «распространенные» (активные) метаболизаторы, «медленные»
метаболизаторы и «сверхактивные» или «быстрые» метабо
лизаторы. У людей с
«медленным» метаболизмом отсутствуют функциональные аллели, у
«распространенных» 1


2 аллели, у «быстрых» более 2 аллелей. На сегодняшний
день существуют различные фармакогенетические тесты для определения
генотипа пациента.
Методы ген
отипирования получили широкое применение,
поскольку были определены гены, кодирующие последовательность аминокислот
основных изоферментов печени.
В соответствии с этой концепцией, врачи могли
выбрать среди вариантов лечения
ЛС

и дозировки с наибольшей эффе
ктивностью
и наименьшими побочными эффектами для пациента, которые основываются на
его или ее генетическом профиле

[
12
]
.

Однако текущий функциональный статус
пациента (т.е. фенотип)
может быть более

значимым, чем его/ее генотип
. Таким
образом, применение персонализированной медицины требует понимания и
рассмотрения вовлечения соответствующих негенетических факторов (включая
окружающую среду и персональную изменчивость) в дополнение к генетическим
факторам.

В настоящее время, исс
ледователи все чаще отмечают такое явление, как
модификационная (фенотипическая) изменчивость. При модификационной
23


изменчивости происходит изменение клинического ответа на ЛС под действием
факторов окружающей среды, либо при сопутствующем приеме ЛС, которы
е
являются субстратами (и/или ингибиторами, индукторами) соответствующих
изоферментов
[
9
]
. Генотип при этом не меняется.

Крупномасштабное исследование по оценке модификационной изменчивости
с выборкой из 900 пациентов, которых

лечили от депрессии, провели
Sheldon

H
.
Preskorn

и его коллеги

[
31
]
. На первом этапе исследования по результатам тестов
генотипирования, пациенты были классифицированы на генотипы
«
медленных
»
метаболизаторов (
35/900 или 3,9%)
и
«
не медленных
»
(т.е.
«
распространенных
»,
«
быстрых
»
и

«
ультрабыстрых
»)
метаболизаторов (865/900 или 96,1%). На втором
этапе, после определения фенотипа пациентов, было получено, что к
«
медленным
»
метаболизаторам относится 243/900 или 27% пациентов, а к
«
н
е
медленным
» 657/900
или 73%. Таким образом, модификационная изменчивость до
фенотипа
«
медленного
»
метаболизатора наблюдалась у 23% пациентов,
обладающих генотипом
«
не медленного
»
метаболизатора.
Эти результаты
показывают, что

методы генотипирования
в клин
ической практике

значительно
недооценивают активность

метаболизма у пациентов
,

которым назначают
несколько препаратов. Они подчеркивают важное ограничение генотипирования:
генотипирование устанавливает

генетический потенциал индивида, но не
обязательно фун
кциональные возможности в любой момент времени.

Индивидуальная активность изоферментов при отсутствии ингибиторов или
индукторов стабильна в течение жизни. Но активность изоферментов постоянно
меняется под действием различных факторов, таких как ЛС (киниди
н,
рифампицин, оральные контрацептивы), а также алкоголь, курение, инфекции,
еда. Таким образом, для определения точной картины ферментной активности и
для подбора адекватной дозы ЛС нужно оценивать текущую активность
изофермента цитохрома. Такую оценку да
ют методы фенотипирования, которые
основаны на определении концентрации субстратов и их метаболитов.

24


В качестве примера возможно разобрать две широко используемые
фармакологичнские группы:

1.2.1. β
-
блокаторы как субстрат
CYP

2
D
6

β
-
блокаторы

назначаются при

лечении таких сердечно
-
сосудистых
заболеваний, как артериальная гипертензия, ишемическая болезнь сердца и
сердечная недостаточность. Поскольку данная группа ЛП обладает серьезными
НЛР, следует точно подбирать дозу. К сожалению, вследствие назначения
непра
вильной дозы ЛС (например, метопролола, бисопролола), часто происходит
интоксикация с серьезными последствиями для организма пациента. Поскольку
большинство β
-
блокаторов биотрансформируются под действием CYP

2
D
6
,
необходимо учитывать возможные изменения ег
о активности.

Среди всех β
-
блокаторов, метопролол проявляет большее сродство к CYP

2
D
6

(около 70


80 % метаболизма)

[
79
,
62
]
. У пациентов, которые регулярно
принимают метопролол, наблюдается различ
ная концентрация ЛС в плазме крови

[
87
,
71
]
. После определения генотипов, было обнаружено, что концентрация ЛС у
носителей гетерозиготной аллели CYP

2
D
6
*10

(изофермент активен наполовину)
значитель
но выше, чем у носителя гомозиготы с полной функциональностью.
Антигипертонический эффект метопролола не коррелирует с концентрацией в
плазме крови, но снижение частоты сердечных сокращений связано с
концентрацией
[
23
,
94
]
. У «медленных» метаболизаторов чаще возникает
брадикардия по сравнению с «экстенсивными» метаболизаторами
[
46
]
. Таким
образом, определение активности изофермента CYP

2
D
6

методами
генотипирования или фенотипирования до начала терапи
и метопрололом может
улучшить эффективность препарата и снизить частоту НЛР.

Бисопролол в меньшей степени метаболизируется изоферментом CYP

2
D
6
,
так как в его метаболизме еще участвует
CYP
3
A
4
, а также около 50

%
бисопролола выводится почками, не подвергаяс
ь биотрансформации

[
47,
34
]
.
Изменение концентрации бисопролола в плазме крови слабо коррелирует с
активностью CYP

2
D
6
. Однако есть случаи увеличения концентрации
25


бисопролола у носителей аллели CYP

2
D
6
*10
, при этом усиливался т
акой
побочный эффект как брадикардия

[
87
,
71
]
. При экспертизе клинического случая,
в котором при неправильно назначенной дозе (10 мг вместо 1,35 мг) бисопролола
от брадикардии погибла пациентка, был
о обнаружено, что концентрация
бисопролола в плазме крови была более чем в 3 раза выше от теоритически
возможной
[
50
]
. Поскольку у пациентки не было заболеваний почек,
максимальная концентрация бисопролола после приема 2 таблет
ок по 5 мг в
плазме крови должна была составить около 50

нг/мл. Но по экспериментальным
данным концентрация составила 176

нг/мл. Затем, после проведения
генотипирования было выявлено, что пациентка была носителем аллели

CYP

2
D
6
*10
, что и привело к усилению

побочного эффекта (брадикардии), который
привел к летальному исходу.

1.2.2. Метаболизм антипсихотических ЛС с участием
CYP

2
D
6

Концентрация ЛС, которые оказывают антипсихотическое действие, может
меняться в зависимости от активности изофермента CYP

2
D
6
, а

также некоторые
из них могут оказывать ингибирующее действие на метаболизм. Такими
антипсихотическими препаратами являются хлорпромазин, галоперидол и
тиоридазин. В нескольких исследованиях было показано, что у пациентов
принимавших хлорпромазин наблюдало
сь снижение активности изофермента
CYP

2
D
6
.
Также галоперидол, который широко применяется в клинической
практике, ингибирует CYP

2
D
6

во время терапии. Было показано, что
концентрация дебризокина, по которому определяли активность CYP

2
D
6
,
коррелирует с доз
ой галоперидола. Тиоридазин оказывает сильное ингибирующее
действие на CYP

2
D
6
.

Рассмотренные препараты при назначении в комбинации с
препаратами, которые являются субстами CYP

2
D
6
, усиливают их действие, что
может привести к проявлению НЛР.
[
39
]

К ЛС субстратам CYP

2
D
6

относятся клозапин и рисперидон
.
Роль CYP

2
D
6

в метаболизме клозапина спорна, но при одновременном назначением
параксантина (ингибитора CYP

2
D
6
), средние значения концентраций клозапина
26


и норклозапина значительно

увеличивались, что указывает на значимую роль
изофермента CYP

2
D
6

в биотрансформации клозапина.

У пациентов,
находящихся на монотерапии рисперидоном, было отмечено изменение
концентрации рисперидона и отношения рисперидон/9
-
гидроксирисперидон,
связанное с

различиями в генотипах CYP

2
D
6
. Также концентрация рисперидона
повышалась после приема ингибирота CYP

2
D
6
.

[
39
]


1.2.3.
Влияние заболеваний печени на активность
CYP

2
D
6

Биотрансформация как экзогенных, так и эндогенных веществ

в организме в
значительной степени осуществляется печенью. Результаты исследований о
влиянии заболеваний печени с различной тяжестью на активность изофермента
CYP

2
D
6

не однозначны.

При исследовании пациентов с различной тяжестью заболеваний печени по
ср
авнению с контрольной группой снижение активности
CYP

2
D
6

было около 47
%, при этом очень сильное снижение активности наблюдали у пациентов с
умеренно
-
тяжелыми заболеваниями печени. Активность изофермента
CYP

2
D
6

при средней тяжести заболеваний печени не о
тличалась от контрольной группы.
При компенсированном заболевании печени активность
CYP

2
D
6

была такой же,
как у контрольной группы, а при деко
м
пенсированном


сравнима с умеренно
-
тяжелыми заболеваниями печени. Несмотря на то, что среднее снижение
активнос
ти во всех группах достигает 47 %, у «медленных» метаболизаторов
активность еще ниже.
[
43
]

В другом исследовании активность
CYP

2
D
6

у всех пациентов в среднем и по
отдельности по группам не отличалась от контрольной группы. По р
езультатам
был сделан вывод, что активность не изменилась за счет изофермента
CYP

2
D
6
,
который локализуется вне печени.
[
20
]

Такие результаты

двух исследований

могут быть связаны с неоднородность
выборки контрольной и испытуемых

групп по генотипу. Если в группах будет
разное соотношение «быстрых», «медленных» и «умеренных» метаболизаторов,
то результаты могут получиться либо завышенными, либо заниженными.


27


1.
3.
Ме
тоды

определения

активности CYP

2
D
6

(фенотипирование)

Субстратная с
пецифичность определенных ферментов метаболизма ЛС
позволила разработать методы их фенотипирования. Активность того или иного
фермента метаболизма определяется по фармакокинетике его специфического
субстрата, называемого «маркерным» субстратом, путем измер
ения его
концентрации и концентрации его метаболита в плазме крови или в моче. На
основании этих данных рассчитывается так называемый метаболический индекс
или метаболическое отношение, равный отношению концентрации метаболита
ЛС к концентрации нативного с
оединения [
11
]. При этом возможны следующие
варианты:



Высокие значения концентрации «маркерного» субстрата и низкие значения
концентрации его метаболита в плазме крови и, соответственно, низкий
метаболический индекс, говорят о
снижении активности фермента
метаболизма.



Низкие значения концентрации «маркерного» субстрата и высокие значения
концентрации его метаболита в плазме крови, и. соответственно, высокий
метаболический индекс, говорят о повышении активности фермента
метаболиз
ма.



Низкие значения концентрации «маркерного» субстрата и низкие значения
концентрации его метаболита в плазме крови говорят о нарушении
всасывания ЛС, «метаболический» индекс при этом не меняется
[
11
].

С фенотипирования начина
ется изучение метаболизма ЛС в клинике.
М
ноголетние наблюдения за концентрациями большого количества ЛС в плазме
крови (проведение терапевтического лекарственного мониторинга, исследования
биоэквивалентности ЛС, определение биодоступности ЛС и др.) показал
и, что для
значений фармакокинетических параметров
JIC

характерен не только большой
межиндивидуальный разброс, но и часто значительный внутрииндивидуальный
разброс. Определение концентрации метаболитов ЛС наряду с самим ЛС
28


показало, что этот разброс в осно
вном связан с различиями в скорости
метаболизма [
14
].

Фенотипирование

показало свою важность в различных клинических
ситуациях. Так, например, изучение концентрации метаболита лидокаина после
внутривенного введения позволило со
здать тест для оценки функции печени
(
MEGX
-
тест).

Изучение динамики концентрации ЛС одновременно с их
метаболитами позволяет определить, связано ли значительное отклонение
концентрации ЛС в крови у пациента (от средних терапевтических значений) с
изменения
ми на стадии всасывания лекарственного препарата или на стадии его
метаболизма. В хронофармакологии изучение концентрации метаболитов ЛС
позволяет ответить на вопрос, в какой степени изменение фармакологического
эффекта после приема ЛС в различное время су
ток связано с изменением
активности ферментов или функциональной активности органов и систем [
14
,
17
,
66
,
91
].

Фенотипирование ферментов мет
аболизма в США стало инструментом
экспертизы новых ЛС на предмет их возможного фармакокинетического
взаимодействия с другими ЛС на уровне метаболизма. Так, уже созданы и
функционируют рекомендации
FDA

по изучению влияния новых ЛС на
активность ферментов ме
таболизма
in

vitro

и
in

vivo

[
66
,
91
].

В зависимости от субстрата методы определения активности изоферментов
можно разделить на две группы: инвазивные и неинвазивные.

В инвазивных методах ЛС, являю
щееся маркерным
субстратом, вводится
перорально или внутривенно

далее через определенное время в крови или
сыворотке определяют концентрацию метаболита маркерного субстрата, а в
некоторых случаях


и самого ЛС.

Инвазивные методы определения активности изоф
ермента имеют ряд
неизбежных выраженных недостатков. В качестве примеров можно привести
необходимость внутривенного введения препаратов, применение которых
сопряжено с риском развития НЛР, прежде всего


аллергических реакций и
29


аритмогенных эффектов; необх
одимость, как минимум, двукратного забора крови
из вены; тестирование может проводиться только в условиях лечебно
-
профилактического учреждения. В некоторых случаях методы могут обладать
недостаточной специфичностью. Например, в настоящее время известно, чт
о
MEGX может образовываться из лидокаина под влиянием не только CYP

3A4, но
и в незначительных количествах CYP

1A2, а значит, данный тест отражает
суммарную активность этих 2 изоферментов цитохрома Р450.

Метаболический индекс субстрата к его метаболиту рас
считывается после
количественного определения обоих соединения при помощи соответствующего
аналитического метода, такого как, высокоэффективной жидкостной
хроматографии

(
HPLC
)

или жидкостной хроматографии с тандемным масс
-
спектрометром (
LC

MS
/
MS
)
.

Для опр
еделения активности изофермента CYP

2
D
6

определяется
метаболический индекс специфичных веществ, в метаболизме которых не
участвуют другие изоферменты. На сегодняшний день разработаны методики
количественного определения ЛС дебризохина, спартеина, трамадола
,
метопролола и декстрометорфана методом ВЭЖХ с УФ детектором (таблица

3).

Субстрат

Метаболит

Доза
, мг

Биообъект

Статус ЛС в РФ

Исследования

Дебризохин

4
-
гидрокси
-
дебризохин

10

Моча

Не
зарегистрировано

[
25
,
32
,
33
,
38
,
44
,
85
]

Спартеин

2
-
дегидро
-
спартеин,


5
-
дегидро
-
спартеин

100

Моча

Не
зарегистрировано

[
25
,
45
,
76
,
81
,
85
]

Трамадол

моно
-
О
-
дезметил
-
трамадол
(М1)

50

Моча

Зарегистрировано

[
76
,
77
,
86
]

Метопролол

α
-
гидрокси
-
метопролол

100

Кровь

Зарегистрировано

[
25
,
27
,
57
,
60
,
74
,
85
]

Декстро
-
меторфан

декстрофан

30

Кровь,
моча,
слюна

Зарегистрировано
в комбинации с
другими ЛС

[
25
,
60
,
85
,
88
,
69
]

Таблица 3

-

Сводная таблица основных методов фенотипирования
CYP

2
D
6
.

30


1.3.1. Количественное опре
деление дебризохина и спартеина

Дебризохин и спартеин были первыми субстратами, с помощью которы
х
стало возможным оценить большие различия в окислительном полиморфизме
CYP

2
D
6

[
38
]
. Дебризохин применялся для лечения повышенного кровяного
давления, а спартеин как антиаритмическое средство. Эти соединения
используются для ф
енотипирования с 1970
-
х годов, и их метаболические индексы
показали высокую степень корреляции. Метаболитом дебризохина является 4
-
гидроксидебризохин, который количественно определяется в моче. Оптимальная
средняя доза, которая применяется для фенотипиров
ания, составляет 10 мг.
Преимуществом применения дебризохина является высокое значение
pK
a

и
полярность, благодаря которым
pH

мочи сильно не влияет на метаболический
индекс. Недостаток заключается в том, что в биотрансформации дебризохина
участвует не толь
ко CYP

2
D
6
, но и
CYP

1
A
1

[
44
]
. Тем не менее,
CYP

1
A
1

обеспечивает не более 2 % метаболизма дебризохина. Также, весомым
недостатком являемся снижение артериального давления при использовании
дебризохина. Еще стоит отметить, что
на территории Российской Федерации ЛС
дебризохин не зарегистрирован.

Метаболит спартеина 2
-
дегидроспартеин и 5
-
дегидроспартеин также
обнаруживается в моче. Под действием CYP

2
D
6

спартеин биотрансформируется
до неустоучивого
N
1
-
оксида, который в дальнейшем
распадается на 2
-

и 5
-
дегидроспартеин. Доза в 100 мг при фенотипировании соответствует только 10 %
от рекомендованной для антиаритмической терапии, так что никакого
фармакологического эффекта не наблюдается

[
81
]
. Также нет огра
ничений для
применения спартеина у пациентов с почечной

недостаточностью, так как не
образуются глюкуроновые формы и «метаболический» индекс
спартеин/дегидроспартеин остается неизменным с низкой почечной функцией.
При проведении фенотипирования с применени
ем спартеина могут возникнуть
НЛР в виде аллергии. Данное ЛС также не зарегистрировано на территории РФ.


31


1.3.2. Колич
ественное определение трамадола

Анальгетическое действие трамадола главным образом обусловлено его
метаболитом М1, у которого сродство к
µ
-
рецептору в 200 раз выше, чем у самого
препарата. Известно, что М1 образуется благодаря изоферменту CYP

2
D
6

[
76
]
.
Например, при применении трамадола с пароксантином (ингибитор CYP

2
D
6
)
наблюдается уменьшение анальгетического
действия, так как активность
изофермента снижена

[
77
]
.

При изучении фармакокинетики трамадола путем сравнения метаболических
индексов трамадола/М1 к декстрометорфану/декстрорфану наблюдалась слабая
корреляция. В дальнейшем иссл
едовании было обнаружено, что в метаболизме
трамадола помимо изофермента CYP

2
D
6
, также участвуют
CYP
2
B
6

и
CYP
2
C
19
,
и для достижения хороших результатов увеличивают дозу, что приводит к более
частому проявлению НЛР. Трамадол относится к наркотическим ЛС, ч
то также
затрудняет применение его в анализах. Таким образом, применение трамадола в
фенотипировании ограничено.

1.3.3. Количес
твенное определение метопролола

Основными путями метаболизма метапролола являются О
-
деметилирование,
α
-
гидроксилирование и
N
-
деал
килирование. Для фенотипирования CYP

2
D
6

достаточно 100 мг, около 70
-
80 % метаболизма приходятся на α
-
гидроксилирование и небольшой процент на О
-
деметилирование

[
57
]
.
Различными исследованиями доказано, что α
-
гидроксилирование
происходит
только за счет CYP

2
D
6
, в то время как в О
-
деметилировании могут участвовать
и другие изоферменты.

При определении в моче отношения метопролола к α
-
гидроксиметопрололу
наблюдается корреляция между
pH

и метаболическим индексом

[
27
]
. Таким
образом, фенотипирование с метопрололом в моче неубедительно.

Следующее исследование, в котором после приема дексторметорфана (22 мг)
или метапролола (100 мг) с дальнейшим отбором крови в течение 8 часов,
32


показало хорошую корреляцию
между индексом метопролол/α
-
гидроксиметопролол и декстрометорфан/декстрофан.

В целях фенотипирования метопролол может применяться только при
определении в плазме крови. Также недостатком этого метода является то, что
метопролол снижает давление.

1.3.4. Кол
ичественн
ое определение декстрометорфана

Декстрометорфан является антагонистом опиоидных рецепторов,
применяется в качестве противокашлевого и обезболивающего препарата.
Благодаря своей безопасности, средним НЛР, декстрометорфан хорошо изучен в
качестве м
аркера для определения активности CYP 2D6. К сожалению, в
государственном реестре лекарственных средств РФ декстрометорфан
представлен только в комбинации с другими ЛС, следовательно, в нашей стране
дексрометорфан недоступен.

Декстрометорфан преимущественн
о метаболизируется при участии
цитохрома

CYP 2D6 в декстрофан путём О
-
деметилирования

[
69
]
.
Другие
изоферменты, такие как CYP

3А4,

CYP

3А5, CYP

3А7, CYP

2С9, CYP

2С19,
катализируют превращение декстрометорфана внеактивный 3
-
мет
оксиморфинан.
Декстрофан и 3
-
метоксиморфинан деметилируются в

гидроксиморфинан. Все
образующиеся метаболиты экскретируются с мочой, в основном ввиде
глюкуронидов
[
25
,
85
].

На сегодняшний день разраб
отано много методик по определению
активности, используя в качестве маркерного субстрата декстрометорфан, при
этом в качестве пробы можно отбирать различные биологические жидкости:
мочу, кровь и слюну. Такие методики имеют множество достоинств по сравнению

с рассмотренными выше, но поскольку методики инвазивные, могут развиться
НЛР, а также стоит учитывать индивидуальную непереносимость ЛС. Учитывая,
что на территории РФ декстрометорфан представлен только в виде комбинаций с
другими лекарственными средствам
и, его не получится применить для
фенотипирования изофермента CYP

2
D
6
.

33


1.4. Определение активности СУР2D6 по отношению пинолин/6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин

Для фенотипирования изофермента
CYP

2
D
6

были разработаны и
валидированы различные методи
ки. Оригинальные тесты с дебризохином и
спартеином постепенно заменились клинически более надежными тестами с
декстромет
орфаном и метопрололом
. Затем соперничество между методами
фенотипирования отошло на второй план, так как стали быстро внедряться
методы

генотипирования, основанные на ДНК. Несмотря на развитие ПЦР за
последние десять лет, остается проблема прогнозирования фенотипа
CYP

2
D
6

из
методов генотипиро
вания, основанных на ДНК. С
овременные методы
фенотипирования по определению экзогенных
«
маркеров
»
могут приводить к
развитию НЛР.

Также нужно учитывать, что на территории РФ из всех возможных
субстратов зарегистрированы только 2 ЛС: трамадол и метопролол.

Возможно, что
поиск эндогенных субстратов для
CYP

2
D
6

будет интересен не только для
расширения з
наний о работе изоферментов цитохрома, но и обретет и
практическое значение для новой методики фенотипирования, которой не будут
присущи недостатки ранее разработанных методик

[
15
,
16
]
.

1.4.1 Скрини
нг эндогенных субстратов
CYP

2
D
6

Проводится много исследований по поиску эндогенных веществ, которые
метаболизируются только одним изоферментом. Широкое исследование провел
Ai
-
Ming
Yu

с коллегами по поиску эндогенных веществ, специфичных изоферменту
CYP

2
D
6
. В своем исследовании ученые рассмотрели ряд эндогенных веществ
потенциально являющиеся специфическими субстратами для
CYP

2
D
6
. Было
установлено, что изофермент
CYP

2
D
6

не значительно метаболизирует
эндогенные фенилэтиламины

(2
-
фенилэтиламин, октопамин, с
инефрин,
метанефрин и норметанефрин), индолэтиламины (триптамин, серотонин, 6
-
метокситриптамин и мелатонин) и
β
-
карболины (гарман, норгарман и триптолин).
Однако, индолметиламин 5
-
метокси
-
N
,
N
-
диметилтриптамин

и пинолин (6
-
метокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карбо
лин) показали относительно высокое сродство
34


Пин
олин

6
-
гидрокси
-
1, 2, 3, 4,
-

тетрагидро
-
β
-
карболин

CYP

2
D6

к
CYP

2
D
6

и О
-
деметилировались только под действием
CYP

2
D
6
. При
добавлении к исходным

веществам моноклональных антител против
CYP

2
D
6
, О
-
деметилирование 5
-
метокси
-
N
,
N
-
диметилтриптамина

и пинолина не наблюдалось.

Специфичность пинолина по отношению к
CYP

2
D
6

составляет около
99

%
относительно других изоферментов цитохрома Р
450
.

Пинолин подвергается О
-
деметилированию с образованием метаболита 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина

(
рис. 3
)
.






Рисунок 3

-

Метаболизм пинолина посредством изофермента CYP

2
D
6
.

1.4.2.
Физические, химические и б
иохимические свойства пинолина

Химическое название пинолина


6
-
метокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин.
Молекулярная масса составляет 202,26 г/моль. Температура плавлени
я от 216 до
224
°C
. Соединение проявляет основные свойства, значение рКа составляет 9,04.
Коэффициент липофильности
LogP

= 1,25.

Умеренно растворим в воде (1 : 35).

П
инолин (от лат.
pineale

-

шишковидный) является эндогенным
соединением и находится в мозгу

млекопитающих и других тканях (например,
сетчатка) с широким диапазоно
м концентраций от 2 нг/г до 21

мк
г/г [
11
,
75
].
Также пинолин встречается растениях, например, среди β
-
карболинов в составе
Pega
num

harmala

[
78
]. По химической структуре пинолин относится к 1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболинам с метоксильным заместителем в положении 6 (рис.
4
).

35



Рисунок 4
. Химическая структура пинолина.

Как и весь класс β
-
карболинов, пинол
ин привлекает пристальное внимание
исследователей, поскольку он участвует в разнообразных биохимических
реакциях, которые могут найти практической применение в медицине и
фармацевтике. Пинолин является метаболитом мелатонина, и оба вещества
проявляют схожи
е свойства, поскольку в их структуре лежит индольное ядро. По
данным исследования [
75
] пинолин наряду с мелатонином нейтрализует
свободные радикалы и тем самым, препятствует развитию окислительного
стресса. Головной мозг содерж
ит большое количество полиненасыщенных
жирных кислот, которые легко подвергаются свободнорадикальному окислению.
Мелатонин и пинолин защищают ткани мозга от свободных радикалов и
участвуют в поддержании баланса между появлением свободных радикалов и
защитн
ой системой.

Было показано [
75
], что пинолин ингибирует моноаминаксидазу А и
обратный захват серотонина. Подобно антидепрессантам, пинолин может
увеличивать количество
серотониновых

рецепторов и проявлять
фармакологические эфф
екты серотонинэргических
ЛС
. Из исследования по
сравнению пинолина, имипрамина гидрохлорида и амитриптилина в
поведенческих тестах на крысах [
75
] был сделан вывод, что действие пинолина
схоже с препаратами сравнения и в дальней
шем это вещество может
рассматриваться как потенциальный антидепрессант.

Хорошо известно, что некоторые имидазолиновые соединения могут
стимулировать выработку инсулина посредством активации
I
3
имидазолиновых
36


рецепторов β
-
клеток поджелудочной железы. Основ
ываясь на данных, что
производные β
-
карболина активируют рецепторы
I
1

и
I
2

в мозгу,
J
.
Cooper

с
коллегами [
30
] проверили гипотезу, что гарман и пинолин могут связываться с
рецепторами
I
3
поджелудочной железы. По данным исследов
ания гарман и
пинолин повышают секрецию инсулина. С повышением доз было замечено и
повышение секреции инсулина, то есть эффект является дозозависимым. Таким
образом, производные β
-
карболина, в том числе и пинолин, могут
рассматриваться в качестве препарато
в, повышающих секрецию инсулина.

1.4.3.
Существующие методики определения пинолина

1.4.3.1. Определение
ex

vivo

Как сообщалось ранее, эндогенное вещество пинолин подвергается О
-
деметилированию микросомами печени и его биотрансформация
преимущественно катал
изируется изоферментом цитохрома Р450 CYP

2
D
6
.
Исследователи отделения фармацевтических наук университета в Баффало
(США) изучили, как влияет статус изофермента CYP 2D6 на О
-
деметилирование
пинолина и оценили, может ли пинолин применяться для определения а
ктивности
CYP 2D6. Также исследовали функциональные различия между аллельными
изоформами CYP 2D6.1, CYP 2D6.2, CYP 2D6.10. Затем проводились
исследование кинетики, ингибирования и корреляции для определения роли CYP
2D6 в биотрансформации пинолина.

Инкуба
ция аллельных изоформ CYP 2D6 и человеческих печеночных
микросом проводилась в 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4, 37
о
С

[
51
,
42
]
.
В среду
вносили микросомальные протеины в концентрации 0,25 мг/мл, 0,2
µМ Р450
редуктазу и 10 мкг
L
-
α
-
дилаурилфосфатидилхолин. Активация реакции
производилась при добавлении никотинамида аденин динуклеотид фосфата.
Кинетика определялась по добавлению пинолина в концентрации от 0,2 до 20

µМ
для изоформ и от 0,05 до 100 µМ для
человеческих печеночных микросом. Время
инкубации составило 5 минут для CYP 2D6.1 и CYP 2D6.2, 15 минут для CYP
37


2D6.10 и 10 минут для человеческих печеночных микросом. В качестве
ингибитора использовали кинидин в концентрации 1

µМ.

Количественное определе
ние

проводили методом ВЭЖХ.
Хроматографические условия были следующие:

Хроматограф
Agilent

1100
series

Колонка
Zorbax

фенил, 5 мкм, 250 мм Х 4,6 мм

Подвижная фаза 50 мМ аммоний фосфатный буфер (рН = 3) : ацетонитрил
(95/5 об/об)

Детектор ДМД (214, 254, 280

нм)

Температура колонки 40
о
С

Исследования показали, что аллельная изоформа CYP 2D6.10 (изоформа со
сниженной функцией) не активна по отношению к пинолину. В то время, как под
действием CYP 2D6.1 и CYP 2D6.2 (изоформы с нормальной функцией)
происходило о
бразование 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин
а. По
сравнению с CYP 2D6.1, у изоформы CYP 2D6.2 каталитическая активность ниже.
Затем, при добавлении ингибитора CYP

2D6 хинидина наблюдали полную
блокировку О
-
деметилирования пинолина, что указывает на
селективность
изофермента к субстрату.

1.4.3.1. Определение
in

vivo

Дальнейшее исследование
in

vivo

на мышах проводилось с целью
подтверждения результатов
ex

vivo

и, чтобы сравнить активность изофермента
CYP 2D6 у мышей дикого типа и
Tg
-
CYP

2
D
6
.

Для анализ
а были выбраны взрослые мыши (7 недель) дикого типа и
Tg
-
CYP

2
D
6
, средний вес 22


25 г. Пинолин вводился интраперитонеально в дозе
около 750 мкг. В качестве пробы отбиралась моча через 24 ч после введения
пинолина.

38


Количественное определение проводилось м
етодом
LC
-
MS
/
MS
.
Хроматографические условия были следующие:

Хроматограф
Shimadzu

prominence

HPLC

system

Детектор

API

3000

turbo ionspray ionization triple
-
quadrupole mass

Колонка
Luna

фенил
-
гексил (50 Х 4,6 мм, 3 мкм)

Подвижная фаза буфер А (в
одный раствор муравьиной кислоты 0,02 %)
буфер В (метанольный раствор муравьной кислоты 0,02%). Хроматографирование
проходило в градиентном режиме с повышением соотношения буфера В от 5 до
80 % до 9 минуты, затем устанавливался изократический режим на 2 ми
нуты
(буфер В 80 %) и с 11,5 до 15 минуты концентрация буфера В устанавливалась на
5 %.

Скорость потока 0,3 мл/мин.

Анализ подтвердил результаты
ex

vivo

испытания. По результатам был
сделан вывод, что у мышей О
-
деметилирование проходит под действием CYP
2D
6
.

Около 99 % метаболита пинолина выводится из организма с мочой,
следовательно, в качестве пробы можно использовать этот биообъект
.

У мышей
дикого типа активность CYP 2D6 была выше, чем у
Tg
-
CYP

2
D
6
.



Подтип генотипа

Активность
изофермента

Ex vivo

Чело
веческие
печеночные микросомы

«распространенные»
метаболизаторы

Средняя

Аллельные изоформы:

CYP

2
D
6.1

CYP

2
D
6.2

CYP 2D6.10



«распространенные»
метаболизаторы

«медленные»
метаболизаторы


Средняя

Ниже среднего

Нет

39


In vivo

Мыши дикого типа


Мыши
Tg
-
CYP 2
D
6

«распространенные»
метаболизаторы

«медленные»
метаболизаторы

Средняя


Низкая

Таблица 4

-

Сводная таблица существующих метолов количественного
определение пинолина
ex

vivo

и
in

vivo

[
51
]

Логичным продолжением рассмотренного и
сследования будет изучение по
определению эндогенного пинолина в моче у человека для оценки активности
изофермента цитохрома Р450 CYP 2D6. У такой методики определения
активности CYP 2D6 не будет недостатков, присущих методикам с применением
экзогенных вещ
еств, которые могут оказывать гипотензивное, антиаритмическое
действия, а также могут вызывать аллергические реакции.

1.
5.
Метод ВЭЖХ
-
МС/МС

Высокоэффективная жидкостная хроматография


метод колоночной
хроматографии, в котором жидкая подвижная фаза под выс
оким давлением
подается в колонку, заполненную сорбентом (неподвижной фазой)
[
10
]
. Метод
ВЭЖХ широко применяется в фармакопейном анализе для качественного и
количественного анализа. В биоаналитических методиках ВЭЖХ также успеш
но
используется как при анализе ЛС и метаболитов, ксенобиотиков, так и
эндогенных веществ

[
18
]
.

В качестве детекторов в зависимости от требуемой чувствительности и
селективности применяются спектрофотометрические, флуориметриче
ские,
рефрактометрические, кондуктометрические, масс
-
спектрометрические
детекторы и т. д
. [
13
]
. Поскольку в биоаналитических методиках требуется
высокая селективность и чувствительность, зачастую в качестве детектора
выбирают м
асс
-
спектрометрический детектор.

Масс
-
спектрометрия
-

это физический метод измерения отношения массы
заряженных

частиц материи (ионов) к их заряду.

Существенное от
личие масс
-
40


спектрометрии от дру
гих аналитических физико
-
химических методов состоит в

том, что

оптические, рентгенов
ские и некоторые другие методы детектируют
излучение или поглощение энергии молекулами или атомами, а масс
-
спектрометрия имеет дело с самими частицами вещества.

Масс
-
спектрометрия
измеряет
соотношение массы к заряду. Для этого

использ
уются законы движения
заряженных частиц ма
терии в магнитном или электриче
ском поле.
[
13
]

Для того,

ч
тобы ионизовать органическое ве
щество его нужно сн
ачала из
конденсированной фазы
перевести

в газовую
. Затем
,

молекулы подвер
гаю
тся
бомбардировке пучком электронов с образованием положительно заряженных
ионов
.
Также существуют и другие методы ионизации.

На следующем этапе происходит сортировка ионов по отношению массы к
заряду (
m
/
z
)

в масс
-
анализаторе. Поскольку в разработанной мет
одике
применялся тандемный масс
-
спектрометрический детектор с тройным
квадруполем, то более подробно будет рассмотрен масс
-
анализатор квадруполь со
сравнением с тройным квадруполем.

Квадруполь представляет собой 4 стержня, к которым попарно в
противоположн
ой полярности подается определенная комбинация постояного и
радиочастотного переменного напряжения

[
21
]
. Ионы, влетающие в анализатор
через отверстие (1) попадают в гиперболическое поле, в котором в зависимости от
отношения
m
/
z

происходит отсеивание некоторых ионов (3), оставшиеся ионы
вылетают через отверстие (2) (рис. 5)


Детектор

ионов

41


Рисунок 5

-

Масс
-
анализатор квадруполь.

Тандемный масс
-
спектрометр (тройной квадруполь) состоит из двух
квадруполей, соединенных октопольной реакционной яч
ейкой. В первый
квадруполь попадают ионизированные молекулы, и происходит отсеивание части
ионов, затем в октопольной реакционной ячейке проводится повторная ионизация
и полученные молекулы попадают во второй квадрупол
ь, где снова отсеивается
часть ионов. Оставшиеся ионизированные молекулы попадают в детектор. На
рисунке 6 приведено сравнение проведения анализа на квадруполе и на тройном
квадруполе

[
21
]
.


Рисунок 6
-

Проведение анализа на к
вадруполе и тройном квадруполе.








42


ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ (СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Оборудование и материалы

2.1.1.

Материалы

2.1.1.1. Стандарты определяемых веществ



стандартный образец пинолина (
Sigma
-
Aldrich

кат. №
371858
)
;



стандартный образец 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина (
Aurora

Fine

Chemicals

кат. № А06.795.158)
;



стандартный образец галантамина гидробромида

(
Sigma
-
Aldrich

кат.


Y
0001279)
.

2.1.1.2. Биологическая матрица

Биологическая матрица для приготовления
калибровочных образцов и
образцов контроля ка
чества


плазма крови человека

и моча
.

2.1.1.3. Реактивы



ацетонитрил
(
supergradient
,
Scharlau
,
Испания)
;



спирт метиловый
(
extra

pure
,
Scharlau
,
Испания)
;



муравьиная кислота

(for LC
-
MS, Merck Millipore, США);



амм
ония формиат (
for LC
-
MS, Merck Millipore, США)
;



этилацетат

(extra pure, Scharlau, Испания);



деионизированная вода
, электрическое сопротивление 18,2 Мом*см,
Millipore simplicity UV (Merck
-
Millipore, США);



триэтиламин

(reagent grade, Scharlau,
Испания
);



натр
ия

тетраборат

(extra pure, Scharlau,
Испания
);



борная

кислота

(extra pure, Scharlau,
Испания
).

2.1.2.

Оборудование



жидкостной хроматограф
Agilent

1290

Infinity

оснащенный градиентным
насос
ом, дегазатором, автосамплером
,
трехквадрупольным

масс
-
селективным детектор
ом

Agilent

6460
, США
;

43




предколонка
Agilent

Zorbax

Eclipce

Plus

C
18

12,5
x

2,1 мм, 5 мкм (кат. №
821125
-
936
)



колонка
Agilent

Zorbax

Eclipce

Plus

C
18
RRHD

100
x

2,1 мм, 1,8 мкм (кат. №
959758
-
902K
)



картридж Chromabond® С18 для ТФЭ,
США



весы аналитические ES 2
25 SMDR, Швейцария;



рН
-
метр

Seven

Multi
,

Toledo
,
Швейцария
;



центрифуга Eppendorf 5415D, Германия;



встряхиватель типа вортекс ELMI, Латвия;



концентратор

Eppendorf Concentrator plus,
Германия
;



дозаторы переменного объема Eppendorf 10


100 мкл и 100


1000 мкл,
Германия;



холодильник Indesit, SD 125, Россия;



морозильник для плазмы Sanyo, Япония;



система водоподготовки Micropure, ThermoScientific, США.

2.2.

Разработанная методика

Хроматограф:

Agilent

1290

Infinity
;

Предколонка:

Agilent

Zorbax

Eclipce

P
lus

C
18

12,5
x

2,1 мм, 5 мкм (кат. №

821125
-
936
)
;

Колонка:

Agilent

Zorbax

Eclipce

Plus

C
18
RRHD

100
x

2,1 мм, 1,8 мкм (кат.


959758
-
902K
)
;

Температура колонки:

(50 ± 1) ºС
;

Скорость потока:

0,4 мл/мин
;

Детектирование:

МС/МС,
MRM
-
переходы для пинолина 203,
2
m
/
z

→ 174,0
m
/
z
,
для 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина 189,2
m
/
z

→ 160,0
m
/
z
, для
галантамина 288,3
m
/
z

→ 213,0
m
/
z
;

Метод ионизации:

электроспрей (
ESI
) в положительной полярности
;

Объем пробы:

5 мкл
.

Ориентировочные времена удерживания

в плазме
крови
:

44




6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин


около 1,1 мин
;



пинолин


около 5,0 мин
;



галантамин


около 2,4 мин
.

Ориентировочные времена удерживания в моче:



6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин



около 1,1 мин
;



пинолин


около 5,0 мин
;



галантамин



около
2,4

мин
.

Время хроматографирования:

14 мин

Подвижная фаза:

Элюент А:

5 мМ аммония формиата и 0,01 % муравьиной кислоты в воде.

Элюент
B
:

0,01 % муравьиной кислоты в ацетонитриле.

Методика

Стабилизируют систему ВЭЖХ в условиях начального градиента

(элюент А
: элюент В = 95 % : 5 %) в течение 15 мин.

Градиентная программа:

Время, мин

Элюент А, % (об/об)

Элюент В, % (об/об)

0

95

5

1,5

95

5

2

70

30

8,5

40

60

12

95

5

14

95

5

2.3. Дизайн фармакологической части

В исследовании принимали участие

20 мужчин
(средний воз
раст



39,5

±

9,5 года),
страдающих алкогольной зависимо
стью и находящихся на
стационарном лечении в ГБУЗ «МНПЦ нар
кологии

ДЗМ»
. В период актуализации
патологического влечения пациенты получали галоперидол в таблетированной
форме (ОО
О «Озон», Россия) в дозировке 5,00

±

1,87

мг/сут
(9 па
циентов,
однократный прием) и в инъекционной форме (ЗАО «БРЫНЦАЛОВ
-
А», Россия) в
45


дозировке

5,86

±

2,39

мг/сут
(11

пациентов, однократный прием). Крит
ерии
включения в иссле
дование: терапия, содержащая га
лоперидол длительностью 5
дней; пероральная и в
нутримышечная формы введения га
лоперидола; отсутствие
в анамнезе сопутствующего психического заболевания. Критерии исключения:
применение в терапии иных антипсихотических препаратов, помимо галопе
-
ридола; кли
ренс креатинина

50

мл/мин, концентрация креа
тинина в плазме
крови ≥ 1,5

мг/дл (133

мкмоль/л); масса тела менее 60

кг или превышающая
100

кг; возраст 75 лет и более; наличие противопоказаний к применению
галоперидола.

.





















46


ГЛАВА 3.
ОСНО
ВН
ЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1
.

Разработка методики

количественного определения пинолина и 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина

3.1.1. Выбор внутреннего стандарта

Для выбора внутреннего стандарта обычно руководствуются следующими
принципами:



Внутре
нний стандарт должен хорошо смешиваться в тех
растворителях, из которых состоит анализируемая проба, также стандартное
вещество должно быть инертно по отношению к компонентам пробы и
подвижной фазе.



Пик внутреннего стандарта на хроматограмме должен распола
гаться
рядом с исследуемыми веществами, но при этом не должен накладываться
на них.



Стандартный образец внутреннего стандарта не должен содержать
примеси, которые могут накладываться на анализируемые пики.

Внутренний стандарт подбирали с учетом структурной

формулы,
молекулярной массы и значением рКа. Молекулярная масса и значение рКа для
пинолина составляют 203 г/моль и 9,04,
LogP

= 1,25
. В качестве внутреннего
стандарта был подобран галантамин с молекулярной массой 288

г/моль и
значение рКа 8,94,
LogP

= 1,
75
, структурная формула представлена на рисунке 7.
При дальнейшем исследовании было установлено, что галантамин по всем
требованиям подходит в качестве внутреннего стандарта при определении
пинолина и его метаболита

[
5
]
.

47



Рису
нок 7
-

Внутренний стандарт галантамин.

3.1.2. Пробоподготовка

3.1.2.1.
Отбор проб. Пробоподготовка

Отбор проб проводится таким образом, чтобы гарантировать отсутствие
изменений в составе образца
,

как с качественной, так и с количественной
стороны.

Вот нес
колько общих правил, которым необходимо следовать для
правильного отбора проб:

1.

отбор проб должен производиться обученным и квалифицированными
людьми;

2.

отбор каждой пробы должен происходить отдельно;

3.

приборы для отбора проб должны гарантировать отсутствие
за
грязнения;

4.

отобранные пробы должны хра
ниться соответствующим образом.

В качестве проб берут биообъекты


кровь и мочу
. Перед экстракцией
кровь центрифугируют, и для дальнейшего анализа отбирают плазму.

Правильная подготовка пробы является одним из самых гл
авных моментов
при проведении анализа. Как правило, пробоподготовка состоит из нескольких
этапов: экстракция вещества из пробы и химическая обработка

(дериватизация),
позволяющая перевести исследуемое вещество в форму, более подходящую для
анализа.

48


3.1.2.2
.
Пробоподготовка
плазмы
крови

Для экстракции пинолина и его метаболита были проведены несколько
вариантов пробоподготовки плазмы. Пробоподготовку проводили на сериях
подготовленных проб с известным содержанием исследуемых веществ и
внутреннего стандарта.

Приготовление интактной плазмы.

К 1000 мкл плазмы

прибавляли 400

мкл
боратного буфера рН 9,6
и 2000 мкл этилацетата. Смесь встряхивали

в течение 10
минут, для полноты экстракции
, затем центрифугировали на центрифуге

вор
текс
в течение 10 минут при скорости
13000 об/мин. В качестве интактной плазмы
отбирали нижний слой.

Пробоподготовка 1.

К 400 мкл пробы (интактной плазмы)

(табл. 5) прибавляли 1200 мкл
ацетонитрила для осаждения белков. Смесь встряхивали

в течение 10 минут, для
полноты экстракции
, затем центр
ифугировали на центрифуге

вор
текс в течение
10 минут при скорости 13000 об/мин. Отбирали надосадочную жидкость и
проводили

выпаривание до сухого остатка
. Сухой остаток

раствор
яли

в 100

мкл 1
% раство
р
е муравьиной кисло
ты в воде.

№ пробы

Пинолин

Метаболит

Г
алантамин

Объем пробы


(интактная
плазма)

1.1

100 пг/мл

100 пг/мл

20 нг/мл

400 мкл

1.2

500 пг/мл

500 пг/мл

20 нг/мл

400 мкл

1.3

1000 пг/мл

1000 пг/мл

20 нг/мл

400 мкл

1.4

529 нг/мл

538 нг/мл

492 нг/мл

400 мкл

1.5 (плазма)

0

0

0

400 мкл

Таблица 5

-

Ко
нцентрации стандартных веществ в пробе для пробоподготовки

1.

Пробоподготовка 2.

К 400 мкл пробы (интактной плазмы) (табл. 6)

прибавляли 400 мкл
ацетонитрила для осаждения белков. Также ацетонитрил является экстрагентом.
Смесь встряхивали

в течение 10 мину
т, для полноты экстракции
, затем
49


центрифугировали на центрифуге

вор
текс в течение 10 минут при скорости 13000
об/мин. Отбирали надосадочную жидкость на анализ
.

№ пробы

Пинолин

Метаболит

Галантамин

Объем пробы

(интактная
плазма)

2.1

100 пг/мл

100 пг/мл

20
нг/мл

400 мкл

2.2

500 пг/мл

500 пг/мл

20 нг/мл

400 мкл

2.3

1000 пг/мл

1000 пг/мл

20 нг/мл

400 мкл

2.4

529 нг/мл

538 нг/мл

492 нг/мл

400 мкл

2.5 (плазма)

0

0

0

400 мкл

Таблица 6
-

Концентрации стандартных веществ в пробе для пробоподготовки

2.

Пробопод
готовка 3.

К 400 мкл пробы (интактной плазмы) (табл. 7)

прибавляли 200 мкл
боратного буфера рН 9,6
и 1000 мкл этилацетата. Смесь встряхивали

в течение 10
минут, для полноты экстракции
, затем центрифугировали на центрифуге

вор
текс
в течение 10 минут при ско
рости 13000 об/мин. Отбирали надосадочную
жидкость и проводили

выпаривание до сухого остатка
. Сухой остаток

раствор
яли

в 100

мкл 1 % раство
р
е муравьиной кисло
ты в воде.

№ пробы

Пинолин

Метаболит

Галантамин

Объем пробы

(интактная
плазма)

3
.1

100 пг/мл

100
пг/мл

20 нг/мл

400 мкл

3
.2

500 пг/мл

500 пг/мл

20 нг/мл

400 мкл

3
.3

1000 пг/мл

1000 пг/мл

20 нг/мл

400 мкл

3
.4

529 нг/мл

538 нг/мл

492 нг/мл

400 мкл

3
.5

0

0

0

400 мкл

Таблица 7
-

Концентрации стандартных веществ в пробе для пробоподготовки

3.



50


Пробоп
одготовка
4
.

Перед внесением пробы (интпктная плазма) (табл. 8.) в картридж С18 для
ТФЭ проводили активацию сорбента. В картридж, подключенный к вакуумному
насосу, вносили 2 мл метанола, затем

1 мл воды
и

2 мл боратного буфера

рН 9,6
.

В активированный карт
ридж вносили 400 мкл пробы

разбавленной 400

мкл
физ
иологического раствора, затем последовательно добавляли
1 мл воды
,

1 мл

смеси

ацетонитрил : вода (10 : 90)
,
элюирование
проводили 0,5 мл

0,1 %

раствором триэтиламина в метаноле. Полученный элюат

выпарива
л
и

до сухого
остатка

и

раствор
яли

100 мкл 1 % муравьиной к
-
ты в воде.

№ пробы

Пинолин

Метаболит

Галантамин

Объем пробы

(интактная
плазма)

4
.1

100 пг/мл

100 пг/мл

20 нг/мл

400 мкл

4
.2

500 пг/мл

500 пг/мл

20 нг/мл

400 мкл

4
.3

1000 пг/мл

1000 пг/мл

20 нгмл

4
00 мкл

4
.4

529 нг/мл

538 нг/мл

492 нг/мл

400 мкл

4
.5

0

0

0

400 мкл

Таблица 8. Концентрации стандартных веществ в пробе для пробоподготовки

4.

3.1.2.3.
Пробоподготовка мочи

Образцы чистой и исследуемой мочи хранили в морозильнике


для плазмы
при температ
уре от


75
о
С до


80
о
С. Стандартные растворы хранили в
холодильнике при температуре 2


8
о
С.
Приготовление интактной
мочи
.

К 1000
мкл мочи

прибавляли 400

мкл
боратного буфера рН 9,6
и 2000 мкл этилацетата.
Смесь встряхивали

в течение 10 минут, для полн
оты экстракции
, затем
центрифугировали на центрифуге

вор
текс в течение 10 минут при скорости 13000
об/мин. В качестве интактной мочи отбирали нижний слой.

Пробоподготовку проводили на сериях подготовленных проб с известным
содержанием исследуемых веществ и

внутреннего стандарта

методом
твердофазной экстракции
.

Перед внесением пробы (табл. 9) в картридж С18 для
51


ТФЭ проводили активацию сорбента. В картридж, подключенный к вакуумному
насосу, вносили 2 мл метанола, затем

1 мл воды
и

2 мл боратного буфера

рН 9,6
.

В активированный картридж вносили
20
00 мкл пробы, затем
последовательно добавляли
1 мл воды
,

1 мл

смеси

ацетонитрил : вода (10 : 90
, об
)
,
элюирование
проводили

0,5 мл
0,1 %

раствором триэтиламина в метаноле.
Полученный элюат

выпарива
л
и до сухого остатка

и

раствор
яли

100 мкл 1 %
муравьиной к
-
ты в воде.


пробы

Пинолин, пг/мл

Метаболит, пг/мл

Галантамин, нг/мл

Объем
пробы

(интактная
моча)

Т.1

250

250

20

2000 мкл

Т.2

375

375

20

2000 мкл

Т.3

500

500

20

2000 мкл

Т.4

750

750

20

2000 мкл

Т.5

1000

100
0

20

2000 мкл

Т.6

1250

1250

20

2000 мкл

Т.7

1500

1500

20

2000 мкл

Т.8

0

0

20

2000 мкл

Таблица 9
-

Концентрации стандартных веществ в пробе для пробоподготовки
мочи.

3.1.2.4. Вывод
ы по результатам пробопоготовки

При разработке методики были опробован
ы различные виды
пробоподкотовки. Поскольку концентрации аналитов находились в пределах
нескольких сотен пикограмм, нужно было сконцентрировать пробу для
определения на ВЭЖХ наиболее низкой концентрации. Из методов
пробоподготовки, описанных в разделе «
3.1
.2.2. Пробоподготовка плазмы крови
»,
наиболее чувствительной пробоподготовкой была с применением ТФЭ. Также
проподготовка

c

ТФЭ применялась и для мочи.


52


3.1.3. Хроматографические условия

В качестве метода определения был выбран метод обращеннофазной
высоко
эффективной жидкостной хроматографии с

тандемным

масс
-

детектором,
как чувствительный и специфичный.

Исследуемые вещества являются неполярными, ароматическими и
проявляют основные свойства. Для хроматографирования полученных проб
применяли колонку
Agilent

Zorbax

Eclipce

Plus

C
18
RRHD

100
x

2,1 мм, 1,8 мкм с
предколонкой
Agilent

Zorbax

Eclipce

Plus

C
18

12,5
x

2,1 мм, 5 мкм.

Ниже приведены хроматографические условия разработанной методики
[
3
,
1
,
4
,
6
,
8
,
7
,
2
]
:

Хроматограф:

Agilent

1290

Infinity
;

Предколонка:

Agilent

Zorbax

Eclipce

Plus

C
18

12,5
x

2,1 мм, 5 мк
м (кат. №

821125
-
936
)
;

Колонка:

Agilent

Zorbax

Eclipce

Plus

C
18
RRHD

100
x

2,1 мм, 1,8 мкм (кат.


959758
-
902K
)
;

Температура колонки:

(50 ± 1) ºС
;

Скорость потока:

0,4 мл/мин
;

Детектирование:

МС/МС,
MRM
-
переходы для пинолина 203,2
m
/
z

→ 174,0
m
/
z
,
для 6
-
ги
дрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина 189,2
m
/
z

→ 160,0
m
/
z
, для
галантамина 288,3
m
/
z

→ 213,0
m
/
z
;

Метод ионизации:

электроспрей (
ESI
) в положительной полярности
;

Объем пробы:

5 мкл
.

Ориентировочные времена удерживания

в плазме крови
:



6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
т
етрагидро
-
β
-
карболин


около 1,1 мин
;



пинолин



около 5,0 мин
;



галантамин


около 2,4 мин
.

Ориентировочные времена удерживания в моче:



6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин



около 1,1 мин
;



пинолин


около 5,0 мин
;



галантамин



около
2,4

мин
.

53


Время хром
атографирования:

14 мин
.

Подвижная фаза:

Элюент А:

5 мМ аммония формиата и 0,01 % муравьиной кислоты в воде.

Элюент
B
:

0,01 % муравьиной кислоты в ацетонитриле.

Методика

Стабилизируют систему ВЭЖХ в условиях начального градиента (элюент А
: элюент В = 95

% : 5 %) в течение 15 мин.

Градиентная программа:

Время, мин

Элюент А, % (об/об)

Элюент В, % (об/об)

0

95

5

1,5

95

5

2

70

30

8,5

40

60

12

95

5

14

95

5

Пригодность хроматографической системы
.

Пригодность хроматографической системы рассчитывали по

хроматограмме,
полученной от масс
-
детектора.

Эффективность колонки:



эффективность колонки, рассчитанная по пику пинолина

и
6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин
а

составила
25123
;



к
оэффициент разрешения между пиками пинолина и 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетраги
дро
-
β
-
карболин
ом

был

больше 1,5;



фактор асимметрии пика пинолина составил
1,37
;



фактор асимметрии пика 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин
а

составил
1,24
.

54



Рисунок 8
-

Образец хроматограммы: пинолин, 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин
и галанта
мин.


3.1.4. Масс спектр условия
.

Были подобраны
MRM

переходы для пинолина, его метаболита и
внутреннего стандарта галантамина методом электрораспыления в
положительной полярности (табл. 10).

Пинолин

203,2 m/z

m/z

Напряжение фрагментации (
V)

Энергия соуда
рения (
V
)

174

65

15

159

65

27

143

65

35

131

65

35

6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин 189,
m
/
z

m/z

Напряжение фрагментации (
V)

Энергия соударения (
V
)

160

75

15

117

75

30

91

75

3
5

Галантамин

288,3 m/z

m/z

Напряжение фрагментации (
V)

Энергия
соударения (
V
)

231

130

19

225

130

15

213

130

19

198

130

35

Таблица 10
-

Значения напряжения фрагментации и

энергии соударения для
MRM

переходов.

55


3.2. Валидация
методики определения пинолина и 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин

Методика бы
ла вали
дирована на основе «Руко
водства по экспертизе
лекарственных средств»
[
18
],
а

также

ру
ководств

FDA

[
48
]
и

EMA

[
49
]
.

Валидация методики проводится для подтверждения ее над
ежности для
определения концентрации пинолина и его метаболита. Основными
характеристиками, которыми должна обладать валидированная методика,
являются селективность, нижний предел количественного определения,
линейность, прецизионность, эффекты матрицы, ст
абильность исследуемых
веществ в биологической матрице в течение всего периода хранения и обработки.

3.2.1.
Параметры
пригодности хроматографической системы

Параметры, дающие возможность оценить приемлемость выбранных
условий хроматографирования для достиж
ения объективности получаемых
резул
ьтатов, представлены в
таблице

11
. Полученные данные свидетельствуют о
соответствии показателей хроматографической системы предъявляемым
требованиям.

Параметр

Норма
[
10
]

Фактическое
значение

Эффективность (число
теоретических тарелок)

Не менее 3000

25123

Разрешающая способность

Не менее 1,5

Больше 1,5

Коэффициент асимметрии пика

Пинолин

6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина


Не более 2,0

Не более 2,0



1,37

1,24


Относительное стандартн
ое
отклонение

Пинолин

6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина



не более 2,0%

не более 2,0%



0,96%

1,04%

Таблица 11
-

Основные характеристики пригодности хроматографической
системы
.

56


3
.2.
1.1.

Селективность

Селективность методики оценивали на плазме и н
а моче без добавления
стандартных образцов и с их добавлением.

На хроматограммах образцо
в
интактной
плазмы, очищенной от пинолина и
его метаболита путем жидкостной экстракции, отобранных у 6 лиц,

не
наблюдалось пиков с временам
и удерживания, соответствующи
ми пинолину,
метаболиту пинолина и галантамину
.

На хроматограмме плазмы, содержащей стандартные образцы пинолина, его
метаболита и галантамина (рис. 9
), времена удерживания не накладывались.
Разрешение пиков составляло более 1,5 между каждым пиком.

Пригото
вление интактной плазмы.

К 1000 мкл плазмы

прибавляли 400

мкл
боратного буфера рН 9,6
и 2000 мкл этилацетата. Смесь встряхивали

в течение 10
минут, для полноты экстракции
, затем центрифугировали на центрифуге

вор
текс
в течение 10 минут при скорости 13000 о
б/мин. В качестве интактной плазмы
отбирали нижний слой.

На хроматограммах образцов интактной
плазмы
,
очищенной от пинолина и
его метаболита путем жидкостной экстракции, отобранной у 6 лиц,

не
наблюдалось пиков с временами удерживания, соответствующими пин
олину,
метаболиту пинолина и галантамину.

На хроматограмме
плазмы
, содержащей стандартные образцы пинолина, его
мет
аболита и галантамина, времена удерживания не накладывались. Разрешение
пиков составляло более 1,5 между каждым пиком.

Приготовление интактно
й
мочи
.

К 1000 мкл мочи

прибавляли 400

мкл
боратного буфера рН 9,6
и 2000 мкл этилацетата. Смесь встряхивали

в течение 10
минут, для полноты экстракции
, затем центрифугировали на центрифуге

вор
текс
в течение 10 минут при скорости 13000 об/мин. В качестве и
нтактной мочи
отбирали нижний слой.

По данным результатов было сделано заключение, что методика является
селективной.


57





Рисунок 9
-

Хроматограмма
интактной
плазмы, содержащего стандартные
образцы пинолина, 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина и г
алантамина

3
.
2.1.2.

Линейность зависимости отклика от концентраций определяемых
веществ

Линейность


способность методики в диапазоне применения давать
величины сигнала, прямо пропорциональные содержанию определяемого
компонента.

С целью оценки линейности
методики осуществлялось построение
калибровочного графика. Для построения калибровочного графика готовили
калибровочные модельные смеси путём внесения
в
интактную

плазму

58


(приготовление см. раздел 3.2.1.1)

крови

и в мочу пинолина, его метаболита и
галантами
на
.

Также готовили калибровочные модельные смеси в интактной моче.

3.2.1.2.1.

Получение данных для построения калибровочного графика

Для получения данных, используемых при построении калибровочного
графика, калибровочные образцы подвер
гали процедурам пробо
подготовки
.
Также анализировали бланковые матрицы. В дальнейшем выполняли
хроматографическое исс
ледование полученных экстрактов.

3.2.1.2.2.

Построение калибровочного графика

Построение калибровочного графика осуществляли с помощью программы
Microsoft

Excel

2010.
Пос
ле хроматогр
афирования полученных растворов
строили
калиб
ровочные графики зависимости от
ношения площад
ей исследуемого
вещества к внут
реннему стандарту

(ось
Y
) от известных концентраций (ось


X
),
по к
оторым определяли концентрации
пинолина и 6
-
гид
р
окси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карбо
лина.

При этом определяли характер зависимости, тип аппроксимации,
достоверность аппроксимации и коэффициенты соответствующего уравнения
регрессии.

3.2.1.2.3.

Оценка линейности

Представленные данные свидетельствуют о том, ч
то для определяемого
вещества калибровочные графики описываются линейной функцией с высоким
показателем достоверности аппроксимации.
В плазме к
оэффициент корреляции

(R)

составил
0,99474

для пинолина и
R
=
0,99534 для
6
-
гидр
окси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карбо
лина
,
что соответствует требованиям

валидации методики

(не
менее

0,99

%).

В моче к
оэффициент корреляции

(R)

составил
0,99
13 для пинолина
и
R
=
0,9939 для
6
-
гидр
окси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карбо
лина
,
что соответствует
требованиям

валидации методики

(не менее

0,99

%
).


59



Рисунок 10
-

Калибровочный график зависимости концентрации пинолина от
площади пика в плазме крови.


Рисунок 11
-

Калибровочный график зависимости концентрации
6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина
от площади пика

в плазме крови
.

60



Рисунок 12
-

Калибровочный график зависимости концентрации пинолина от
площади пика в моче.


Рисунок 13
-

Калибровочный график зависимости
концентрации 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина
от площади пика

в моче
.

Был выполнен расчёт концентраций
пинолина и его ме
таболита

по
уравнению калибровочной зависимости, после чего полученные результаты
сравнивались с фактическими, а затем были рассчитаны значения относительной
погрешности
(табл. 12, 13, 14, 15
).




61


C
факт
,
пг/мл

0,25

0,375

0,5

0,75

1,0

1,25

1,5

Площадь
пик
а

1964

2876

3529

5571

7114

9140

10725

С
рассчит
,
пг/мл

0,271

0,396

0,486

0,768

0,980

1,260

1,478

ε, %

8,27

5,70

-
2,73

2,37

-
1,96

0,77

-
1,46

Норма

Не
более
20 %


Не более 15%

Таблица 12
-

Отклонения концентраций пинолина калибровочных растворов в
плазме

от фактических значений
.

C
факт
,
пг/мл

0,25

0,375

0,5

0,75

1,0

1,25

1,5

Площадь
пика

1986

3057

4758

6368

9001

10475

13347

С
рассчит
,
пг/мл

0,224

0,394

0,509

0,742

0,989

1,240

1,508

ε, %

-
10,22

5,12

1,79

-
1,06

-
1,07

-
0,80

0,57

Норма

Не
более
20 %


Не б
олее 15%

Таблица 13
-

Отклонения концентраций 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина калибровочных растворов в плазме от фактических значений
.

C
факт
,
пг/мл

0,25

0,375

0,5

0,75

1,0

1,25

1,5

Площадь
пика

2045

2587

3749

5527

7148

8993

10942

С
рассчит
,
пг/мл

0,282

0,357

0,517

0,762

0,985

1,239

1,508

ε, %

12,73

-
4,92

3,34

1,56

-
1,49

-
0,85

0,53

Норма

Не
более
20 %


Не более 15%

Таблица 14
-

Отклонения концентраций пинолина калибровочных растворов в
моче от фактических значений
.

62


C
факт
,
пг/мл

0,25

0,375

0,5

0,75

1,0

1,25

1,5

Площадь
пика

2479

2743

4478

6541

9201

10417

13195

С
рассчит
,
пг/мл

0,280

0,354

4,79

0,762

1,011

1,233

1,491

ε, %

12,07

-
5,67

-
4,19

1,63

1,13

-
1,35

-
0,58

Норма

Не
более
20 %


Не более 15%

Таблица 15
-

Отклонения

концентраций 6
-
гид
рокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина калибровочных растворов в моче от фактических значений
.

Полученные значения относительной погрешности соответствуют требованиям
(не более 20%
-

для нижней точки, не более 15%
-

для остальных).

3.2.1.3.

Оценка правильнос
ти и прецизионности методики

Правильность


величина, отражающая степень соответствия между
истинным значением измеряемой концентрации и результатом, полученным по
данной методике. Показатели правильности оценивались по уровню
относительной погрешности пол
учаемых результатов (выраженное в процентах
отношение разности «полученное значение


истинное значение» к истинному
значению концентрации, метод «введено


найдено»).

Прецизионность


величина, выражающая степень близости (или разброса)
результатов для се
рии измерений, выполненных по данной методике на
различных пробах одного и того же однородного образца. Показатели
прецизионности оценивались по уровню относительного стандартного
отклонения.

Оценку показателей правильности и прецизионности осуществляли пу
тём
исследования образцов контроля качества
на 4 уровнях концентраций: 250 пг/мл,
375 пг/мл, 750 пг/мл и 1500 пг/мл
. Правильность и прецизионность определяли в
течение 1 рабочего дня (внутри серии) и в течение нескольких дней (между
сериями). Расчёт концен
траций определяемых веществ в образцах контроля
63


качества выполняли по уравнению калибровочного графика, полученного в
составе текущей аналитической серии. Рез
ультаты представл
ены в таблице 16
, 17
.

Введено
(пг/мл)

Относительное стандартное
отклонение, %

От
носительная погрешность, %

Внутри серии
(
n=5)

Между
сериями (
n=
10
)

Внутри серии
(
n=5)


Между
сериями (
n=
10
)

250

8,95

9,01

11,24

12,
48

375

7
,13

7,47

7,65

8,12

750

4,67

4,81

5,12

5,87

1500

1,57

1,14

3,12

3,31

Таблица

16

-

Правильность и прецизионност
ь методики количественного
определения пинолина.

Введено
(пг/мл)

Относительное стандартное
отклонение, %

Относительная погрешность, %
(
n=5)

Внутри серии
(
n=5)

Между сериями
(
n=
10
)

Внутри серии
(
n=5)

Между
сериями (
n=
10
)

250

6,84

7,35

9,12

11,64

375

5,
78

6,01

8,05

9,18

750

4,12

4,41

5,61

6,12

1500

2,85

2,90

4,12

4,48

Таблица
17

-

Правильность и прецизионность методики количественного
определения
6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина
.

Правильность и прецизионность методики соответствуют требования
м (не
более 20%
-

для нижней точки, не более 15%
-

для остальных).

3.2.1.4.

Оценка предела количественного определения

Нижний пред
ел количественного определения


минимальная концентрация
анализируемого вещества в образце, которая может быть определена с т
ребуемой
правильностью и прецизионностью; критерием предела количественного
определения служило соотношение «сигнал : уровень флуктуационных

шумов
64


нулевой линии» не менее 10

: 1. Фактически в рамках представленного
исследования
в плазме крови

предел количе
ственного определения

пинолина
составил 250

п
г/мл

и для
6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин
а тоже
составил 250 пг/мл
.

В моче

предел количественного определения

пинолина
составил 250

п
г/мл

и для
6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин
а тоже
составил 2
50 пг/мл

3.2.1.5.

Эффект матрицы

Влияние

компонентов биологической матрицы (сыворотки крови

и мочи
)
оценивали путём определения степени извлечения
пинолина и его метаболита

из
модельных смесей, приготовленных аналогично калибровочным образцам и
образцам ко
нтроля качества, с концентрациями, соответствующими
250 пг/мл
,
750 пг/мл

и
1500 пг/мл

(для каждой из указанных концентраций исследовали 5
независимых модельных смесей). За 100

% принимали раствор вещества в
экстрагенте с аналогичной концентрацией, с поправ
кой на степень
концентрирования при пробоподготовке. Степень извлечения рассчитывали
,

как
выраженное в процентах соотношение площадей пиков определяемых веществ,
полученных при хроматографическом исследовании экстрактов модельных
смесей и растворов в чисто
м экстрагенте.
Результаты приведены
в таблице

18, 19,
20, 21
.

Концентрация пинолина

в модельной смеси, пг/мл

Степень извлечения, %

Коэффициент

вариации, %

250

86,02

11,09

750

84,67

10,07

1500

80,31

12,04

Таблица 18

-

Степень извлечения пинолина из м
одельных смесей на плазме крови
.




65


Концентрация 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина
в модельной смеси, пг/мл

Степень извлечения,
%

Коэффициент

вариации, %

250

83,93

12,22

750

86,28

8,89

1500

81,72

10,13

Таблица 1
9

-

Степень

извлечения 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина из
модельных смесей на плазме крови
.

Концентрация пинолина

в модельной смеси, пг/мл

Степень извлечения, %

Коэффициент

вариации, %

250

84,16

9,52

750

83,13

10,14

1500

82,32

10,37

Таблица 20

-

Степень извлечения пинолина и
з модельных смесей на моче
.

Концентрация 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина
в модельной смеси, пг/мл

Степень извлечения,
%

Коэффициент

вариации, %

250

79,33

10,19

750

81,71

11,05

1500

83,34

10,78

Таблица 21

-

Степень извлечения 6
-
гидрокси
-
1,2
,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина из
модельных смесей

на моче
.

Полученные значения соответствуют предъявляемым требованиям,
поскольку степень извлечения не превышает 100% и является воспроизводимой:
коэффициент вариации рассматриваемого показателя не превышает 1
5%.




66


3.2.1.6.

Стабильность анализируемых веществ

Оценивалась стабильность анализируемого вещества в составе стандартных
растворов, биологической матрицы при хранении, а также после
пробоподготовки.

3.2.1.6.1.

Стабильность стандартного раствора

Стабильно
сть стандартного раствора оценивали путём его
хроматографического исследования после разведения до концентраций,
соответствующих концентрациям образцов контроля качества; указанное
разведение учитывали в дальнейшем при расчёте концентраций. Оценивали
стаби
льность в течение 1 недели, анализируя раствор на начало и окончание
указанного периода. Исследовали по 3 независимых образцов каждой
концентрации. Результаты представлены в
т
аблице 2
2, 23
.

Фактическая концентрация

пинолина в стандартном растворе, пг/мл

1
500

750

250

Среднее значение

Начало периода

1438

737

244

Окончание
периода

1383

697

218

Стандартное отклонение

Начало периода

0,73

0,43

0,25

Окончание периода

1,21

0,48

0,17

Относительное стандартное
отклонение, %

Начало периода

1,50

4,41

10,26

Ок
ончание периода

2,48

5,11

7,79

Таблица 2
2

-

Стабильность стандартных растворов пинолина
.

Фактическая концентрация 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина в стандартном растворе,
пг/мл

1500

750

250

Среднее значение

Начало периода

1427

714

229

Окончани
е периода

1391

695

206

Стандартное отклонение

Начало периода

0,81

0,52

0,23

Окончание периода

1,27

0,59

0,14

Относительное стандартное
отклонение, %

Начало периода

1,58

4,21

9,86

Окончание периода

2,54

4,97

7,28

Таблица 2
3

-

Стабильность стандартных

растворов 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина
.

67


Полученные данные свидетельствуют о том, что стандартный раствор
пинолина и его метаболита

стабилен при хранении в течение не менее 1 недели.

3.2.1.6.2.

Стабильность
пинолина и его метаболита

в составе
биологической
матрицы при хранении в замороженном состоянии

Для оценки стабильности анализируемого вещества в составе плазмы при
хранении в замороженном состоянии готовили образцы, аналогичные по составу
образцам контроля качества. Половину образцов анализ
ировали сразу после
приготовления, а остальные


после хранения в замороженном состоянии в
течение 3 недель. Исследовали по 3 независимых образца каждой концентрации.
Рез
ультаты представлены
в таблице

24, 25, 26, 27
.

Фактическая концентрация

пинолина в об
разце, пг/мл

1500

750

2
5
0

Среднее значение

Начало периода

1484

735

239

Окончание периода

1473

703

229

Стандартное отклонение

Начало периода

0,53

0,28

0,05

Окончание периода

0,65

0,08

0,02

Относительное стандартное
отклонение, %

Начало периода

1,09

3
,04

1,51

Окончание периода

1,35

0,72

0,43

Таблица 24

-

Стабильность

пинолина при хранении в составе плазмы
.

Фактическая концентрация 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина в образце, пг/мл

1500

750

2
5
0

Среднее значение

Начало периода

1474

734

241

Окончание периода

1427

711

235

Стандартное отклонение

Начало периода

0,51

0,27

0,07

Окончание периода

0,63

0,06

0,04

Относительное стандартное
отклонение, %

Начало периода

1,07

3,07

1,53

Окончание периода

1,32

0,71

0,44

Таблица 25

-

Стабильность

6
-
г
идрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина при
хранении в составе плазмы
.

68


Фактическая концентрация

пинолина в образце, пг/мл

1500

750

250

Среднее значение

Начало периода

1477

729

237

Окончание периода

1438

713

229

Стандартное отклонение

Начало периода

0,6
1

0,37

0,19

Окончание периода

0,73

0,18

0,12

Относительное стандартное
отклонение, %

Начало периода

1,11

3,14

1,62

Окончание периода

1,28

0,84

0,47

Таблица 26

-

Стабильность пинолина

при хранении в составе мочи
.

Фактическая концентрация 6
-
гидрокси
-
1,
2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина в образце, пг/мл

1500

750

2
5
0

Среднее значение

Начало периода

1467

736

241

Окончание периода

1432

711

226

Стандартное отклонение

Начало периода

0,60

0,35

0,17

Окончание периода

0,76

0,19

0,13

Относительное стандартное
от
клонение, %

Начало периода

1,12

3,16

1,61

Окончание периода

1,27

0,82

0,45

Таблица

27

-

Стабильность

6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина при
хранении в составе мочи
.

Полученные данные свидетельствуют о том, что
пинолин и его метаболит
стабиль
н
ы

в
составе плазмы

и мочи

при хранении в замороженном состоянии в
течение не менее 3 недель.

3.2.1.6.3.

Стабильность
пинолина и его метаболита

после пробоподготовки

Для оценки стабильности
пинолина и его метаболита

после
пробоподготовки исследовали экстракты,
полученные из образцов контроля
качества. Половину экстрактов анализировали сразу после получения, а
остальные экстракты


после хранения в холодильнике (+4ºС) в течение 1 нелели.
69


Исследовали по 3 независимых образца каждой концентрации. Результаты
предста
влены
в таблице 28, 29, 30
, 31
.

Фактическая концентрация

пинолина в образце, пг/мл

1500

750

2
5
0

Среднее значение

Начало периода

1475

738

242

Окончание периода

1429

701

231

Стандартное отклонение

Начало периода

0,55

0,36

0,12

Окончание периода

0,70

0
,18

0,08

Относительное стандартное
отклонение, %

Начало периода

1,13

3,15

1,58

Окончание периода

1,26

0,84

0,44


Таблица

28

-

Стабильность пинолина при хранении в составе экстрактов,
полученных из плазмы

крови

Фактическая концентрация 6
-
гидрокси
-
1,2,3,
4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина в образце, пг/мл

1500

750

2
5
0

Среднее значение

Начало периода

1478

740

238

Окончание периода

1427

712

221

Стандартное отклонение

Начало периода

0,53

0,33

0,14

Окончание периода

0,68

0,17

0,09

Относительное стандартное
отклон
ение, %

Начало периода

1,03

3,17

1,60

Окончание периода

1,16

0,81

0,51


Таблица 2
9

-

Стабильность

6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина

при
хранении в составе экстрактов
, полученных из плазмы крови.




70


Фактическая концентрация

пинолина в образце, п
г/мл

1500

750

2
5
0

Среднее значение

Начало периода

14
74

7
36

23
9

Окончание периода

142
1

7
08

22
0

Стандартное отклонение

Начало периода

0,5
2

0,3
4

0,1
6

Окончание периода

0,6
7

0,1
6

0,
10

Относительное стандартное
отклонение,

%

Начало периода

1,0
4

3,1
8

1,6
1

Окончание периода

1,1
5

0,8
0

0,5
0

Таблица 30

-

Стабильность

пинолина

при хранении в составе экстрактов
,
полученных из мочи

Фактическая концентрация 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина в образце, пг/мл

1
50
0

75
0

2
50

Среднее значение

Начало периода

14
74

7
36

237

Окончание периода

1420

7
0
6

225

Стандартное отклонение

Начало периода

0,
49

0,3
6

0,1
2

Окончание периода

0,6
2

0,1
5

0,
07

Относительное стандартное
отклонение,

%

Начало периода

1,07

3,17

1,60

Окончание периода

1,19

0,83

0,52

Таблица 3

-
.

С
табильность
6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина

при
хранении в составе экстрактов
, полученных из мочи

3.2.1.7.

Тест на разведение

Изучена возможность количественного определения целевого аналита в
концентрациях, превышающих верхний предел диапазона к
алибровки. Для этих
целей готовили модельные образцы с концентрацией
пинолина и его метаболита

2

нг/м
л
. Исследовали 3 независимых образца каждой концентрации. Образцы
разводили в 2 раза бланковой сывороткой

и мочой
. Резу
льтаты представлены в
таблице 3
2, 33
.

71


Состав образца

Пинолин,

2000 пг/мл

6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин, 2000 пг/мл

Результаты исследования

разведённых образцов

(с учётом фактора разведения 2),

среднее значение, пг/мл

1868

1857

Стандартное отклонение

3,62

3,53

Относительное стан
дартное
отклонение, %

1,26

1,17

Относительная погрешность, %

-
4,37

-
4,25

Таблица 3
2

-

Результаты

теста на разведение бланковой сывороткой
.

Состав образца

Пинолин,

2000 пг/мл

6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболин, 2000 пг/мл

Результаты исследования

ра
зведённых образцов

(с учётом фактора разведения 2),

среднее значение, пг/мл

1887

1860

Стандартное отклонение

3,26

3,38

Относительное стандартное
отклонение, %

1,53

1,35

Относительная погрешность, %

-
4,56

-
4,35

Таблица 33
-

Результаты

теста на разведени
е бланковой мочой
.

Полученные результаты указывают на достаточную точность
количественного определения
пинолина и

6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина

после разведения исходных образцов.



72


3.3. Зависимость активности

изофермента

СУР 2
D
6 и изменения
от
ношения

пинолина и 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина

Изофермент CYP

2
D
6

участвует в метаболизме по разным оценкам от 15 до
25 % ЛС

[
11
,
25
,
31
]
. Субстратами этог
о изофермента являются
сильнодействующие ЛП, которые применяются в психиатрии и при лечении
сердечно
-
сосудистых заболеваний. При неправильной дозировке или при
изменении активности изофермента CYP

2
D
6

вследствии генетических факторов
или внешних воздействи
й могут проявиться серьезные НЛР, а также может
наблюдаться отсутствие фармакологического эффекта.

Целью нашей работы является разработать методику количественного
определения пинолина и его метаболита методом LC/MS/MS для оценки
активности изофермента
CYP

2D6. Для достижения этой цели были подобраны
оптимальные условия пробоподготовки биологических матриц и была
разработана и валидирована методика количественного определения. Затем,
методика была апробирована на пациентах для изучения активности CYP

2
D
6

[
19
,
36
,
37
]
. Также для оценки возможности использования методики для определения
изменений активности при приеме ингибиторов активности CYP

2
D
6

количественное определение

проводили у пациентов при приеме ингибиторов.

В исследовании принимали участие 20 мужчин
(средний воз
раст



39,5

±

9,5 года),
страдающих алкогольной зависимо
стью и находящихся на
стационарном лечении в МНПЦ нар
кологии. В период актуализации
патологическог
о влечения пациенты получали галоперидол в таблетированной
форме (ООО «Озон», Россия) в дозировке 5,00

±

1,87

мг/сут
(9 па
циентов,
однократный прием) и в инъекционной форме (ЗАО «БРЫНЦАЛОВ
-
А», Россия) в
дозировке

5,86

±

2,39

мг/сут
(11

пациентов, однократн
ый прием). Крит
ерии
включения в иссле
дование: терапия, содержащая галоперидол длительностью 5
дней; пероральная и в
нутримышечная формы введения га
лоперидола; отсутствие
в анамнезе сопутствующего психического заболевания. Критерии исключения:
применение в
терапии иных антипсихотических препаратов, помимо галопе
-
ридола; клиренс креатинина < 50

мл/мин, концентрация креа тинина в плазме
73


крови


≥ 1,5

мг/дл (133

мкмоль/л); масса тела менее 60

кг или превышающая
100

кг; возраст 75 лет и более; наличие противопока
заний к применению
галоперидола.

В качестве биообъекта собирали

утреннюю мочу пациентов, находящихся
на лечении препаратом
. Забор материала проводили в количестве не менее 10 мл
в сухой стерильный флакон. Первый отбор образцов про
водилс
я до начала
лечения,

а затем че
рез
5 дней, после начала приема пре
парата.

Время от момента забора клинического материала до его доставки

в
лабораторию составляло
:

п
ри комнатной температуре (18

25

°C)


не более

6
часов;

при температуре 2

80 °C


не более

1 суток (при доставке

в лабораторию
в специальных термоконтейнерах с хладогеном, термосах с термопакетами).

Образцы исследуемой мочи хранили в морозильнике


для плазмы при
температуре от


75
о
С до


80
о
С
.

Метод пробопоготовки отобранной мочи, описан в разделе «
3.1.2.3.
Пробо
подготовка мочи
».

3.3.1
. Изучение влияни
я

почечной патологии на активность изофермента
CYP

2
D
6

В исследовании приняли участие те же пациенты, так как у них в анамнезе у
всех значился алкогольный гепатит. В контрольной группе исследовались 20
добровольцев м
ужского пола в возрасте от 30 до 48 лет с верифецированным
диагназом «здоров», не приниавших никакого лечения (табл. 34).


пациента

Испытуемая группа до начала лечения

Контрольная группа

Пинолин
(пг/мл)

Метаболит
(пг/мл)

Метаболическое
отношение

Пиноли
н
(пг/мл)

Метаболит
(пг/мл)

Метаболическое
отношение

1

490

1493

3,043393

488

1426

2,917906

2

1487

642

0,431773

423

983

2,32079

3

1021

1111

1,088149

979

963

0,983573

4

1166

743

0,637221

679

1499

2,206862

5

309

1341

4,339806

1183

1241

1,04931

6

1478

25
2

0,170464

700

539

0,77086

74


7

885

1578

1,783051

613

1276

2,081413

8

1208

865

0,71606

580

905

1,559852

9

751

841

1,11984

354

1014

2,860647

10

504

278

0,551587

663

882

1,329482

11

853

1014

1,188746

1025

1134

1,106569

12

1493

264

0,176753

911

1328

1,4578
15

13

398

740

1,859296

764

1232

1,611318

14

1011

1427

1,411474

1049

1388

1,32309

15

1495

832

0,556522

409

995

2,429642

16

367

480

1,307902

1600

629

0,39362

17

1488

278

0,186818

304

910

2,988876

18

1445

825

0,570934

860

965

1,12166

19

256

1407

5,4960
94

537

1108

2,06386

20

1463

267

0,182483

434

978

2,251161

Ср.
значение

978

834

1,340918

728

1070

1,741415

Медиана

1016

829

0,902105

671

1005

1,58

Коэф
-
фициент
вариации

47,27

53,75

106,44

44,71

23,43

43,24

Таблица 34
-

Расчитанные значения концентраций

пинолина и его метаболита,
метаболический индекс.

Статистический анализ

результатов исследования произ
водили методами
непараметрической статистики с помощью пакета прикладных программ

Statsoft
Statistica

v.

10.0. При выборе метода брали во

внимание
нормальность
распре
деления выборок, которую оценивали с помощью

W
-
теста Шапиро

Уилка.
Различия считали статистически значимыми при р

< 0,05 (при статистической
мощности свыше 80

%). Для определения корреляционной связи между
количественными характеристика
ми вычис
ляли коэффициент ранговой
корре
ляции Спирмена (r
S
). Значение коэффициента корреляции r
S
в диапазоне от
0,3 до 0,7 при р

< 0,05 означало положительную умеренную, но достоверную
75


корреляцию между признаками; r
S

> 0,7 при р

0,05



сильную и достоверн
ую
связь; отрицательное значение r
S
соответствовало обратной корреляции.

Было доказано, что статистически значимого отличия между больными
алкогольным гепатитом и здоровыми добровольцами в отношении
метаболической активности
CYP

2
D
6
нет (
р



0,05

).

3.
3
.
2.

Изменение активности

изофермента

CYP 2D6

под дей
ствием
ингибиторов и индукторов

Так как пациенты получали галоперидол, который является классическим
ингибитором
CYP

2
D
6
, то в нашем исследовании были измерены метаболические
отношения по пинолину до начала
лечения и после 2 недель приема
галоперидола. Результаты приведены в таблице 35.


пациента

До начала лечения

После 2 недель приема галоперидола

Пинолин
(пг/мл)

Метаболит
(пг/мл)

Метаболическое
отношение

Пинолин
(пг/мл)

Метаболит
(пг/мл)

Метаболическое
о
тношение

1

490

1493

3,043393

1228

273

0,222649

2

1487

642

0,431773

849

1447

1,702913

3

1021

1111

1,088149

1104

471

0,426584

4

1166

743

0,637221

732

403

0,550722

5

309

1341

4,339806

1374

1319

0,960297

6

1478

252

0,170464

955

630

0,660424

7

885

1578

1
,783051

1049

728

0,693815

8

1208

865

0,71606

1429

851

0,595611

9

751

841

1,11984

460

357

0,776271

10

504

278

0,551587

438

677

1,544867

11

853

1014

1,188746

486

1404

2,884012

12

1493

264

0,176753

1109

962

0,867568

13

398

740

1,859296

367

1498

4,081744

14

1011

1427

1,411474

1475

1211

0,820703

15

1495

832

0,556522

1295

547

0,422461

16

367

480

1,307902

936

1252

1,337017

17

1488

278

0,186818

1011

940

0,92988

18

1445

825

0,570934

395

921

2,328051

76


19

256

1407

5,496094

843

471

0,55854

20

1463

267

0,182
483

1334

782

0,58678

Ср.
значение

978

834

1,340918

943

766

1,149015

Медиана

1016

829

0,902105

983

816

0,80

Коэф
-
фициент
вариации

47,27

53,75

106,44

38,64

45,36

83,85

Таблица 35
-

Расчитанные значения концентраций пинолина и его метаболита,
метаболическ
ий индекс.

Статистический анализ

результатов исследования произ
водили методами
непараметрической статистики с помощью пакета прикладных программ

Statsoft
Statistica

v.

10.0. При выборе метода брали во

внимание нормальность
распре
деления выборок, кот
орую оценивали с помощью

W
-
теста Шапиро

Уилка.
Различия считали статистически значимыми при р

< 0,05 (при статистической
мощности свыше 80

%). Для определения корреляционной связи между
количественными характеристиками вычис
ляли коэффициент ранговой
корре
л
яции Спирмена (r
S
). Значение коэффициента корреляции r
S
в диапазоне от
0,3 до 0,7 при р

< 0,05 означало положительную умеренную, но достоверную
корреляцию между признаками; r
S

> 0,7 при р

0,05



сильную и достоверную
связь; отрицательное значение r
S
соот
ветствовало обратной корреляции.

Как видно из приведенных данных в процессе лечения ингибитором CYP

2
D
6

галоперидолом метаболическое отношение снижается (
r
S
в диапазоне от 0,3
до 0,7 при р

0,05

). Данную методику можно использовать для оценки
активности
изофермента
CYP

2
D
6

при приеме индукторов.







77


ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1.

На основании изученных научных статей и монографий обоснован выбор в
качестве объектов исследования пинолина и его метаболита
6
-
гидрокс
и
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина и подхода к их количествен
ному определению в плазме
крови человека и моче. Учитывая все рассмотренные данные, был сделан вывод
об актуальности данного исследования и были созданы общие подходы к анализу
изучаемых веществ.

2.

Р
азработаны

методик
и

количественного определения пинолина и
его
метаболита
6
-
гидрокс
и
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина в плазме крови человека и
моче с помощью метода высокоэффективной жидкостной хроматографии с
тандемным масс
-
селективным детектированием.

Подобраны оптимальные
условия хроматографирования анализируемы
х веществ.
Из различных
опробованных методов пробоподготовки выбран метод ТФЭ, как наиболее

чувствительный.

3.

Разработанная методика валидирована на основе «Руководства по
экспертизе лекарственных средств» [5], а также руководств FDA [29] и EMA [30]
.

Валидац
ию проводили по следующим параметрам: селективность, нижний предел
количественного определения, линейность, правильность, прецизионность,
эффекты матрицы, стабильность исследуемых веществ в биологической матрице
в течение всего периода хранения и обработки

4.

Проведена оценка активности изофермента цитохрома Р4
5
0

CYP

2
D
6

у
пациентов с алкогольным гепатитом с помощью разработанной методики.

По
результатам было доказано, что статистически значимого отличия между
больными алкогольным гепатитом и здоровыми доброво
льцами в отношении
метаболической активности
CYP

2
D
6
нет (
р



0,05

).

5.

Было изучено

изменение активности
CYP 2D6

у
пациентов при приеме
ингибитора
активности данного изофермента

галоперидола
.

В результате приема
ингибитора наблюдали снижение метаболического

индекса, что указывает на
снижение активности изофермента.

После проведения статистической обработки
была доказана достоверность полученных данных

78


6.

Полученные данные по оценке активность изофермента
CYP

2
D
6
у
пациентов с алкогольным гепатитом по сравнению
с контрольной группой и
снижение метаболического отношения после приема индуктора галоперидола
позволяют сделать вывод о возможности
применения разработанной методики у
пациентов, принимающих ингибиторы изофермента CYP

2
D
6
.






































79


СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1.

Абдрашитов Р.Х. Количественное определение пинолина для определения
активности изоферментов цитохрома Р450 // Сборник материалов
международного симпозиума посвященный 5
-
летию Клинико
-
диагностического
центра Международного Казахско
-
Т
урецкого Университета им. Ахмеда Ясауи
«
Инновации в оказании скорой неотложной медицинской помощи и актуальные
вопросы медицины
».


г. Туркестан, Казахстан,
2014
.


С.
214
-
216
.

2.

Абдрашитов Р.Х. Разработка количественного определения пинолина для
оценки акти
вности изофермента
CYP

2
D
6 цитохрома Р450 методом
LC
/
MS
/
MS

//
Сборник материалов
IV

Всероссийской научной конференции студентов и
аспирантов с международным участием
«
Молодая фармация


потенциал
будущего
»,
Санкт
-
Петербург, 14
-
15 апреля 2014 г.


СПб.: Изд
-
во СПХФА,
2014
.


С.
377



378
.

3.

Абдрашитов Р.Х. Разработка методик количественного определения
пинолина для оценки активности изофермента
CYP

2
D
6

цитохрома Р
450

методом
ВЭЖХ / Сеченовский вестник.


2014
.
-

№.
2
(
16
)


С.
102
.

4.

Абдрашитов Р.Х. Разработка м
етодики количественного определения
пинолина и его метаболита для измерения активности изофермента
CYP

2
D
6
цитохрома Р450 методом
LC
/
MS
/
MS

// Сборник материалов 74 Всеукраинской
научно
-
практической конференции молодых ученых и студентов с
международным уча
стием
«
Современные аспекты медицины и фармации
».


г.
Запорожье, Украина,
2014
.


С.
161
.

5.

Абдрашитов Р.Х., Петухов А.Е., Смирнов В.В. Разработка и валидация
биоаналитической методики количественного определения пинолина и его
метаболита 6
-
гидрокси
-
1,2,3,4
-
тетрагидро
-
β
-
карболина с целью определения
активности изофермента
CYP

2
D
6 // Разработка и регистрация лекарственных
средств.


2016.


№ 1 (14).


С. 120
-

124.

6.

Абдрашитов Р.Х., Смирнов В.В. Количественное определение пинолина для
определения активности и
зофермента
CYP

2
D
6 цитохрома Р450 методом
LC
/
MS
/
MS

// Всероссийская научная Интернет
-
конференция с международным
80


участием
«
Фармакологическая наука


от теории к практике
».


г. Казань,
2014
.


С.
5



6
.

7.

Абдрашитов Р.Х., Смирнов В.В. Разработка методики опр
еделения
активности изофермента
CYP

2
D
6 цитохрома Р450 методом
LC
/
MS
/
MS

//
Сборник материалов
XXI

Российский Национальный Конгресс
«
Человек и
лекарство
».


г. Москва,
2014
.


С.
190
.

8.

Абдрашитов Р.Х., Смирнов В.В. Разработка методки количественного
определе
ния пинолина для измерения активности изофермента
CYP

2
D
6
цитохрома Р450 методом
LC
/
MS
/
MS

// Сборник материалов Украинской научно
-
практической конференции
«
Проблемы синтеза биологически активных веществ и
создание на их основе лекарственных субстанций
».


г. Харьков, Украина,
2014
.


С.
87
.

9.


Влияние изофермента
CYP

2
D
6 на метаболизм лекарственных препаратов и
методы определения его активности/ В.В. Смирнов [и др.] // Ведомости Научного
центра экспертизы средств медицинского применения.


2015.


№ 3.


С. 3
2
-
35
.

10.

Государственнаяя Фармакопея Российской Федерации
XIII

издание,
том
1
.
-

М.: Министерство здравоохранения Российской Федерации,
2015
.


С.
464
-
467
.

11.

Кукес В.Г. Метаболизм лекарственных средств: клинико
-
фармакологические аспекты.
-

М.: Издательство «Реа
фарм», 2004.


144 с.

12.

Кукес В.Г., Сычев Д.А., Ших Е.В
. Изучение биотрансформации
лекарственных средств


путь к повышению эффективности и безопасности
фармакотерапии // Врач.


2007.


№ 1.


С. 6
-

8.

13.

Медведев Ю. и др. Физические методы исследования и их
практическое применение в химическом анализе.


Litres, 2016.


С. 9
-

21.

14.

Метаболизм лекарственных
препаратов/ Под

ред. Академика РМН.
Проф Кукеса В.Г.. чл.
-
коор. РАМН, проф. Фисснко В.П. М : Палея
-
М. 2001.

15.

Обзор существующих методик оценки активности
CYP

2
D
6

с
применением экзогенных и эндогенных маркеров / Р.Х. Абдрашитов [и др.] //
Фармакокинетика и фармакодинамика.


2015
.



1
.


С.
4

-

11
.

81


16.


Перспективы методики оценки активности
CYP

2
D
6 с применением
пинолина / Р.Х. Абдрашитов [и др.] // Фармация.


2015
.



5
.


С.
41
-
44
.

17.

Раменская

Г.В. Высокоэффективная жидкостная хроматография в
оценке биотрансфомации лекарственных средств (фармакокинетикя и
фармакогенетнка).
Автореф.д
иссер.
н
а соиск. ум. степени докт. Фарм. наук. 2003.

18.

Руководство по экспертизе л
екарственных средств. Том
1

/ Под ред.
А.Н. Миронова.


М.: Гриф и К,
2013
.


328

с.

19.

Смирнов В.В., Абдрашитов Р.Х. Оценка активности изоферментов
цитохрома Р450 при иммунокорректирующем лечении // Сборник научных работ
VII

Международной Научно
-
практической

конференции
«
Современные
концепции научных исследований
».


г. Москва,
2014
.
-


7
.


С.
143



144
.

20.

Adedoyin A. et al. Selective effect of liver disease on the activities of
specific metabolizing enzymes: investigation of cytochromes P450 2C19 and 2D6
//C
linical Pharmacology & Therapeutics.


1998
.


Т.
64
.


№.
1
.


С.
8
-
17
.

21.

Agilent 8800 Triple Quadrupole ICP
-
MS (ICP
-
QQQ) brochure
[Электронный ресурс]
URL: https://www.agilent.com/cs/library/brochures/5991
-
0079EN_8800_ICPQQQ_Brochure.pdf
(дата обращения: 0
6.05.2016
)

22.

the 20
th


1985.

№ 16(3).


C. 185
-
253.

23.

Bengtsson C., Johnsson G., Regårdh C. G. Plasma levels and effects of
metoprolol on blood pressure and

heart rate in hypertensive patients after an acute dose
and between two doses during long
-
term treatment //Clinical pharmacology and
therapeutics.


1975
.


Т.
17
.


№.
4
.


С.
400
-
408
.

24.

Bodó A. et al. The role of multidrug transporters in drug availabilit
y,


2003.


Т. 140.


С. 133
-
143.

25.

Bozkurt A. et al. Metabolic ratios of four probes of
CYP

2D6 in Turkish
subjects: a cross
-
pharmacokinetics.


1996.


Т. 2
1.


№. 4.


С. 309
-
314.

82


26.

Burton J. et al. Virtual screening for cytochromes p
450
: successes of
machine learning filters //Combinatorial chemistry & high throughput screening.


2009
.


Т.
12
.


№.
4
.


С.
369
-
382
.

27.

c renal failure on stereoselective


2005.


Т. 45.


№. 12.


С. 1422
-
1433.

28.

Cohn R. Concerning the occurrence of acetylated conjugates following the
administration of a
ldehydes //Z. physiol. Chem.


1893.


Т. 17.


С. 274.

29.



1977.


Т. 6.


№. 1.


С. 1
-
50.

30.

Cooper E. J. et al. Effects of t
he
β
-
carbolines, harmane and pinoline, on
insulin secretion from isolated human islets of Langerhans //European journal of
pharmacology.


2003
.


Т.
482
.


№.
1
.


С.
189
-
196
..

31.

Cytochrome P450 2D6 Phenoconversion Is Common in Patients Being
Treated for De
J.Clin. Psychiatry.


2013.


74(6).


P.
614
-
621.

32.

subjects with three or more functional
CYP

2D6 genes /
/British journal of clinical
pharmacology.


2000.


Т. 49.


№. 2.


С. 180
-
184.

33.

mediated by the polymorphic monooxygenase catalyzing debrisoquine 4
-
hydroxylation
(cytochrome P
-
4
50 dbl/bufI) //Biochemical and biophysical research communications.


1988.


Т. 152.


№. 1.


С. 411
-
416
.

34.

de Groote P., Ennezat P. V., Mouquet F. Bisoprolol in the treatment of
chronic heart failure //Vascular health and risk management.


2007.


Т. 3.


№.
4
.


С.
431
.

35.

Dessaignes V./ C. R. Acad. Sci.


1845.


№ 21.


1224 p.

83


36.

Development of validated method for simultaneous cytochrome P450
isoforms activity determination in drug allergy testing / V. Smirnov [et al] // Abstract
BOOK EAACI 2014.


2014.


P.
262
.

37.

Development of validated method for
CYP

2
D
6

phenotyping in studies of
correlation between drug allergy and cytochrome P
450

activity/ R.Kh. Abdrashitov [et
al] // Allergy.


2015
.


Т.
70
. № S
101
.


P.
227
.

38.

Distlerath L. M., Guengerich F. P. Char
acterization of a human liver
cytochrome P
-
450 involved in the oxidation of debrisoquine and other drugs by using
antibodies raised to the analogous rat enzyme //Proceedings of the National Academy of
Sciences.


1984.


Т. 81.


№. 23.


С. 7348
-
7352.

39.

Dor
ado P., Peas
-
LLed E. M., LLerena A.
CYP

2D6 polymorphism:
implications for antipsychotic drug response, schizophrenia and personality traits
//Pharmacogenomics.


2007.


Т
. 8.


№. 11.


С
.
1597
-
1608
.

40.

human liver and
induction by TCDD in precision
-
cut liver slices incubated in dynamic organ culture
//Carcinogenesis.


1998.


Т. 19.


№. 8.


С. 1361
-
1368.

41.

Erdmann O. L., Marchand R. F. Metabolism of cinnamic acid to hippuric
acid in animals //Ann. Chem
. Pharm.


1842.


Т. 44.


С. 344.

42.

Felmlee M. A. et al.
Cytochrome P450 expression and regulation in
CYP3A4/
CYP

2
D
6

double transgenic humanized mice //Drug Metabolism and
Disposition.


2008
.


Т.
36
.


№.
2
.


С.
435
-
441
.

43.

Frye R. F. et al. Liver disease
selectively modulates cytochrome P
450

mediated metabolism //Clinical Pharmacology & Therapeutics.


2006
.


Т.
80
.


№.
3
.


С.
235
-
245
.

44.

Granvil C. P. et al. 4
-
Hydroxylation of debrisoquine by human CYP1A1
and its inhibition by quinidine and quinine //Jour
nal of Pharmacology and Experimental
Therapeutics.


2002.


Т. 301.


№. 3.


С. 1025
-
1032.

45.

Assessment of the predictive power of genotypes for the
in
-
vivo catalytic function of
CYP

2D6 in a German population //Pharmacogenetics and
Gen
omics.


1998.


Т. 8.


№. 1.


С. 15
-
26.

84


46.

Guengerich F. P. Cytochromes P450, drugs, and diseases //Molecular
interventions.


2003.


Т. 3.


№. 4.


С. 194.

47.

Guengerich F. P. et al.
Diversity in the oxidation of substrates by
cytochrome P450 2D6: lack of

an obligatory role of aspartate 301
-
substrate electrostatic
bonding //Biochemistry.


2002.


Т. 41.


№. 36.


С. 11025
-
11034.

48.

of Health and Human Services, Food and Drug Administra
tion, Center for Drug
Evolution and Research (CDER). U.S. Government Printing Office: Washington, DC,
2001.

49.

Medicines Agency. Committee for medicinal products for human use: London, 2009.

50.

Ha
shiyada M. et al. Unexpectedly high blood concentration of bisoprolol
after an incorrect prescription: A case report //Legal Medicine.


2013
.


Т.
15
.


№.
2
.


С.
103
-
105
.

51.

Herraiz T., Galisteo J. Endogenous and dietary indoles: a class of
antioxidants an
d radical scavengers in the ABTS assay //Free radical research.


2004
.


Т.
38
.


№.
3
.


С.
323
-
331
.

52.

Pharmakol.


1887.


Т. 22.


С. 253
-
260.

53.

Ho R. H., Kim R. B. Transporters and drug ther
apy: implications for drug
disposition and disease //Clinical Pharmacology & Therapeutics.


2005.


Т. 78.


№.
3.


С. 260
-
277.

54.

Jaffe M., Cohn R. // Ber. Dtsch. Chem. Ges.


1887.


Т
.
20.


2311
с
.

55.

Jiang X. L., Shen H. W.,
Yu

A. M. Pinoline may be used a
s a probe for
CYP

2
D
6

activity //Drug Metabolism and Disposition.


2009
.


Т.
37
.


№.
3
.


С.
443
-
446
.

56.

Keller W. M. Keller on the Conversion of Benzoic into Hippuric Acid
//Provincial medical journal and retrospect of the medical sciences.


1842.


Т. 4
.


№.
92.


С. 256.

85


57.



1993.


Т. 21.


№. 2.


С. 309
-
317
.

58.

Klingenberg M. Pigments of rat liver m
icrosomes //Archives of
biochemistry and biophysics.


1958.


Т. 75.


№. 2.


С. 376
-
386.

59.

Knollmann B. C. (ed.). Goodman & Gilman's the pharmacological basis of
therapeutics.


New York : McGraw
-
Hill Medical, 2011.


Т. 12.



С. 327
-
328
.

60.

Labbé L. et al.

Effect of gender, sex hormones, time variables and
physiological urinary pH on apparent
CYP

of marker substrates //Pharmacogenetics and Genomics.


2000.


Т. 10.


№. 5.


С.
425
-
438.

61.

Lennard M. S. et al. Oxid
ation phenotype

a major determinant of
metoprolol metabolism and response //New England Journal of Medicine.


1982
.


Т.
307
.


№.
25
.


С.
1558
-
1560
.

62.

Lennard M. S. et al. Oxidation phenotype

a major determinant of
metoprolol metabolism and response //New

England Journal of Medicine.


1982
.


Т.
307
.


№.
25
.


С.
1558
-
1560
.

63.

Lewis D. F. V. Essential requirements for substrate binding affinity and
selectivity toward human CYP2 family enzymes //Archives of biochemistry and
biophysics.


2003.


Т. 409.


№.

1.


С. 32
-
44.

64.

Lewis D. F. V., Dickins M. Substrate SARs in human P450s //Drug
discovery today.


2002.


Т. 7.


№. 17.


С. 918
-
925.

65.

Lewis D. F. V., Jacobs M. N., Dickins M. Compound lipophilicity for

//Drug discovery today.


2004.


Т. 9.


№. 12.


С. 530
-
537.

66.

-
mephenytoin hydroxylation
polymorphisms in a Russian population living in Estonia //European journal of clinical
pharmacology.


1997.


Т. 53.


№. 3
-
4.


С. 257
-
260.

67.

March , J. Advanced Organic Chemistry 4th edn // John Wiley & Sons, Inc.


1992.


C
. 553


554.

86


68.

Mason H. S. Mechanism of Oxygen Metabolism. Adv. Enzymol. 19, 79

233 (1957).

Cf. ibid. 16, 105 (1955) //Oxidases. Ann. Revs. Biochem.


1965.


Т. 34.


С. 595
-
634..

69.

Multiple Human Cytochromes Contribute to

vitro: Role of CYP2C9, CYP2C19,
CYP

2D6, and CYP3A //Journal of pharmacy and pharmacology.


1998.


Т. 50.


№. 9.


С. 997
-
1004.

70.

Neumeister R. Lehrbuch der physiologischen Chemie: mit
Berücksichtigung der pathologischen Verhältnisse.


G. Fischer, 1897.

71.

Nozawa T. et al. Influence of
CYP

2D6 genotype on metoprolol plasma
concentration and
β
-
adrenergic inhibition during long
-
term tre
atment: A comparison
with bisoprolol //Journal of cardiovascular pharmacology.


2005
.


Т.
46
.


№.
5
.


С.
713
-
720
.

72.

-
450 of microsomes //Federation
proceedings.


1965.


Т. 24.


№. 5.


С. 1181.

73.

Omura T., Sato R
. A new cytochrome in liver microsomes //Journal of
Biological Chemistry.


1962.


Т. 237.


№. 4.


С. PC1375
-
PC1376.

74.

Otton S. V. et al. Use of quinidine inhibition to define the role of the

by human liver
microsomes //Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics.


1988.


Т.
247.


№. 1.


С. 242
-
247.

75.

Pähkla R., Harro J., Rägo L. Behavioural effects of pinoline in the rat
forced swimming, open field and elevated plus
-
maze tests //P
harmacological research.


1996
.


Т.
34
.


№.
1
.


С.
73
-
78
.

76.

Pedersen R. S., Damkier P., Brosen K. Tramadol as a new probe for
cytochrome P450 2D6 phenotyping: a population study //Clinical Pharmacology &
Therapeutics.


2005.


Т. 77.


№. 6.


С. 458
-
4
67.

77.

Poulsen L. et al. The hypoalgesic effect of tramadol in relation to
CYP

2D6* //Clinical Pharmacology & Therapeutics.


1996.


Т. 60.


№. 6.


С. 636
-
644.

87


78.

Qi W. et al. Increased levels of oxidatively damaged DNA induced by
chromium (III) and H2O2: pro
tection by melatonin and related molecules //Journal of
pineal research.


2000
.


Т.
29
.


№.
1
.


С.
54
-
61
.

79.

Regårdh C. G., Johnsson G. Clinical pharmacokinetics of metoprolol
//Clinical pharmacokinetics.


1980
.


Т.
5
.


№.
6
.


С.
557
-
569
.

80.

Rodrigues A.

D. Integrated cytochrome P450 reaction phenotyping
//Biochem Pharmacol.


1999.


Т. 57.


С. 465
-
480.

81.

Schellens J. H. et al.
Lack of pharmacokinetic interaction between
nifedipine, sparteine and phenytoin in man //British journal of clinical pharmacolog
y.


1991.


Т. 31.


№. 2.


С. 175
-
178.

82.

Schinkel A. H. et al.
P
-
glycoprotein in the blood
-
brain barrier of mice
influences the brain penetration and pharmacological activity of many drugs //Journal of
Clinical Investigation.


1996.


Т. 97.


№. 11.


С
.
2517
.

83.

of drugs to diffuse through the blood
-
brain barrier //Proceedings of the National
Academy of Sciences.


1994.


Т. 91.


№. 1.


С. 68
-
72.

84.

gioselectivity models for human
cytochromes P450 3A4, 2D6, and 2C9 //Journal of medicinal chemistry.


2007.


Т.
50.


№. 14.


С. 3173
-
3184.

85.

Streetman D. S., Bertino Jr J. S., Nafziger A. N. Phenotyping of drug
-

in
-
vivo cytochrome P450 phenotyping


2000.


Т. 10.


№. 3.


С. 187
-
216.

86.

-
450 isoforms
responsible for cis
-
and Disposition.


2001.


Т. 29.


№. 8.


С. 1146
-
1155.

87.

hepatocytes from
CYP

pharmacokinetics.


2005.


Т. 20.


№.
3.


С. 177
-
182.

88.

Tegeder I., Lötsch J., Geisslinger G. Pharmacokinetics of opioids in liver


1999.


Т. 37.


№. 1.


С. 17
-
40.

88


89.

Terfloth L., Bienfait B., Gasteiger J. Ligand
-
based models for the isoform
specificity of
cytochrome P450 3A4, 2D6, and 2C9 substrates //Journal of chemical
information and modeling.


2007.


Т. 47.


№. 4.


С. 1688
-
1701.

90.


Pharmacology & Therapeutics.


2005.


Т. 77.


№. 5.


С. 341
-
352.

91.

Oral anticoagulants //Metabolic Drug Interactions.


2000.


748 c
.

92.

-
chirurgical transactions.


18
41.


Т. 24.


С. 30.

93.

Van Montfoort J. E. et al.
Drug uptake systems in liver and kidney
//Current drug metabolism.


2003
.


Т.
4
.


№.
3
.


С.
185
-
211
.

94.

Von Bahr C. et al.
Plasma levels and effects of metoprolol on blood
pressure, adrenergic beta receptor

blockade, and plasma renin activity in essential
hypertension //Clinical pharmacology and therapeutics.


1976
.


Т.
20
.


№.
2
.


С.
130
-
137
.

95.

Purification and characterization of six cytochrome P
-
450
isozymes from human liver microsomes

//Biochemistry.


1983.


Т. 22.


№. 23.


С.
5375
-
5383.

96.

W
carbazole systems.


Interscience, 1954
.

97.

-
drug interactions for UDP
-
glucuronosyltransferase substrate
s: a pharmacokinetic explanation for typically


2004.


Т. 32.


№. 11.


С. 1201
-
1208.

98.

and allied organic c
allied organic compounds.


1947.

99.

Wöhler F. Tiedemann's Z //Physiol.


1824.


Т
. 1.


С
. 142.

89


100.

Wöhler F., Frerichs F. T. Concerning the modifications which particular
organic materials under
go in their transition to the urine //Ann Chem Pharm.


1848.


Т. 63.


С. 335.

101.

Yap C. W., Chen Y. Z. Prediction of cytochrome P450 3A4, 2D6, and 2C9
inhibitors and substrates by using support vector machines //Journal of chemical
information and modeling
.


2005.


Т. 45.


№. 4.


С. 982
-
992.


Приложенные файлы

  • pdf 6992400
    Размер файла: 1 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий