Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, 201 Gilman Hall, Berkeley, California United States — Nano Lett., 2017, 17 (12), pp 7951–7961 DOI


ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКАЯ РАБОТА
Биологическое производство растительных волокон с заданными физико-химическими свойствами
Выполнила:
Давыдова Елизавета Денисовна
ученица 10 «М» ГБОУ школы №1387 г.Москвы
Дата рождения: 17 ноября 2001 года
Тел. +79162601911
E-mail: [email protected]: https://sites.google.com/site/biochemistrymoscow/ или
https://sites.google.com/site/biochemistrymoscow/sozdanie-fluorescentnyh-volokon-lna

г.Москва
2017

Аннотация
Первоначально нами были синтезированы несколько видов флуоресцентов: флуоресцеин, флуоресцеин натрия, 5(6) карбоксифлуоресцеин (5(6)-FAM), а также 5(6)карбокситетрайодфлуоресцеин, 5(6)карбоксидихлорфлуоресцеин, тетрайодтетрахлорфлуоресцеин.
В дальнейшем, используя технику биоконъюгации, получили соединение 5(6)-FAM c глюкозамином (FAM-GLZMN), а также ряд других соединений: галогенизированных флуоресцентов с глюкозамином.
Глюкоза и ее производное глюкозамин являются важными составляющими в биохимии растения, клетки растений опознают данные вещества и используют их на различные цели в т.ч. на строительство, флуоресцент, находящийся в сцеплении с глюкозамином, в данном случае клеткой не отторгается, а встраивается в структуру клетки.
Данное флуоресцентное вещество вводилось в раствор растениям, выращенных в гидропонике (ex vevo), и растениям, выращенных в пробирке (in vitro), через питательную среду Мурасиге-Скуга, растение показало окрашивание через 24 часа в обоих случаях, по результатам получены волокна, которые полностью окрашены. Были исследованы концентрации данных красителей и показаны безопасные.
Нами было доказано получение данных веществ, а также их встраиваемость в структуру клетки.
Были изучены биологические и биофизические аспекты данный соединений в т.ч. фотоинсектицидные свойства.

Оглавление
TOC \o "1-3" \h \z \u 1.Введение PAGEREF _Toc507510053 \h 42.Синтез красителей PAGEREF _Toc507510054 \h 8Получение 5(6)-карбоксифлуоресцеина и разделение на изомеры PAGEREF _Toc507510055 \h 8Техника биоконъюгации. Получение флуоресцентных производных глюкозы PAGEREF _Toc507510056 \h 103.Физические и биологические свойства полученных красителей PAGEREF _Toc507510057 \h 154.Получение флуоресцентного льна in vitro и ex vivo PAGEREF _Toc507510058 \h 185.Результаты и их практическое применение PAGEREF _Toc507510059 \h 25Использованные источники PAGEREF _Toc507510060 \h 27Приложение 1. Полученные растения, волокна и соединения (Фото автора) PAGEREF _Toc507510061 \h 28Приложение 2. Расчеты по проекту (интенсивности флуоресценции в зависимости от типа ламп, расчеты хромотограмм и спектров) PAGEREF _Toc507510062 \h 32Приложение 3. Описание операций и их механизма при использовании биоконъюгации для создании FAM-GLKZMN PAGEREF _Toc507510063 \h 44

ВведениеНовизна этой работы заключается в том, что эксперименты по получению флуоресцентных волокон льна никем не проводились до настоящего времени. В работе полностью описаны нигде непубликуемые сведения о синтезе флуоресцентных производных глюкозы, созданных на основе биологических флуоресцентных зондов. Использованные производные глюкозы решают ряд существенных ограничений, существовавшие до сих пор. Кроме того, сформирован подход для выращивания волокон с новыми свойствами в будущем. Была спрогнозирована и доказана высокая фотоинсектицидная функция у некоторых синтезированных флуоресцентных производных глюкозы, показана их высокая сила воздействия на насекомых, удобность, долгосрочность и дозированность их применения за счет встраивания в клетку, а также их прогнозируемая безопасность. Данный класс встраиваемых фотоинсектицидов до настоящего времени нигде не описан. Все исследования и опыты проведены автором самостоятельно.
Цель: осуществить биологическое производство растительных волокон с заданными физико-химическими свойствами на основе культуры льна.
Задачи:
Изучить теоретические основы физического явления флуоресценции.
Осуществить физико-математические расчеты параметров флуоресценции.
Изучить теоретические основы синтеза интересующих нас органических соединений.
Изучить теоретические основы выращивания растений в пробирке и в гидропонике. Изучить фазы вегетации льна. Изучить биохимию растений.
Изучить физические и химические свойства. Подобрать концентрации красителей.
Провести синтезы флуоресцирующего маркера – 5(6) карбоксифлуоресцеина, галогенизация.
Провести синтез флуоресцирующего производного глюкозы с заданными свойствами.
Вырастить обычных и флуоресцирующих растений ex vevo (гидропоника) и in vitro (в пробирке).
Обобщить научные результаты, полученных на всех этапах исследований. Предложить применение полученных результатов на практике и направления дальнейшего развития проекта.
Первоначальный вопрос исследования автора - синтез флуоресцентных красителей данного проекта (флуоресцеина, флуоресцеина натрия, люминола, тетрайодфлуоресцеина, тетрайодтетрахлорфлуоресцеина, дихлорфлуоресцеина), плавно перешел в исследование синтеза флуоресцентных биозондов и биомаркеров (5(6)-FAM и вопросы его конъюгации). Как дальнейшее развитие подразумевало их практическое применение на растениях (так как на животных исследования в домашних условиях проводить не возможно) для отслеживания биологических процессов, именно тогда и возникла идея покрасить растение и сделать его флуоресцентным с переложением этого свойства на его волокна, поэтому и был выбран лен, как самое доступное. Идеи фотоинсектицидов и направленного мутагенеза растений возникло при исследовании физических (квантовых) свойств флуоресцентов.
Одним из наиболее важных направлений в настоящее время является получение новых материалов. Это и физические аспекты новых материалов: изменение кристаллической решетки, изменение структуры материалов, и химические аспекты новых материалов: синтез новых органических материалов с заданными свойствами, но это, как правило, имеет достаточно узкие границы использования, связанное, как со стоимостью новых материалов, так и с экологичностью и необходимостью в данных материалах.
Альтернативой вышесказанным подходам и все более важным способом становится биологически-ориентированные новые материалы. В том числе к данным материалам относятся материалы, созданные путем генной модификации растений, а также с использованием химико-биологического и физико-биологического подхода к получению данных материалов.
В создании новых свойств обратимся к оптическим свойствам, а именно к флуоресценции, которое является одним из разновидности люминесценции. Это очень важное свойство, которое используется в самых различных разделах науки и отраслях промышленности.
Созданием растений, обладающих такими свойствами, заняты биологи в рамках проектов по созданию генно-модифицированных растений. Так в 2014 году группой американских ученых [1] было создано первое ГМО растение с функциями люминофора и флуоресцента. Если упрощенно, они выделили ген, отвечающий за светимость моллюсков и светлячков (названный Люциферин), и синтезировали условно-патогенную бактерию Agrobacterium, встраивающую данный ген в ДНК растения (теоретически любого) и данный ген заставляет данное растение светиться и флуоресцировать. Также, они создали растения, обладающие несвойственными натуральными ароматами: мох с запахом роз, корицы или источающий антимоскитный репеллент.
Создание ГМО растений с заданными свойствами является передовым краем современной науки. Но у данных разработок есть и естественные проблемы: самая главная - невозможность оценки рисков, связанных с влиянием ГМО растений на естественную природу и человека, как ее элемента и законодательный запрет (ограничение) на использование данных растений.
Уже в процессе моего проекта, либо по окончании его, появилось ряд статей описывающих аналогичные эксперименты. В сентябрьском номере за 2017 год журнала «Science» [17] были опубликованы результаты работы международной группы ученых из Италии, Германии, США и Австралии под руководством Филипа Наталио из института Вейцмана (Израиль) по созданию биологического производства целлюлозных волокон с индивидуальными свойствами. Суть исследования заключалось в построении новой функциональности непосредственно в растении – в хлопке, выращенному в пробирке, путем добавления глюкозы, находящейся в сцеплении с некоторыми веществами, встраиваемых в растение и придающее ему новые свойства. В результате чего был получен хлопок, который естественным образом флюоресцирует (или имеет магнитные свойства в другом опыте). В данной работе существует ряд недостатков: во-первых культура, которую они используют, не имеет распространения на территории России, а во-вторых, существует ряд нерешенных автором проблем: проблема синтеза флуоресцирующих производных глюкозы с заданными параметрами (присоединения флуоресцирующего компонента к нужному атому углерода молекулы глюкозы), выливающаяся в нарушение цепочки, формирующаяся из элементов глюкозы - целлюлозы (из-за присоединения к другим атомам углерода) и, как следствие, снижение механических свойств (на разрыв), замеченное автором более, чем 4 раза, и проблема с корневой транспортной системой растения, выливающаяся в необходимость выращивания именно бескорневого растения на питательной среде. Кроме того авторы не раскрывает ни методологии, либо какие детали своего эксперимента.
Кроме того, также параллельно моим исследованиям, исследовательская группа ученых Массачусетского Технологического Института (MTI, США)[16] опубликовала работу о создании растения, в тканях которого осуществлен синтез люминофора, заставляющий растение светиться. Методы коньюгации, используемые ими, достаточно близки к используемым в этом проекте, они использовали хитин и глюконовую кислоту для инкапсуляции различных соединений в отдельно взятую клетку, что также схоже с этим исследованием. При этом они использовали в качестве растения – салат сорта Айсберг, который дает взрослое растение в течение 3 недель. Первые публикации об их работе осуществлены 17 ноября, то есть позже публикации результатов данной работы. Кроме того, существует и разность в подходах. Задача данной работы - получение флуоресцирующих волокон льна, намного сложнее и длительнее по времени вегетации, но работа MTI интересна многокомпонентным внесением в клетку новых веществ.
Еще одно исследование [18], касающееся фотоинсектицидных свойств ксантеновых красителей, изучал ученый химик Джеймс Р. Хейтц на протяжении свыше 20 лет, результатом которого стало объединение Министерства сельского хозяйства США с компанией Фотодью Интернейшнл (Photodye International) с развитием проекта Medfly в 1997 году. Идеей проекта являлись фотоинсектицидные красители, которые оказались очень действенными на средиземноморские плодовые мушки (Mediterranean Fruit Fly, Ceratitis capitata (Wiedemann)), но не действовали на пчел и не были ядовитыми (были нетоксичными) для человека. Суть проекта состояла в обработке пояса полей в Гватемале и Мексике от мушки с целью недопущения ее миграции в США. Было показано действие следующих красителей (в порядке убывания инсектицидных свойств): Бенгальская роза (тетрайодтетрахлорфлуоресцеин), Флоксин B (тетрабромтетрахлорфлуоресцеин), Эритрозин (тетрайодфлуресцеин), Эозин (тетрабромфлуоресцеин) и даже просто флуоресцеин. Результатом работы стал состав с действующим веществом Флоксина B в составе с кукурузным сиропом в качестве приманки и иных вспомогательных веществ. Данный проект продолжается до сих пор.
Данная работа разделена на два практических раздела, связанных между собой. Это раздел синтеза флуоресцентных красителей и раздел выращивания льна с инкапсуляцией красителя в его структуру.
Необходимо понимание следующих вопросов биохимии растений: значение глюкозы (и ее производных) в функциях клетки с точки зрения биологии и биохимии, а также транспортировка глюкозы в растение и ее трансформация. И если последний вопрос очень хорошо описан у Хелдт [3], Бертини [9], то на первый вопрос необходимо дать пояснения.
Глюкоза является одним из самых главных строительных материалов растения. Из молекул глюкозы - элементарных звеньев в результате получается кристаллическая целлюлоза, в растении она сцеплена множественно, формируя полимолекулу, с имеющейся возможностью ветвления, образуется многочисленно склеенные фибриллы.
Глюкоза, в виде различных производных – глюкозамин, крахмал, амилоза-галактоза, рибоза, фруктоза, сахароза, глюкоза -1(6)-фосфат, хитин, хитозан, используется в растении для различных целей – это строительство, аккумуляция и источник энергии.
Целлюлоза, которая состоит из молекул глюкозы, является главным строительным элементом стенки клетки растения, ведь 90% стенки клетки состоит из целлюлозы и лишь 10% из белка. Крахмал, который также состоит из клеток глюкозы, является основным энергетическим источником и формой хранения глюкозы, обеспечивающее ей отсутствие окисления, и накапливается внутри клетки в хлоропластах. Глюкоза также имеет возможность накапливаться в форме фруктана в вакуоле.
Рассмотрим более подробно молекулу глюкозы, как элемента цепочки целлюлозы (в целом такие же рассуждения верны и для крахмала):
C точки зрения молекулярной теории клетки каждая группа углерода (С) глюкозы имеет возможность организовать следующие связи:
Группы С1, С4 (С5-С6) отвечают за сцепление молекул глюкозы между собой в -1-4 гликозидную связь и за возможное ветвление по С6 в -1-6-гликозидную связь.
Группы С2, С3 отвечают за связь посредством L-арабинозы в гемицеллюлозе, одной из производной целлюлозы, которая также является важным компонентом клеточной стенки.
Кроме того, группы С5-С6 в части карбоксильных групп могут дополнительно связываться в пектинах, которые являются еще одной производной полисахаридов (наряду с целлюлозой и гемицеллюлозой), с помощью ионов Ca2+ и Mg2+.
Легко заметить, что менее всего вреда для растения нанесет присоединения флуоресцеиновой группы к С2, С3. Селекция гидроксильных групп на уровне химии у глюкозы это достаточно сложное занятие. Нами были исследованы все производные глюкозы используемые в растениях в части выделения подобранных нами групп. Был предложен глюкозамин (а также галактозамин), это производное глюкозы, где аминовая группа заменяет гидроксильную по С2. Нами и был выбран С2. Но в будущем надо будет рассмотреть возможность присоединения и по группе С3.
Отдельно рассмотрены аминокислоты растений. При анализе, подходящих нам аминокислот, нас интересовали функция аминной группы у данной кислоты и ее предназначение.

Синтез красителейВсе химические вещества (резорцин, тримеллитовый ангидрид, хлористый цинк, гидрооксид натрия, хлористый натрий, n суксицинимид, ацетон, изопропиловый спирт, этиловый спирт, йодистый калий, толуол, гидроксиламин, бикарбонат натрия, D-α-глюкозамин) приобретались в компаниях «РеактивТорг», «МосХимТорг» категории «Химически чистые» и «Особо чистые» компании производитель Acros, компоненты для биоконъюгации (EDC, MES, меркаптоэтанол) приобретались в компании Sigma Alldrich, PanReac (через компанию ООО «Реарус»). Вода приобреталась двойной дистиляции.
Получение 5(6)-карбоксифлуоресцеина и разделение на изомеры698501289685 5-карбоксифлуоресцеин; 6-карбоксифлуоресцеин
00 5-карбоксифлуоресцеин; 6-карбоксифлуоресцеин
50800297180
00
Получение 5(6)-карбоксифлуоресцеина (другие названия: 5(6)-FAM, CF, FAM), который является медицинским препаратом и коммерческим продуктом, использующийся, как флуоресцирующий краситель – зонд, маркер для биологических субстанции. при подкрашивании различных биологических процессов и тканей (в том числе у человека) происходит путем ацицилирования по реакции Фриделя-Крафта. Реакция Фриделя — Крафта широко распространенный способ ацилирования ароматических соединений в присутствии катализаторов кислотного характера (в нашем случае ZnCl2).
Более сложным вопросом является разделение 5(6)-FAM на соответствующие изомеры: 5-FAM и 6-FAM. Это необходимо в случае исследования спектральных и количественных характеристик. В общем случае эта необходимость отсутствует, но необходимо нам для изучения спектральных характеристик и изучения 1H ЯМР спектров. Разделение осуществляется в нашем случае препаративной хромотографией (но в работе [13] показана кристализации одного из изомеров из этилового спирта при -200С, но выделение второго изомера все равно осуществляется ТСХ, ВЭЖХ, либо элетрофорезом).
Галогеновые производные карбоксифлуоресцеина получались двумя способами: либо электрохимической галогенизацией 5(6) карбоксифлуоресцеина, либо использованием в реакции Фриделя-Крафта галогенового производного резорцина (4-хлор-резорцин, дийодрезорцин) как это было показано в работах [12].
Получение 5(6) карбоксифлуоресцеина
Реакция тримеллитового ангидрида с резорцином для получения 5(6)-карбоксифлуоресцеина (на примере 5-карбоксифлуоресцеина, но образуются оба изомера приблизительно с одинаковым распределением) происходит следующим образом:
-95250C9H4O5 Тримеллитовый ангидрид
С6H4(OH)2 Резорцин
H2О
C21H12O7 5(6)-Карбоксифлуоресцеин
C9H4O5 Тримеллитовый ангидрид
С6H4(OH)2 Резорцин
H2О
C21H12O7 5(6)-Карбоксифлуоресцеин
Для реакции 10,2г (53 ммоль) тримеллитового ангидрида и 11,0 г (100 ммоль) резорцина добавляют в 250 мл конусную колбу, добавляя 8 г хлорида цинка. Реакционная колба оснащена электронным контролем температуры и установлена ​в масляной бане на нагревателе. Смесь обрабатывают при перемешивании в течение 2,5 часа, нагревая при целевой температуре 140-145 °С. Сначала реакционная смесь становится вязкой, в конце реакции полностью твердой.
Первоначально неочищенный продукт, затвердевший в реакционной колбе, очищают путем переноса его водным раствором гидроксида натрия в водорастворимую динатриевую соль и затем осаждают продукт соляной кислотой. Для этой процедуры раствор гидроксида натрия готовят путем растворения 8,00 г (200 ммоль) гидроксида натрия в 80 мл воды. 40 мл конц. соляной кислоты заполняют 1 л стакан, содержащий 200 мл воды. Над стаканом установлена ​​воронка. Теперь 20 мл раствором гидроксида натрия заполняют реакционную колбу с затвердевшим сырым продуктом и перемешивают в течение 10 минут. Затем в реакционную колбу добавляют 30 мл воды и перемешивают еще 5 минут. Полученный темнокрасный раствор декантируют из все еще существующего твердого вещества в воронку и медленно по каплям добавляют (1-2 капли в секунду) к сильно перемешиваемой соляной кислоте в стакане. Продукт выпадает в осадок в виде оранжево-красного твердого вещества. В течение этого времени добавляют еще одну порцию 20 мл раствора гидроксида натрия в реакционную колбу с оставшимся неочищенным продуктом, перемешивают его, как и раньше, в течение 10 минут, добавляют 30 мл воды, перемешивают еще 5 минут, затем декантируют красный раствор в капельную воронку и добавляют его по каплям в стакан с соляной кислотой, как это было сделано ранее. Эту процедуру повторяют дважды до тех пор, пока весь раствор гидроксида натрия не будет использован.
Содержимое стакана охлаждают до комнатной температуры, и осаждение отсасывают через воронку Бюхнера или коническую воронку. (Если фильтровальная бумага заблокирована через тонкие кристаллы, можно фильтровать через сложенный фильтр). Для дальнейшей очистки все еще влажный продукт заполняют вместе 100 мл воды и 10 мл конц. соляной кислоты в 250 мл коническую колбу, которая оснащена электронным регулятором температуры, стеклянной трубкой и обратным холодильником. Смесь кипятят с обратным холодильником в течение 10 минут, нагревая при целевой температуре 103 °С. После охлаждения до комнатной температуры его отфильтровывают. Продукт промывают несколькими порциями воды (общий объем 300 мл), сушат до постоянной массы.
Получение 5(6) карбоксифлуоресцеина
Таким образом происходила электрохимическая реакция получения 5(6)карбокситетрайодфлуоресцеина – 5(6)карбоксиэритрозина B (аналогично и для 5(6)карбоксидихлорфлуоресцеина):
NaHCO3,KI(NaCl)элект. ток
---------------------->
K2CO3,H20,CO2
C21H12O7 = C21H8O7I4
5(6) карбоксифлуоресцеин 5(6)-карбоксиэритрозин B
Существует и другой химический способ получения выше обозначенных соединений для этого в реакцию ацицилирования вместо резорцина вносится соответствующее галогеновое производное например 4-хлор-резорцин или дийодрезорцин получая соответственно дихлоркарбоксифлуоресцеин и тетрайодкарбоксифлуоресцеин.
с. Разделение изомеров
Изомеры разделялись с помощью ТСХ. Сначала подбиралось сочетание растворителей дающее разделение при обычной ТСХ Merck Silica Gel 60 0,25 мм 5*20 см (не препаративной). Оптимальное сочетание составило: Толуол 33,3%, Изопропиловый спирт 33,3%, Ацетон 33,3%. Время экспозиции 3 часа.
Далее это процедура была повторена на препаративной ТСХ Merck Silica Gel 60 Glass 2 мм 5*20 см, позволившей получить аналитические количества препаратов.
d. Результаты реакций
Выход 5(6) FAM составила 14,4 г, 38,3 ммоль, (77%); т.пл. 317-320oC. Цвет продукта соответствует размеру зерен кристаллов темно-красные (мелкие кристаллы).
Выход 5-FAM составил 92 мкг (92%) и 6-FAM 95 мкг (95%) из 200 мкг исходной смеси изомеров.
Аналитические исследования
Для исследований спектров с исходных растворов снимался спетр поглощения и эмиссии, который в дальнейшем сравнивался с эталонным.
Техника биоконъюгации. Получение флуоресцентных производных глюкозы3524251082675FAM-GLKZMN
00FAM-GLKZMN
50800-3746500При получении флуоресцентных производных глюкозы особое внимание уделили именно вопросам биохимии, технологии биоконьюгации, то есть сопряжения разных химических веществ, добавляющих новую функциональность в обычные, для растительной среды, молекулы. Но в отличие от конъюгации, использовали оптимальный с точки зрения стоимости органический синтез с оптимизированной методологией, позволяющий значительно сэкономить.
Синтезированное нами вещество C27H23NO11 имеющее наименование по ИЮПАК - 3',6'-дигидрокси-3-оксо-N-[ (2R,3R,4R,5S,6R) -2,4,5-тригидрокси-6- (гидроксиметил) оксан-3-yl]-3H-спиро[бензофуран-1,9'-ксантен]-6-карбоксамин будем обозначать как FAM-GLZMN.
Также нами были синтезированы:

C27H41Cl2NO11 FAMCL-GLKZMN 4',5'-дихлоро-3,3',6'-тригидрокси-N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-2,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)оксан-3-ил]-октадекогидро-3H-спиро[2-бензофуран-1,9'-ксантен]-5(6)-карбоксамид C27H39I4NO11 FAMI-GLKZMN 3,3',6'-тригидрокси-2',4',5',7'-тетрайодо-N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-2,4,5-тригидрокси-6-(гидроксометил)оксан-3-ил]-октадекагидро-3H-спиро[2-бензофуран-1,9'-ксантен]-5(6)-карбоксамид 2-({3',6'-дигидрокси-3-оксо-3H-спиро[2-бензофуран-1,9'-ксантен]-5-ил}формамидо)пентанодиоик кислота (FAM-GLKMN)
Тетрайод-5(6)-карбоксифлуоресцеин (FAMI) Дихлор-5(6)-карбоксифлуоресцеин (FAMCL) Синтез FAM-GLZMN
Одним из важнейших производных глюкозы является глюкозамин. Сравнивая глюкозамин с глюкозой, легко заметить, что единственное изменение касается группы ОH, присоединенной к углероду С2, она заменена в глюкозамине на аминную группу NH2. Группа NH2 позволяет идентифицировать второй атом углерода в цепочке глюкозы и проводить реакции, ориентированные именно на эту группу.
Для методологии соединения глюкозы и флуоресцеина воспользуемся технологией, называемой биоконъюгация. Нами были выбраны методы, свойственные для биохимии, но с самостоятельным синтезом основных соединений.
Так глюкозу мы заменяем сразу на глюкозамин, это глюкоза с аминовой группой в нужном нам месте – углероде С2. Теперь нам нужно сшить аминную группу с карбоксифлуоресцеином в данном случае в так называемый NHS эфир, и потом связать между собой глюкозамин и NHS эфир в FAM-GLZMN, данная методология частично описана в работах [12,13,15,19].
Реакция:
Протокол соединения глюкозамина и 5(6) FAM (необходимо обратить внимание):
№ Методология Реком.
кол-во Наша методология
1 Растворяли 5(6)-FAM (C21H12O7, 376 гр/моль) 5 мг 1гр
0,1 М 2-(морфолино) этансульфоновой кислоты MES (C6H13NO4S 195,2 гр/моль) с 0,5 М хлоридом натрия (рН 6,0) (NaCl 58,5 гр/моль) 1 мл 200 мл (4,99 гр)
2 Сшивающий агент 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид EDC (C8H17N3) 25,5 мг 5,1 гр
и организующий связь компонент N-гидроксисукцинимид (C4H5NO3, 115 гр/моль) взвешивали в стеклянном флаконе и красителе добавляли раствор 3,8 мг 0,76гр
3 Реакционные компоненты смешивались, время прохождения реакции 1 час при комнатной температуре. 4 Сшивающий агент EDC инактивировали добавлением 2-меркаптоэтанола. 1,4
мкл 28 мл
5 Глюкозамин (C6H13NO5) (15 мг) растворяли в 15 мг 3 гр
0,1 М бикарбоната натрия (рН 8,3) (NaHCO3, 84г/моль) 1,5 мл 300мл раствора (8,4 гр на литр)
6 Реакционный раствор красителя
медленно добавляли в то время, как раствор-реципиент непрерывно мешали. 0,9 мл 180мл
7 Реакционную смесь инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре при непрерывном перемешивании. 8 Реакцию (NHS-Sulfo) останавливали добавлением 1,5 М гидроксиламина (рН 8,5) (NH2OH 33 гр/моль) к смеси и инкубировали в течение 1 часа при 25 °С. 0,15
мл 30мл раствора (50 гр на литр)
Необходимо отметить, что данные реакции очень многочисленные, поскольку происходит смешение разноплановых, но очень активных веществ, и включают в себя многочисленные ветвления с образованием многочисленных производных.
119443569659500-50800273050EDC
NHS, MES, NaCl
N-[3-(диметиламино)пропил]-N'-этилимидоформамид
NHS
FAM
O-ацилизомочевина эфир
NHS-FAM суксинимидил эфир
Глюкозамин
FAM-GLKZMN
0EDC
NHS, MES, NaCl
N-[3-(диметиламино)пропил]-N'-этилимидоформамид
NHS
FAM
O-ацилизомочевина эфир
NHS-FAM суксинимидил эфир
Глюкозамин
FAM-GLKZMN
375285056769000-5397563563500553783551689000Операции выглядит следующим образом:
Структурно операции выглядят следующим образом:
9525152400EDC
Глюкозамин
FAM-GLKZMN
O-ацилизомочевина эфир
FAM
NHS-Sulfo
NHS
NHS-Sulfo
NHS-FAM суксинимидил эфир
MES
00EDC
Глюкозамин
FAM-GLKZMN
O-ацилизомочевина эфир
FAM
NHS-Sulfo
NHS
NHS-Sulfo
NHS-FAM суксинимидил эфир
MES
57531023876000035375853530600045299912372995N-[3-(диметиламино)пропил]-N'-этилимидоформамид
N-[3-(диметиламино)пропил]-N'-этилимидоформамид
21329652355850001363324227359100904875279463500144611231851600043910251880235004657090756285001879600843280001651008686800063817553086000
В дальнейшем была выполнена гельпроникающая хроматография. Для этого использовалась хромотографическая колонка диаметром 20мм, в качестве геля использовался Sephadex 100 в количестве 10 гр, растворителем и элюентом использовалась дистиллированная вода, эталонные параметры снимались с раствора очищенного 5(6)-карбоксифлуоресцеина.
Полностью аналогично проводится операция с 5(6) карбокситетрайодфлуоресцеином (FAMI) и с 5(6) карбоксидихлорфлуоресцеином (FAMCL) с получением веществ:

C27H41Cl2NO11 FAMCL-GLKZMN C27H39I4NO11 FAMI-GLKZMN
-6350025654000Аналогично, но с заменой глюкозамина на глутаминовой кислоты проводится и синтез FAM-GLKAMA. Но при синтезе FAM-GLKAMA есть необходимость в защите карбоксильных групп глутаминовой кислоты от EDC, а это возможно только при деактивации EDC, путем внесения меркаптоэтанола, что и было сделано – название данного вещества: 2-({3',6'-дигидрокси-3-оксо-3H-спиро[2-бензофуран-1,9'-ксантен]-5-yl}формамидо)пентанодиоик кислота (FAM-GLKMN.
Результаты реакций
Для определения теоретически достижимого максимума выхода, воспользуемся в дальнейшем показанными результатами ТСХ, о том что в результирующем растворе отсутствуют определяемые количества 5(6)-FAM, а учитывая описанные нами в Приложении №3 реакции, определим что теоретическим пределом выхода вещества FAM-GLKZMN является равное количеству 5(6) FAM. Учитывая вышесказанное, теоретическим выходом на 1 гр 5(6)-FAM является 1,42 гр FAM-GLKZMN, а учитывая количество полученного раствора (534 мл), теоретически достижимая предельная концетрация составляет 2,66 гр на литр. Для определения выхода продукта результирующий раствор выпаривался в естественных условиях (20мл до 1мл) в 20 раз (которое соответствует концентрация 53мг на 1 мл) и далее получали чистый препарат используя препаративную ТСХ (Merck, Silica Gel 60, 2 мм) при хроматографии 1мл концентрированного раствора получали раствор чистого препарата, который в дальнейшем выпаривали получая сухой препарат в количестве 39 мг, что соответствует 73% от теоретически достижимого. Как вывод, можно сказать из 1 гр 5(6)-FAM получено 1,04 гр FAM-GLKZMN.
Аналитические исследования
Хроматография выполнялась с целью получения образцов очищенного препарата и доказательства его получения, график показан на рисунке, расчет и первичные данные приведены на сайте автора. В качестве эталонного выступал раствор очищенного 5(6)-FAM. В дальнейшем проводилась тонкослойная хроматография на основе пластин Merck Silica Gel 60 c элюентом 33,3% ацетон, 33,3% изопропиловый спирт, 33,3 толуол в течении 1 часа для меток 5(6)FAM, FLOUS, FAM-GLKZMN, FAM-GLKZMN+5(6)FAM.
Дополнительно проводили электрофорез в полиакрилатном геле раствора полученного после гельпроникающей хроматографии, с целью разделения веществ в анализируемом растворе.
Результатом ТСХ и электрофореза в ПААГ является показание получения новых веществ с прогнозируемым весом. Кроме того, в дальнейшем после электрофореза готовилась чистый препарат и снимался 1H ЯМР спектр который учитывая его сложность сравнивался со спектрами глюкозамина и 5(6) карбоксифлуоресцеина, показывая наличие схожих пиков на одинаковых частотах, но разных по амплитуде, особенно вначале и конце спектра, что однозначно может свидетельствовать о их производном происхождении от этих двух веществ. В дальнейшем планируется привести окончательные результаты исследования спектра 1H ЯМР.

Физические и биологические свойства полученных красителейСвет - это физическое явление, которое имеет волновую природу, а основной характеристикой волны - колебания является ее частота, а в целом свет характеризуется спектром. Весь спектр разбит на интервалы, которые имеют собственные названия. Интервалов достаточно много, но нас интересуют только ультрафиолетовое излучение с длиной волны 10-400 нм, видимый свет 400-760 нм и инфракрасное излучение с длиной волны от 760 нм до 100 мкм. Необходимо обратить внимание, что часть видимого спектра в синем спектре, достаточно плохо видна. И что самой видимой частью является именно желтый спектр видимого спектра.
Флуоресценция происходит, когда орбитальный электрон молекулы, атома или наноструктуры релаксирует в основное состояние S0, испуская фотон из возбужденного синглетного состояния S1:
Возбуждение: S0+hex->S1{\ displaystyle S_ {0} + h \ nu _ {ex} \ to S_ {1}}
Флуоресценция (эмиссия): S1->S0+hem+тепло{\ displaystyle S_ {1} \ to S_ {0} + h \ nu _ {em} + heat}
Где h является общим членом для энергии фотонов с h = постоянной Планка и = частота света. Конкретные частоты возбуждающего и излучаемого света зависят от конкретной системы. Фотоны могут передавать энергию и другим молекулам, например: молекулярному кислороду, формируя его синглетное состояние.
S0 называется основным состоянием флуоресцента (флуоресцентная молекула), а S1 является его первым (электронным) возбужденным синглетным состоянием.
Молекула в состоянии S1 может быть склонна к снижению возбужденного состояния (к снижению энергетического уровня) различными конкурирующими путями. Он может подвергаться нерадиационной релаксации, в которой энергия возбуждения рассеивается в виде тепла (колебаний) в окружающую среду. Возбужденные органические молекулы также могут расслабляться путем превращения в триплетное состояние, которое затем может ослабевать посредством фосфоресценции или путем вторичной неориентированной стадии релаксации.
Релаксация из S1 также может происходить за счет взаимодействия со второй молекулой посредством тушения флуоресценции. Молекулярный кислород (O2) является чрезвычайно эффективным гасителем флуоресценции только из-за его необычного триплетного основного состояния.
В большинстве случаев излучаемый свет имеет более длинную длину волны и, следовательно, более низкую энергию, чем поглощаемое излучение; это явление известно, как сдвиг Стокса. Как видно из диаграммы поглощения и эмиссии света для флуоресцеина, видно, что карбоксифлуоресцеин поглощает свет в УФ спектре и в синем спектре видимого света и излучает в желтом спектре.
Необходимо отметить, что спектры излучения большинства видов ламп включают обязательно и ультрафиолетовую часть спектра, как компенсацию включения синего спектра видимого диапазона и, как следствие, будет отображать в желтой части видимого света в гораздо более высокой амплитуде (мощности). Это дает дополнительно от 2 до 4% в видимой части. Дополнительно эмиссия фотонов происходит именно в желтом - наиболее видимом интервале, что дает дополнительно от 4 до 8%. Что суммарно дает до 10%, больше видимости отраженного потока (меньше всего на флуоресцентных лампах и на LED лампах теплого диапазона). Также как достоинство необходимо отметить, что флуоресценция происходит в случайном направление: в том числе и в обратном, без какого-либо поглощения.
Сильно флуоресцентные пигменты часто имеют необычный внешний вид, который часто описывается как «неоновый цвет». Считается, что это связано с высокой яркостью цвета относительно того, что оно было бы как компонент белого. Флуоресценция смещает энергию в падающем освещении с более коротких длин волн дольше (например, от синего до желтого) и, таким образом, может привести к тому, что флуоресцентный цвет станет более ярким (более насыщенным), чем это могло бы быть только отражением.
Эксперимент с лазером и ультрафиолетовой лампой (фонариком)
Один из двух одинаковых стаканов заполнялся раствором 5(6)карбоксифлуоресцеина в воде, а другой обычной водой.
Луч лазера активно светится в растворе флуоресцента, в воде и воздухе он полностью незаметен, таким образом фотоны, выбрасываемые флуоресцентом направлены во все направлениях.
При облучении ультрафиолетовым светом, который практически невидим глазу (немного присутствует света в синем спектре), показывает активное свечение флуоресцентной жидкости, чистая вода не светится.
Фотоинсектициды, фотосенсибилизаторы.
Отдельно необходимо рассмотреть фотоинсектицидные свойства красителей. Как было показано выше соединения, полученные нами: флуресцеин, тетрайодфлуоресцеин, дихлорфлуоресцеин являются фотоинсектицидами, то есть при воздействии света они становятся ядовитыми для насекомых. Так в патентах Джеймса Хейтца[18] и его коллег указывается, что данные красители являются фотосенсибилизаторами, то есть они увеличивают чувствительность тканей к воздействию света. Суть воздействия данных соединений для биологических тканей, заключающееся в получении синглетного кислорода в биологических тканях при облучении, за счет передачи от флуоресцентов энергии на обычный кислород. Как правило такие флуоресценты обладают меньшей флуоресценцией и ее сдвигом в красную (а иногда и в невидимую инфракрасную область). Синглетный кислород - это нестабильное высокоэнергетическое состояние молекулярного кислорода, заключающее в переходе электронов на более высокие орбитали. Синглетный кислород в отличие от обычного кислорода представляет собой высокоактивные молекулы, способные к вступлению в различные органические реакции, в случае с насекомыми является сильнейшим ядом за счет связывания внутриклеточных ферментов и белков нарушающее проницаемость клеточных мембран. Несложно предположить, что аналогичные соединения с 5(6)-карбоксифлуоресцеином и глюкозамином также являются фотоинсектицидами. Что и было показано в опытах с мушками бытовыми. Для опыта брался пакет в него вносилось разрезанное яблоко, дополнительно сверху посыпанное сахаром. Через два дня на нем появились мушки (Drosophila melanogaster). Они были разделены на 4 пакета (по 2 мушки в каждом), надувались и герметизировались, приманка удалялась. Далее вводился через шприц в 2 пакета вещество соединение 5(6) карбокситетрайодфлуоресцеина и тетрайодкарбоксифлуоресцеин-глюкозамин FAMI-GLKZMN, в один пакет 5(6)-FAM с сахаром и в другой не вводилось ничего (вещества вводились по 0,1мл). Один пакет с FAMI-GLKZMN находился в тени (сумраке). Три пакета выставлялись на дневной свет. Результат на свету мушки погибли полностью в двух пакетах, находящихся на свету в течение 4 часов с FAMI-GLKZMN и 5(6)-FAM. Мушки в пустом пакете на свету остались живы. Мушки с FAMI-GLKZMN, находящиеся в сумраке (тени) также остались живы.

Получение флуоресцентного льна in vitro и ex vivoФункциональные ткани, также известные как «умный текстиль», включают покрытия или вторичные материалы с такими свойствами, как изменение цвета или возможность генерирования электричества при движении. 
Проблема состоит в том, что все, что добавляется в ткань, может быть вымыто или изношено. Мы используем молекулы глюкозамина, чтобы проникнуть в хлопок, как троянский конь, передав хлопку новые свойства.
Согласно имеющимся сведениям имеется возможность сшить молекулу глюкозы и какую-то новую функциональность, в нашем случае 5(6) карбоксифлуоресцеин, и встроить данную молекулу непосредственно в лён (разновидность Льна культурного Linum usitatissimum L.). Глюкозный фрагмент, инкубированный с 5(6)-карбоксифлуоресцеином-глюкозамином, действует как носитель, способный перемещаться от сосудистого соединения к самому удаленному клеточному слою эпидермиса клетки, превращаясь в целлюлозные волокна. Это создает волокна с неестественными свойствами, такими как флуоресценция. Методы внесения данных веществ: через корневую систему или через поверхность листа (обязательна добавка поверхностно-активных веществ (ПАВ) в раствор для смачивания поверхности листа, в нашем случае 1 капля на 200мл средства для мытья посуды «Mama lemon», Japan)
Гидропоника льна ex vivo
Гидропоника - это подмножество гидрокультуры , метод выращивания растений без почвы и без использование минеральных питательных растворов в водном растворителе. Наземные растения можно выращивать только с их корнями, имеющими контакт с минеральным раствором. Корни могут поддерживаться инертной средой такой, как перлит или гравий.
Для быстрого выращивания и апробации полученных красителей нами был выбран метод гидропоники для выращивания культуры льна. Система гидропоники была нами выбрана статическая (поскольку не происходит движение раствора) с аэрацией раствора путем нагнетания компрессором через диффузор воздуха с формированием пузырьков воздуха в питательной среде для более интенсивного питания растения.
Семена предварительно замачивались в некрепком (вишневого цвета) растворе марганцовокислого калия в течение 30 минут. Далее семена замачивались в течение 12 часов в воде, вытирались от образовавшейся защитной слизи и далее ставились на специальной пленке с отверстиями в гидропонную установку. Ростки появились через 1 сутки. Световой режим 12 часов в день люминесцентные лампы. Был насыпан перлит для дополнительной вертикальной устойчивости, поскольку корневая система у льна – мочковая, со слабо выраженным центральным корнем. Через некоторое время начали вводить органические и минеральные удобрения, стимуляторы роста корневой системы, вегетации растений и цветения. Дополнительно вводился растворы энзимов, фунгицидов и антисептиков. Семена были высажены в 2 установки (одна для эксперимента и одна контрольная).
Стоит отметить систему гидропоники. Система гидропоники была переделана. Так система хоть и позиционировалась, как система для проращивания семян и выращивания растений, для второго она была предназначена слабо. Так горшок для питательной среды был исполнен из белого пластика, который из-за своей толщины пропускал свет, создавая несоответствующее природным освещениям корневой системы! Приводя к задержкам в развитии растения из-за развития грибов и т.п.. Было предложено решение: обклеить горшок для среды металлизированным скотчем, который слабо пропускал свет.
Выращивание растений на гидропонике, неожиданно, оказалось очень кропотливым, сложным и требующим ежедневного участия в процессе. Незнание множества деталей выращивания растений на гидропонике, этапов адаптации растений сказались на временных задержках в развитии растения. Аккуратное формирование питательной среды, сбалансированное различными добавками энзимов, микроорганизмов и фитогормонов, позволили значительно улучшить состояния растения и ускорить развитие.
Необходимо отметить, что растения на гидропонике подвержены заболеваниям.
Оборудование биохимической лаборатории. Питательная среда Мурасиге-Скуга. Выращивание льна in vitro
Выращивание растений in vitro является одним из самых главных достижений в биологии прошлого века. Это стало результатом развития практической биохимии растений, целью которой стало создание оптимальной среды для клеток растений и их роста и размножения. Дальнейшее развитие данного направления и привело к технологии микроклонального размножения - принципиально нового метода размножения растений обладающим рядом важных свойств: получение генетически идентичных растений и получение в условиях in vitro, неполовым путём растений. Эта методика позволяет проследить взаимодействие красителя и растения в целом, поскольку это полностью лабораторный метод выращивания растения с полным контролем всех входящих веществ. Основы методологии и организации работ были взяты из лабораторного практикума [8].
Создание и поддержание стерильных условий. Стерилизация растений. Проблемы культивируемого растения, связанные со стерильностью
Главным вопросом культивирования растений in vitro является стерильность. Стерилизацию посуды, инструментов и помещения осуществляют: нагреванием в духовом шкафу – стекло; кипячением – сосуды из термоустойчивой пластмассы; обработкой спиртом пластмассы, ламинарного бокса; облучением ультрафиолетовыми лучами, в основном, помещения и ламинарного бокса. Стерилизацию рабочего помещения мы проводили домашней УФ-бактерицидной ртутной лампой «Солнышко» (Обязательно использование специальных очков от УФ-облучения). Ультрафиолетовое облучение убивает споры и бактерии и другие формы микроорганизмов. Так как озон, который образуется во время обработки, вреден для человека, то необходимо время для его разложения до кислорода. Поэтому стерилизацию помещения проводят заранее за 2-3 часа на протяжении 0,5 часа (зависит от размеров помещения).
В качестве ламинарного бокса мы приспособили большую пластиковую коробку (в других источниках рекомендуют стеклянные аквариумы). Нам ламинарный бокс необходим для более стерильной работы и недопущения занесения бактерий и спор грибов потоками воздуха в питательную среду. Перед началом работы всю внутреннюю поверхность коробки протирали пропитанными спиртом салфетками, после чего включают УФ-излучение на 40 мин. Необходимо отметить, что спирт и ультрафиолет разрушающе действует на пластмассу, и как следствие такой ламинарный бокс в течение короткого срока придет в негодность из-за возникновения хрупкости, сколов, трещин и т.п.
При работе с растениями стерильность обеспечивается бактерицидной установкой в нашем случае Panasonic c угольным фильтром и с озонированием. Для работы нам потребуется одноразовые стерильные лабораторные халат, шапочка, руки обрабатываем спиртовыми салфетками и надеваем стерильные медицинские перчатки.
По общим биолабораторным правилам для стерилизации и бактерицидной обработки, лабораторную посуду и инструменты, который нам понадобятся для текущего эксперимента, необходимо определенным образом подготовить, чтобы дать возможность сохранить стерильность в течение некоторого времени. Подготовленные очищенные и мытые колбы, пробирки, стаканы, банки и металлический инструмент плотно закрывают алюминиевой фольгой, а сверх фольги - бумагу и надежно фиксируют. Время стерилизации в духовом шкафу – два часа при температуре 150°С.
Чистые просушенные пластиковые пробирки и другие пластиковые предметы помещают в металлическую кюветку заливается водой и ставят кипятиться на протяжении 30 минут под крышкой.
Стерилизация растворов из фитогормонов, витаминов и антибиотиков (и других нетермостойких растворов) мы не проводили, поскольку воспользовались только стерильными растворами, которые хранились в холодильнике, строго при определенных условиях.
Мы использовали одноразовые шприцы и одноразовые иглы, как инструмент для работы с семенами. Но в процессе работы инструменты дополнительно стерилизуют обжигом в пламени спиртовки. Каждый инструмент следует обжигать индивидуально и дают остыть в согнутом на пополам листе стерильной бумаги. Достаточный комплект инструментов составляет 2 скальпеля, 2 пинцета, 2 иглы.
Стерилизация растительного материала - не менее важный, а может быть и самый важный этап в подготовке выращивания растения in vitro. Основная цель такого воздействия - уничтожение патогенных микроорганизмов и грибов при этом нужно не повредить ткани растительного материала.
Для предварительной стерилизации нами использовался этиловый спирт 70° путем погружения растительного материала на несколько секунд.
Для поверхностной стерилизации растительного материала мы использовали средство «Доместос», содержащий активный хлор в виде гипохлорита натрия. Его разбавляли водой, готовя 10% раствор. Семена стерилизовались 10 минут, побеги льна стерилизовались в течение 5–8 минут.
У нас погибли растения только в одной банке в связи с инфицированием семян плесневыми грибами, которые мгновенно размножились в питательной среде, но это произошло только на 1 семечке из 20.
При возникновении внутренней инфекции растение изымалось из питательной среды, омервевшие части растения удалялись, растение выса
Подготовка питательной среды
По стандартам питательной среды Мурасиге-Скуга, вес компоненты для выращивания растительных клеток и тканей делятся на 2 главные группы: неорганические соединения – минеральные соли (макро- и микроэлементы), источники железа (в легко-усвояемой - хелатной форме) и органические соединения – источник углеводного питания (сахароза, а также наш краситель производное глюкозы), витамины (чаще всего используют В1, В6, РР и С), растительные экстракты. Дополнительно вводятся: фитогормоны – ауксины, цитокины и гиббереллины - для роста и дифференцировки любых растительных клеток необходимы.
Еще один компонент обязательный компонент, агар-агар – уплотняющее вещество, образующий с водой гель, необходимый нами для приготовления твердых питательных сред. В проекте in vitro применяли и жидкие среды (без добавления отвердителя) в нашем случае это удобно для выращивания взрослых растений. Кислотность питательной среды является важным фактором, определяющим эффективность культивирования и вегетации растения. Неоправданно высокий или заниженный уровень pH приводит к тому, что среда плохо застывает и не обеспечивает необходимую пространственную ориентацию растений и оптимальный ионно-протонный обмен.
Нами был подготовлена рецептура питательной среды более всего подходящей для выращивания растений - Мурасиге-Скуга, имеющим аббревиатуру «MS». Рецептура [14] подразумевала подготовку концентрированных (так называемых маточные) растворы макро- и микросолей, источников железа и кальция, а также рабочие растворы фитогормонов и витаминов.
Приготовление питательной среды (в отличие от общепринятого порядка – п.1 и п.2 нагреваются одновременно поскольку это нестерильные составляющие, остальные составляющие в нашем варианте стерильные):
Необходимое количество агара (исходя из нормы 7 гр. на литр на конечный объем раствора) помещают в термостойкий стакан с дистиллированной водой (половина объема среды) на 10-15 мин для набухания.
Навески сухих веществ: сахарозы растворяют в небольшом количестве воды и смешивают с раствором агара.
Затем нагревают до кипения и до полного растворения агара.
В стакан с небольшим количеством дистиллированной воды добавляют необходимый объем маточных растворов минеральных солей, рабочих растворов витаминов.
Объединяют полученный раствор с остывшим расплавленным агаром, переливают в мерный цилиндр и доливают дистиллированной водой до конечного объема.
Добавляют фитогормонов исходя из норм.
Затем измеряют рН раствора прибором или лакмусовой бумагой и доводят его до нужного значения, добавляя по каплям 1М раствор NаОН или НСl.
Все термонеустойчивые добавки брались стерильными и вводились в уже остывшую среду в стерильных условиях ламинарного бокса. В случае использования не стерильных солей, они стерилизовались доведением до кипения.
Высев семян. Создание оптимальных температурных и световых условий. Культивация растений.
После стерилизации семян, было необходимо отмыть семена от стерилизующих растворов 3 порциями стерильной дистиллированной воды. Поместить семена в стерильные чашки Петри на стерильную фильтровальную бумагу, чтобы удалить остатки промывочных вод. Подсушенные семена поместить в пробирки, на поверхность питательной среды.
Оптимальная освещенность для льна составляет 2500 лк. На первых этапах роста освещенность колеблется от 1000 до 3000 лк, в дальнейшем повышаясь до 5000 лк. Спектр света играет не менее важную роль. Разные цвета спектра по-разному влияют на то или иное развитие морфогенеза. Синий свет - это основной компонент морфогенеза. Красный свет необходим для образования побегов, образования почек, укоренения. При изучении влияния длины дня на рост и развитие клеточных культур по разным источникам установлено, что наиболее подходящий период смены день/ночь для большинства видов растений в стерильной культуре составляет 16/8 часов. Нужно отметить, что данные показатели оказались оптимальными только для не флуоресцентных растений. Наличие флуоресцентных красителей в большой концентрации при полноцветном освещении развивались очень не стабильно, неравномерные листья с различными патологиями развития (расслоение и раздвоения листьев, изменение структуры листьев и стебля, остановка развития) было сделано предположение о влиянии флуоресцента на развитие растения, и после исследования источников света, они были заменены на LED источники теплого света (как имеющие наименьший по энергии спектр для входящего спектра флуоресцентных красителей).
Культивирование обычно осуществляют при температуре в интервале 21-27°С днем (за счет источников света) и 18-23°С ночью. Растения выращивают в стеклянных колбах, пробирках, банках, герметично закрываемые крышками или пленкой «Парафильм».
Первоначально наши растения, частично выращенные в гидропонике либо выращенные in vitro, помещались в жидкий раствор питательной среды, где на каждые 5 долей количества молекул глюкозы приходились 1 доля красителя в пересчете также на молекулы глюкозамина без гелеобразующих добавок (агара) на 5-7 дней с целью проверки происходящих процессов. Просто карбоксифлуоресцеин, добавленный в среду, не приводил ни к каким изменениям окраски. Но при добавке именно флуоресцентного глюкозамина наблюдалось изменение окраски. Что подтвердило наши первоначальные предположения. И уже в дальнейшем при выращивании растений in vitro и ex vevo флуоресцентный глюкозамин будет вводиться в питательные среды.
Более подробно этапы роста описаны в дневнике наблюдений.
Выращивание льна. Получение волокон.
Льняное волокно (лубяное волокно) – волокно, получаемое из стебля льна. Льняное волокно различается по длине примерно от 2,5 см. до 15 см. и в среднем 15 мкм в диаметре.  Льняные волокна обычно идентифицируются их «узлами», которые добавляют к гибкости и текстуре ткани.
Качество готового льняного волокна зависит от условий выращивания. Чтобы получить самые длинные волокна стебли срезают очень близко к корню и в дальнейшем растения высушиваются. Затем волокна должны быть отделены от стебля, для этого их сначала замачивают. Это процесс, использующий действие микроорганизмов и влаги на растениях для растворения или гниения большей части клеточных тканей и пектинов, окружающих пучки льняных волокон, с целью облегчения отделения волокна от стебля. Существуют также методы химического отделения; они быстрее, но, как правило, более вредны для окружающей среды и для самих волокон.
Но до получения волокна, растение необходимо вырастить. Жизненный̆ цикл высших растений состоит из ряда периодов, характеризующихся качественными изменениями биохимических реакций, физиологических функций и органообразовательных процессов. Для льна культурного принято различать шесть основных фаз роста: всходы, елочка, быстрый рост, бутонизация, цветение, созревание. В среднем вегетационный̆ период льна-долгунца составляет 75–90 дней̆.
С точки зрения наших экспериментов особое внимание необходимо уделить корневой системе льна: так хотя лен, выращенный в земле, и обладает стержневым корнем, имеющим длину один метр, и более, с большим количеством боковых ветвлений и корней. Но его толщина, как и толщина боковых корней и ветвлений очень мала, в результате лен имеет много проблем, связанных с полеганием культуры в обычных условиях, а в наших же экспериментах необходимо уделить особое внимание его закреплению, особенно в гидропонике, поскольку корневая система не будет этому особенно способствовать.
Результатом выращивание являются полученные волокна, которые обладают флуоресцентным эффектом.
Экстракция и гидролиз FAM-GLKZMN из растения.
Цель экстракция из растения всех водорастворимых (спирторастворимых) соединений, в том числе из клеток, с целью получения водонерастворимых остатков растений, и дальнейший гидролиз растений в кислоте с целью получения в растворе (или в осадке) FAM-GLKZMN. Данный эксперимент доказывает, что полученное вещество находится в сцеплении со молекулами целлюлозы. При этом доказательством разрушения клеточных мембран является отсутствие хлорофилла и других органических растворимых в остатке п.8.
Экстракция осуществлялась по следующей методике:
1. Выращивалось растение в растворе FAM-GLKZMN, второй в питательной среде 5(6)-FAM в течении 3-х недель
2. Бралось 5 гр растения из п.1 мелко измельчалось в ступке до состояния мелкой пульпы, заливалось дистиллированной водой в количество 100мл, настаивалось 24 часа, нагревался до кипения, кипятился, сливался, отделялся не растворимый остаток. Данная процедура повторялась еще раз. Аналогично проводилась процедура со спиртом. Повторялась. Данные процедуры должны были привести к разрыву части клеток из-за эффекта осмоса, растворимости органических веществ в спирте. Для экстракции водорастворимых остатков.
3. Сухой остаток вносился в коническую колбу вместе с дистиллированной водой в количестве 200 мл, кипятился в течении 60 минут. Нерастворимый остаток отделялся с помощью фильтрования. Повторялось. С целью разрыва клеточной мембраны. Для экстракции водорастворимых остатков.
4. Сухой остаток вносился в 1М раствор NaOH, кипятился 10 мин. Повторялось 2 раза.
5. Метод основан на способности хлорофилла и других пигментов под действием горячего спирта переходить в раствор, при этом хлорофилл при взаимодействии со спиртом превращается в этилхлорофиллид – сложный эфир, в котором остаток фитола замещен остатком этилового спирта. Растительный нерастворимые остатки с 5,0 мл этилового спирта, переносят в пробирку и нагревают на водяной бане при 90-100˚С до закипания спирта. Содержимое фильтруют через бумажный фильтр. Фильтрат, содержащий хлорофиллид, ксантофилл и другие пигменты, имеет зеленый цвет с интенсивной красной флюоресценцией. Его используют для исследования.
5. Сухой остаток вносился в вакуумный сосуд, создавалось разряжение до 0,07 Па в течении 30 мин. Повторялось. С целью разрыва клеточной мембраны.
6. Сухой остаток вносился в коническую колбу вместе с дистиллированной водой в количестве 200 мл, кипятился в течении 60 минут. Нерастворимый остаток отделялся с помощью фильтрования. Повторялось.
7. Сухой остаток вносился в коническую колбу вместе с дистиллированной водой в количестве 200 мл, кипятился в течении 60 минут. Раствор отфильтровывали от водонерастворимого осадка проводили качественные реакции Фелинга (с сульфатом меди), серебряного зеркальца, с йодом (на крахмалы) и др. на наличие различных углеводов. Реакции показали полное отсутствии данных веществ в растворе. В ультрафиолете тоже отсутствует окрашивание. (И это для обоих растений).
8. Сухой остаток после п.7 имеет флуоресценцию, то есть в нем остался - FAM-GLKZMN, второе растение - остатки не флуоресцируют.
Далее растения подвергалось гидролизу:
Сухой остаток подвергался гидролизу в концентрированной соляной кислоте (41%) 5 мл. Далее кислота гасилась по капельным введением раствора NaOH, один их двух растворов показал флуоресценцию, то есть в нем присутствует флуоресцент, который не был ранее водорастворимым. Растение с 5(6)-FAM в виде остатков и раствора не обладает флуоресценцией после данной экстракции.
Аналитические исследования: далее проводились ТСХ для раствора, содержащего флуоресцент, данный флуоресцент выделялся и получали 1H ЯМР спектр вещества, который подтвердил наличие FAM-GLKZMN в данном растворе, что подтвердило цель поставленную при проведении данного исследования о сцеплении FAM-GLKZMN и целлюлозы.
Результаты и их практическое применение Осуществлен органический синтез следующих веществ: 5(6) карбоксифлуоресцеин, тетрайодкарбоксифлуоресцеин натрия – 5(6) карбоксиэритрозин, дихлоркарбоксифлуоресцеин, FAM-GLZMN (соединение 5(6)-карбоксифлуоресцеина и глюкозамина), FAM-GLKAMA (соединение 5(6)-карбоксифлуоресцеина и глутаминовой кислоты). А также новый класс фотоинсектицидов – FAM-GLZMN (соединение 5(6)-карбоксифлуресцеина и глюкозамина), FAMI-GLZMN (соединение 5(6)-карбокситетрайодфлуоресцеина и глюкозамина), FAMCL-GLZMN (соединение 5(6)-карбоксидихлорфлуоресцеина и глюкозамина). Получение данных веществ подтверждено аналитическими исследованиями (спектр поглощения и эмиссии флуоресцентов, ТСХ, электрофорез, 1H ЯМР спектрами)
Выход составил: 77% от теретического для 5(6) карбоксифлуоресцеина, 92%/94% при разделении изомеров 5-FAM и 6-FAM, 47% для FAM-GLKZMN.
Доказано биологическое сцепление молекул FAM-GLKZMN и целлюлозы.
Получен ы биологические волокна льна с новыми физико-химическими свойствами, а именно с эффектом флуоресценции. Данные ткани могут применяться при изготовлении тканей с флуоресцирующим пожизненным эффектом, связанным с встраиванием флуоресцентных компонентов на всю глубину волокна, и их химическая связь с молекулами волокна. Поэтому ни механическое, ни химическое не смогут убрать флуоресцентное окрашивание, и лишь полное механическое влияние, либо расщепление волокна на целлюлозные цепочки (что эквивалентно уничтожению волокна) возможно обесцвечивание волокна. Флуоресцирующие ткани имеют многочисленное применения: это и дизайн одежды, безопасность на дорогах в одежде из данной ткани, в темное время суток, элементы одежды МЧС, спасательных жилетов и одежды дорожных служб и МЧС, спортсменов. И имеет значительно более долгосрочный характер, чем данные элементы, полученные окраской или прокраской, а также более экологичные по сравнению с полимерными изделиями (флуоресцентные пленки и другие полимеры).
В дополнение, подготовлена методика, позволяющая соединять карбоксильные или аминовые группы различных соединений с глюкозамином, или с другими веществами, имеющими первичные амины.
Получены новые фотоинсектициды, встраиваемые в оболочку клетки, активирующиеся от солнечного света, с большой долей вероятности малотоксичные для пчел и человека, являющиеся естественной приманкой из-за присоединения к производному глюкозы. Показана высокая действующая сила.
Автором продолжаются эксперименты в следующих областях, имеющих расширение к теме проекта:
В качестве замены флуоресцеина могут выступать такие соединения, как соли-хеллаты лантаноидов например диспрозия, европия, самария, обладающие ферро-магнитными свойствами и придающие такие-же свойства тканям, соединения хемилюминесцентов – красителей, изменяющих окраску при различных температурах, люминофоров – оптические эффекты, иные красители, являющиеcя маркерами каких-то определенных состояний и реагирующих на определенные химические и биологические структуры: химическое загрязнение, радиационное загрязнение, гормональные и химические изменение покровов кожи и т.п. В этой части эксперименты продолжаются.
Применение данной методики в сельском хозяйстве, а именно адресная доставка фунгицидных, противовирусных, противобактериальных и инсектицидных моно- и комбинированных препаратов путем присоединения этих молекул к глюкозамину. Автором проводятся исследования по созданию инсектицида против тли.
Использование данных флуоресцентов, особенно при разделении карбоксифлуоресцеина, и получение моноизомерных флуоресцентов (имеющим определенный спектр флуоресценции) производных глюкозы позволит изучать более подробно транспортные системы растений. Отдельно стоит упомянуть аминокислоты и другие производные сахаров с аминными группами – хитозан и глутаминовую кислоту, и другие, которые могут выступать в качестве переносчика различных дополнительных химических соединений в растении в различные его части по типу глюкозамина.
Применение данного подхода для многолетних растений позволяет создавать биологические системы контроля окружающей среды – растение будет изменять окраску, при наличии тех или иных факторов – наличие неблагоприятных факторов, загрязнения.
Изучение гасителей флуоресценции и их применение для деактивации фотоинсектицидов.
Дальнейшее изучение фотосенсибилизаторов и UV-излучения, рассмотрение вопросов их применения для организованной мутации растений, с целью получения мутировавших растений с приобретенными (развитыми) новыми свойствами.
С более подробной информацией об этой работе(наиболее полной версией), фотоотчетами, расчетами и дневниками наблюдений и другими работами автора Вы можете ознакомиться на сайте автора: https://sites.google.com/site/biochemistrymoscow/
https://sites.google.com/site/biochemistrymoscow/sozdanie-fluorescentnyh-volokon-lna
Использованные источникиСайт (англоязычный) компании Glowing Plants на сайте венчурных проектов KICKSTARTER https://www.kickstarter.com/projects/antonyevans/glowing-plants-natural-lighting-with-no-electricit
Общая генетика растений Том 1 Генетические основы селекции растений под редакцией А. Кильчевский,Л. Хотылева
Ганс-Вальтер Хелдт «Биохимия растений» Бином, М. 2011
Физер Л., Физер М., «Органическая химия. Углубленный курс в 2-х томах» т.1 и т.2
С.Н.Тимофеева, Ю.В.Смолькина Технология размножения in vitro. Методическое пособие СГУ,2016
Принципы и методы биохимии и молекулярной биологии под редакцией К.Уилсона, Дж. Уолкера, Бином - М. 2015
Лобанова Л.П. Методы культивирования тканей и органов растений in vitro: учебн. метод. пособие для студ. и асп. биол. фак. – Саратов: изд-во Сарат. университета, 2004.
Н.О. Мчедлов-Петросян. Флуоресцеиновые красители в растворах – хорошо изученные системы? Университет-200 Химический факультет-110 2004
И. Бертини «Биологическая неорганическая химия» Структура и реакционная способность. т.1 и т.2. Бином, М.2017
Improved Synthetic Procedures for 4,7,2‘,7‘-Tetrachloro- and 4‘,5‘-Dichloro-2‘,7‘-dimethoxy-5(and 6)-carboxyfluoresceins Matthew H. Lyttle,*Tim G. Carter, andRonald M. Cook Biosearch Technologies, Inc., 81 Digital Drive, Novato, California 94949, U.S.A. Org. Proc. Res. Dev., 2001, 5 (1), pp 45–49
Preparation of 5- and 6-Carboxyfluorescein Yuichiro Ueno, Guan-Sheng Jiao, Kevin Burgess* Department of Chemistry, Texas A & M University, P.O. Box 30012, College Station, Texas 77842. Fax: 979-845-8839. E-mail: [email protected]
Thermo Scientific NHS, Sulfo NHS Instructions 2011
Hermanson G. Technics of bioconjugates. Royal Society of Chemistry, 2012
Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures// Physiol. Plant. 1962. V. 15.
NHS and Sulfo-NHS. Instructions. Thermo Scientific. Pierce Biotechnology Corp. Thermo Fisher Scientific Inc. 2017
A Nanobionic Light-Emitting Plant - Seon-Yeong Kwak, Juan Pablo Giraldo, Min Hao Wong, Volodymyr B. Koman, Tedrick Thomas Salim Lew, Jon Ell, Mark C. Weidman, Rosalie M. Sinclair, Markita P. Landry, William A. Tisdale, and Michael S. Strano - Department of Chemical Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 77 Massachusetts Aveue, Cambridge, Massachusetts United States - Department of Botany and Plant Sciences, University of California, 3401 Watkins Drive, Riverside, California United States - Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of California, 201 Gilman Hall, Berkeley, California United States - Nano Lett., 2017, 17 (12), pp 7951–7961 DOI: 10.1021/acs.nanolett.7b04369 Publication Date (Web): November 17, 2017 American Chemical Society
Сellulose fibers with tailored properties - Filipe Natalio, Regina Fuchs, Sidney R. Cohen, Gregory Leitus, Gerhard Fritz-Popovski, Oskar Paris, Michael Kappl, Hans-Jürgen Butt, - Science «15» September 2017: Vol. 357, Issue 6356, pp. 1118-1122 DOI: 10.1126/science.aan5830
Peter Bamfield. Chromic Phenomena. The technological applications of colour chemistry. The Royal Society of chemistry, 2001.Conjugation of 5(6)-carboxyfluorescein and 5(6)-carboxynaphthofluorescein with bovine serum albumin and their immobilization for optical pH sensing Sarka Bidmanova, Antonin Hlavacek, Jiri Damborskya, Zbynek Prokopa, Elsevier, Senesors and Actutators B 2012 96-99
Sunlight-activated insecticides: historical background and mechanisms of phototoxic activity Thameur Ben Amor, Giulio Jori, Elsevier, Insect Biochemistry and Molecular Biology 30 (2000) 915–925
С более подробной информацией об этой работе, фотоотчетами, расчетами и дневниками наблюдений и другими работами автора Вы можете ознакомиться на сайте автора: https://sites.google.com/site/biochemistrymoscow/
https://sites.google.com/site/biochemistrymoscow/sozdanie-fluorescentnyh-volokon-lna
Приложение 1. Полученные растения, волокна и соединения (Фото автора)Флуоресцентное растение (крупно) – в ультрафиолетовом свете


Растение в УФ свете в питательной флуоресцентной жидкости (FAM-GLKZMN) Флуоресцентное растение в УФ

Растение в обычном свете в питательной флуоресцентной жидкости Растение в УФ свете в питательной флуоресцентной жидкости (FAM-GLKZMN)

Флуоресцентное растение в дневном свете Флуоресцентное растение в УФ

Распространение FAM-GLKZMN в структуре листа (Микроскоп) +24 часа Распространение FAM-GLKZMN +48 часов в структуре листа (Микроскоп)

Обычный лист (Микроскоп) Распространение FAM-GLKZMN +8 часов в структуре листа (Микроскоп)

Распространение FAM-GLKZMN +8 часов в структуре листа (Микроскоп) Распространение FAM-GLKZMN в структуре листа (Микроскоп)

Хромотографическая колонка в процессе с препаратом Срез стебля флуоресцентного льна (микроскоп)
-622301587500
Растения в гидропонике Растения выращиваемые в питательной среде и в FAM-GLKZMN

Лен выращенный в пробирке, стерильная среда, 6 день Лен в пробирке (7 см) – 21 день

Преломление, отражение лазерного луча от верхнего свода воды Растворение флуресцента в водной и маслянной среде, изучение преломления трех сред воздух-масло-вода

Полученные вещества и волокна (слева-направо): FAM-GLKZMN, волокна, 5(6)-FAM, флуоресцеин, флуоресцеин натрия Мушки в пакете на окне

5(6)карбокситетрайодфлуоресцеин (красный), 5(6)карбоксидихлорфлуоресцеин (желтый) в ультрафиолетовом свете Дихлоридфлоуресцеин, тетрайодфлуоресцеин, 5(6)-карбокситетрайодфлуоресцеин в ультрафиолетовом свете

Результаты: FAMCL, FAMI, FAMCL-GLKZMN, FAMI-GLKZMN, FAM-GLKMN Результаты: FLOUSCL, FLOUSI, FAMI, FAMI-GLKZMN, FAM-GLKMN

Светимость промытых в воде и просушенных волокон льна Светимость полученных волокон
Приложение 2. Расчеты по проекту (интенсивности флуоресценции в зависимости от типа ламп, расчеты хромотограмм и спектров)Расчет №1. Хромотограмма гельпроникающая для раствора с FAM-GLKZMN
Первичные данные по хромотографии
№п.п фракции Время, мин Масса р-р, гр Масса р-р -, гр Масса FAM, гр Масса FAM-, гр
1 5 0,65 0,07 0,66 0,01
2 10 0,84 0,24 0,80 0,15
3 15 0,54 - 0,69 0,03
4 20 0,50 - 0,65 -0,00
5 25 1,03 0,53 0,65 -0,01
6 30 0,96 0,44 0,65 -0,01
7 35 0,91 0,38 0,67 0,02
8 40 0,91 0,36 0,68 0,03
9 45 0,83 0,26 0,70 0,04
10 50 0,78 0,20 0,74 0,09
11 55 0,66 0,06 0,97 0,32
12 60 0,98 0,36 1,02 0,37
13 65 0,51 - 0,99 0,34
14 70 0,67 0,04 0,85 0,20
15 75 0,96 0,46 0,78 0,13
16 80 0,91 0,39 0,73 0,08
17 85 0,85 0,32 0,71 0,05
18 90 0,85 0,30 0,70 0,04
19 95 0,77 0,20 0,68 0,03
20 100 0,78 0,20 0,68 0,03
21 105 0,66 0,06 0,67 0,02
22 110 0,60 - 0,66 0,01
23 115 0,48 - 0,66 0,01
24 120 0,66 0,16 0,66 0,01
25 125 0,75 0,23 0,66 0,01
26 130 0,72 0,19 0,66 0,01
27 135 0,71 0,16 0,66 0,01
28 140 0,68 0,11 0,66 0,01
29 145 0,50 - 0,66 0,01


Расчет №2. Расчет оценки мощности поглощения флуоресцентом энергии от различных источников света
Спектр поглощения и эмиссии флуоресцеина
Длина волны Поглощение Эмиссия
200 20% 220 48% 240 40% 260 25% 280 27% 300 15% 320 21% 340 8% 360 4% 380 4% 400 4% 420 8% 440 28% 460 56% 1%
480 96% 3%
500 80% 72%
520 16% 96%
540 2% 48%
560 1% 26%
580 10%
600 4%
620 3%
640 2%
660 1%
680 700
Спектр света различных источников
Длина волны Дневной свет Лампы накаливания Люминисцентные лампы Галогеновые LED Холодный свет LED Теплый свет
200 5% 220 8% 240 10% 260 13% 280 15% 300 18% 0% 320 20% 2% 340 30% 4% 360 45% 6% 0% 0% 380 60% 8% 2% 1% 400 70% 10% 4% 2% 1% 0%
420 78% 15% 2% 5% 50% 1%
440 98% 20% 25% 7% 100% 3%
460 98% 25% 4% 10% 75% 4%
480 94% 30% 15% 25% 50% 6%
500 90% 35% 4% 40% 30% 8%
520 87% 40% 4% 60% 40% 40%
540 84% 45% 2% 80% 50% 65%
560 81% 50% 95% 82% 50% 95%
580 78% 55% 2% 93% 40% 88%
600 75% 60% 10% 100% 30% 80%
620 72% 65% 100% 90% 20% 65%
640 70% 70% 15% 90% 15% 50%
660 67% 75% 4% 78% 10% 35%
680 65% 77% 3% 70% 7% 20%
700 62% 80% 2% 60% 3% 10%

Оценочная мощность поглощения энергии от различных источников при переходе флуоресцеина в синглетное состояние
Дневной свет Лампы накаливания Люминесцентные Галогеновые LED Холодный свет LED Теплый свет
24% 12% 10% 9% 27% 4%

Выводы: Энергетика флуоресценции будет минимальна у LED “Теплый свет» и составит от 20% до 50% по сравнению с другими вариантами источников.
Расчет №3. Сравнительный анализ спектров поглощения и эмиссии образца с полученным прапаратом 5(6) FAM и эталонными значениями.
Фрагмент данных полученных при измерении и полученных из базы данных как эталонные с сайте flourophores.org (полностью все данные автора можно получить по адресу в интернете: https://docs.google.com/viewer?a=v&pid=sites&srcid=ZGVmYXVsdGRvbWFpbnxiaW9jaGVtaXN0cnltb3Njb3d8Z3g6NDcyNTQ2YTZjNjE0NGRhMQ )
Эталон Поглощение Эмиссия Остальные параметры
Λmax λmax Solvent
322 nm, 493 nm 514-515 nm TRIS 10 mM PH 9.00
Instrument Instrument Temperature
Varian Carry 50 Bio Perkin Elmer LS 50 B 25.00° C
http://www.fluorophores.tugraz.at/substance/14www.fluorophores.orgСпектр с образца был получен:
Образец Поглощение Эмиссия Остальные параметры
Λmax λmax Растворитель
321 nm, 492 nm 515 nm THAM(TRIS) 10 mM PH9.0
Инструмент Инструмент Температура
Shimadzu UV-1800 Perkin Elmer LS 55 22 °C
Частота поглощения/эмиссии (nm) Нормализованное поглощение (эталона) Нормализованная эмиссия (Эталона) Нормализованное поглощение (образца) Нормализованная эмиссия (Образца) Отклонение Поглощения Отклонение эмиссии
300 0,1064 0,1007 0,0000 0,0057 0,0000
301 0,1035 0,0975 0,0000 0,0060 0,0000
302 0,1008 0,0983 0,0000 0,0025 0,0000
303 0,0984 0,0891 0,0000 0,0093 0,0000
304 0,0961 0,0888 0,0000 0,0073 0,0000
305 0,0947 0,0856 0,0000 0,0091 0,0000
306 0,0939 0,0883 0,0000 0,0056 0,0000
307 0,0933 0,0896 0,0000 0,0037 0,0000
308 0,0934 0,0919 0,0000 0,0015 0,0000
309 0,0936 0,0898 0,0000 0,0038 0,0000
310 0,0949 0,0956 0,0000 -0,0007 0,0000
311 0,0961 0,0955 0,0000 0,0006 0,0000
312 0,0975 0,0985 0,0000 -0,0010 0,0000
313 0,0994 0,0999 0,0000 -0,0005 0,0000
314 0,1024 0,1021 0,0000 0,0003 0,0000
315 0,106 0,1036 0,0000 0,0024 0,0000
316 0,109 0,1121 0,0000 -0,0031 0,0000
317 0,1121 0,1114 0,0000 0,0007 0,0000
318 0,1163 0,1195 0,0000 -0,0032 0,0000
319 0,1205 0,1203 0,0000 0,0002 0,0000
320 0,1238 0,1245 0,0000 -0,0007 0,0000
321 0,1258 0,1237 0,0000 0,0021 0,0000
322 0,1277 0,1249 0,0000 0,0028 0,0000
323 0,1286 0,1280 0,0000 0,0006 0,0000
324 0,128 0,1200 0,0000 0,0080 0,0000
325 0,1265 0,1186 0,0000 0,0079 0,0000

Выводы: Среднее отклонение 0,1%, максимальное отклонение 3%, частоты пиков совпадают, эталон и образец совпадают по частотатм эмиссии и флуоресценции, следовательно это одинаковые вещества. Погрешность может быть объяснена разницей температур измерения, разницей чистоты препаратов и различным соотношением изомеров.
Расчет №4. Анализ ТСХ FAM-GLKZMN, 5(6)-FAM, FLOUS (флуоресцеин натрия), смесь FAM-GLKZMN+5(6)-FAM.
ТСХ пластина: Merck Silica Gel 60 аналитические 0,25мм (препаративные 2мм) 20*20 на алюминиевой основе.
Элюент: 33.3% ацетон, 33.3% изопропиловый спирт, 33.3% толуол.
Фото ТСХ пластины:

Описание:
df= 92 Мм
№ п.п Препарат Фракция Расстояние пройденное веществом от старта, da, мм Ширина w, мм Подвижность, Rf Количество теоретических тарелок, N Высота тарелки, H, мм Коэффициент емкости, k'
1 FAM-GLKZMN 1 16 3,5 0,174 84 0,10 4,700
2 5(6)-FAM 1 62 5 0,674 973 0,04 0,480
3 FLOUS 1 87 10 0,946 1 211 0,07 0,057
4 FAM-GLKZMN +5(6)-FAM 1 12 2,5 0,131 125 0,06 6,633
2 60 4 0,652 1 225 0,03 0,533
Выводы: Четко разделены вещества по размерам молекул, у смеси два составляющих также выделены, показаны соответствие эталонным значения подвижности фракций образца смеси. Что свидетельствует о том, что полученный молекулы флуоресцент FAM-GLKZMN больше чем молекулы 5(6)-FAM либо по крайней мере отличны от них.

Расчет №5. Электрофорез в ПААГ.
Неподвижная среда: Полиакриламид гель
Буффер: додецилсульфат натрия (ДДС-Na)
Время экспозиции: 120 минут
Номер точки Содержимое (предполагаемое) Расстояние от начала,мм Молярные массы, гр/моль Расчетная величина молярной массы, гр/моль
№1 FAM-GLKZMN ? 39 552
№2 5(6)-FAM 65 374 №3 FLOUS 72 326 Расчетная величина 552 гр/моль(=374+(326-374)*(39-65)/(72-65)) очень похожа на молярную массу прогнозируемую 537 гр/моль, погрешность составляет около 3%.


Расчет №6. Сравнение спектров ЯМР 1H FAM-GLKZMN с эталонными спектрами 5-FAM, 6-FAM, Глюкозамина.
Спектры эталонов были получены:
Глюкозамин: University of Wisconsin-Madison, Biological Magnetic Resonance Data Bank
http://bmrb.wisc.edu
5-FAM,6-FAM: Sigma-Aldrich Spectral Viewer with Aldrich Library of NMR Spectra, Merck https://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z110000?lang=en&region=RU
Выводы: Полученные спектры свидетельствуют о том, что данное вещество является производным FAM и Глюкозамина.

Черный Глюкозамин, розовый 5-FAM

Черный Глюкозамин, розовый FAM-GLKZMN

Черный Глюкозамин, розовый 6-FAM

Расчет №7. Расчет предельных концентраций
При применении данных препаратов, была показана высокий процент гибели растений, как показано было в работе это связано прежде всего именно с флуоресцентными свойствами растений.
Первоначальная методика поиска предельной концентрации увеличением ежедневным процентной концентрации раствора, давал лишь ответ о концентрации раствора для 2-3 дневной гибели растения, но не давал ответа на вопрос на естественное развитие растения, давая для жизни растения до 14 дней (при появлении заметной черной сетки на всем растении, свидетельствующем о гибели клеток.), лишь 2 экземпляра смогли достичь 100 дневного возраста при соотношении раствора 4:250. И лишь при изменении системы освещения (вместо спецламп для парниковых растений замена на лампы «теплый» свет, либо без ламп - на сумрак, но с введением жидкого питательного раствора) стало возможным говорить о получении достаточных концентраций для окраски растений и волокон, при сохранении жизнеспособности растений. Из 40 растений лишь 6 растений смогли дойти практически до конца развития (80 см высоты, 3 мм стебель).
Как было подсчитано, концентрация раствора составляла около 2 гр на литр, после хроматографии гельпроникающей при выделении флуоресцирующей фракции, составила 1,48 гр на литр. Этим раствором мы и пользовались при введении в питательную среду.
Выборка части экспериментов:
Номер растения Возраст Питательная среда №эксперимента Результирующая концентрация раствора (введенный объем на объем среды) Описание через2-3 дня
5
in vitro 30 дней MS 1 0,1:4 Нормальный зеленый цвет
2 0,5:4 Стало флуоресцентным, завяли маленькие листочки через 2 дня, через 5 дней растение погибло
7
in vitro 37 дней MS 1 0,1:4 Нормальный зеленый цвет
40 дней MS 2 0,2:4 Флуоресцентный стебель, желтовато-зеленое неонового цвета в целом растение
43 дней MS 3 0,3:4 Отсутствует развитие, увядающее, гибель
9
in vitro 48 дней MS жидкое 1 1:50 Нормальный зеленый цвет
51 дней MS
жидкое 2 2:50 Начали увядать нижние листки, цвет растения желтый
54 дней MS жидкое 3 2:50 Не развивается
57 дней MS жидкое 4 3:50 Гибель растения
13
ex vevo 54 дней вода 1 0:250 Растение зеленое
57 дней MS Light 2 4:250 Растение зеленое
60 дней MS Light 3 4:250 Стебель флуоресцирует, листья нет
63 дней MS Light 4 4:250 Стебель флуоресцирует, листья нет
66 дней MS Light 5 4:250 Стебель флуоресцирует, листья нет
69 дней MS Light 6 4:250 Стебель флуоресцирует, листья флуоресцирует
72 дней MS Light 7 4:250 Стебель флуоресцирует, листья флуоресцируют
75 дней MS Light 8 4:250 Стебель флуоресцирует, листья флуоресцируют
… 100 дней MS Light 4:250 Стебель флуоресцирует, листья флуоресцируют, разрезано, высушено, волокна флуоресцируют
17
ex vevo Выводы: при дневном свете (или специальных ламп для парниковых растений, гидро- и аэропонных культур) концентрация допустимая в питательной среде 23 мг на 1 литр раствора
При освещении с помощью LED «Теплый свет» или в сумраке на питательной среде концентрацию можно повышать до 0,48 гр на литр.

Приложение 3. Описание операций и их механизма при использовании биоконъюгации для создании FAM-GLKZMNМетод, используемый в образовании биоконъюгата, основывается на взаимодействии активированного эфира с амином с образованием амидной связи. Амином в этой реакции является глюкозамин, а активированный эфир нужно получить. EDC – сшивающий агент, который реагирует только с карбоксильной группой. EDC для его активации требуется pH 4-6, поэтому используется буфер MES, который взаимодействует с NHS c образованием Sulfo-NHS. При взаимодействии EDC c 5(6)-FAМ образуется О-ацилизомочевина – нестабильное соединение, которое быстро гидролизуется, поэтому его взаимодействие с амином маловероятно. В основании этой реакции лежит электрофильное присоединение. Для того, чтобы образовать активированных эфир необходимо О-ацелизомочевину связать с Sulfo-NHS – тоже специфический сшивающий агент, реагирующий только по карбоксильной группе и образуется суксинимидил эфир и pH становится >7. Механизм этой реакции – нуклеофильное замещение. В дальнейшем, эфир взаимодействует с амином с образованием биоконъгата – нуклеофильное замещение.1.Реакция карбоксифлуоресцеина с 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид (EDC)
-59055000 +
= -654052476500
C21H12O7 + C8H17N3 HCl = C29H29N3O7 HCl 5(6)-Карбоксифлуоресцеин 1-этил-3- (3-диметиламинопропил) карбодиимид гидрохлорид (EDC) O-ацилизомочевина эфир (не стабильный компонент) 5(6) carboxyflourescein 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide О-acylisourea ester Реакция N-гидроксисук-цинимид (NHS) с 2-морфолино-этансульфоновая кислота (MES)
-292101841500 + -5715000 NaCl
= 2514603810000 C4H5NO3 C6H13NO4S C4H5NO6S- C6H13NOCl
N-гидроксисукцинимид (NHS) 2-морфолино-этансульфоновая кислота (MES) N-сульфо-гидроксисукцинимид (NHS) 2-морфолино-этанхлорная кислота
N-hydroxysuc-cinimid 2-morholino-ethansulfonic acid N-sulfo-hydroxysuccinimid 2-morholino-ethanсhlorine acid
2. O-ацилизомочевина эфир (не стабильный компонент) с Гидроксисукцинимидом (в т.ч. и гидратом и сульфонатом)
7620000 + 501655461000 = -17780000 -6540513843000
C29H29N3O7 HCl C4H5NO6S- C25H15NO12S- C8H19N3
O-ацилизомочевина эфир (не стабильный компонент) сульфо-гидроксисук-цинимид (NHS) Сульфо-NHS-карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфир N-[3-(диметиламино)пропил]-N'-этилимидоформамид
О-acylisourea ester sulfo-hydroxysuc-cinimid Sulfo-NHS-carboxyflourescein succynimidyl ester N-[3-(Dimethylamino)propyl]-N'-ethylimidoformamide
3*.O-ацилизомочевина эфир (не стабильный компонент) с Глюкозамином (редкая из-за нестабильности компонента но возможная)
-30480889000 + 692159906000
012255500
C29H29N3O7 HCl C6H13NO5 C27H23NO11 C8H19N3
O-ацилизомочевина эфир (не стабильный компонент) Глюкозамин 3',6'-дигидрокси-3-оксо-N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-2,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)оксан-3-yl]-3H-спиро[бензофуран-1,9'-ксантен]-6-карбоксамин (FAM-GLZMN) N-[3-(диметиламино)пропил]-N'-этилимидоформамид
О-acylisourea ester Glucosamine 3',6'-dihydroxy-3-oxo-N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-2,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]-3H-spiro[benzofuran-1,9'-xanthene]-6-carboxamide N-[3-(Dimethylamino)propyl]-N'-ethylimidoformamide
3. Сульфо-NHS-карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфир с Глюкозамином
-190512446000 + -698512382500 -419106286500
C25H15NO12S- C6H13NO5 C27H23NO11 C4H5NO6S-
Сульфо-NHS-карбоксифлуоресцеин сукцинимидил эфир Глюкозамин 3',6'-дигидрокси-3-оксо-N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-2,4,5-тригидрокси-6-(гидроксиметил)оксан-3-yl]-3H-спиро[бензофуран-1,9'-ксантен]-6-карбоксамин (FAM-GLZMN) сульфо-гидроксисук-цинимид (NHS)
Sulfo-NHS-carboxyflourescein succynimidyl ester Glucosamine 3',6'-dihydroxy-3-oxo-N-[(2R,3R,4R,5S,6R)-2,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-3-yl]-3H-spiro[benzofuran-1,9'-xanthene]-6-carboxamide sulfo-hydroxysuc-cinimid

Приложенные файлы

  • docx 6810959
    Размер файла: 4 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий