29. Особенности использования L-тирозин–аммоний-лиазы в технологии про-дуктов специального назначения / А.В. Дороганова, О.О. Бабич, А.Ю


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.

На правах рукописи









БАБИЧ

Ольга Олеговна




ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ

И
ПРАКТИЧЕСКАЯ
РЕАЛИЗАЦИЯ БИОТЕХНОЛОГИЙ
СПЕЦИАЛИЗИРОВАННЫХ
МОЛОЧНЫХ
ПРОДУКТОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

L

ФЕНИЛАЛАНИН

АММОНИЙ

ЛИАЗЫ




05.18.04


Т
ехнология мясных, молочных

и рыбных про
дуктов

и холодильных производств

03.01.06



Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)








Автореферат


диссертации на соискание ученой степени

доктора технических наук









Кемерово

2014

2
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном об
разовательном

учреждении высшего профессионального образования Кемеровский технологический

институт пищ
е
вой промышленности» (
ФГБОУ
ВПО КемТИПП»).


Научный консультант:

доктор технических наук, профессор,

лауреат премии Правительства РФ в области

нау
ки и те
х
ники

Просеков Александр Юрь
е
вич


Официальные оппоненты:

Храмцов Андрей Георгиевич

доктор технических наук, профессор, академик

Россел
ь
хозакадемии, заслуженный деятель науки РФ,

лауреат премии Правительства РФ


в области науки и те
х
ники
,

Федеральн
ое государственное автономное

образовательное учреждение высшего профессионального
образования 
Северо

Кавказский федеральный

университет
»
,
Институт живых систем,
к
афедра

Пр
и
кладная биотехнология», профессор

консультант


Петров Андрей Николаевич

док
тор технических наук, профессор
,

член

корреспондент

Россельхозакадемии, Государственное научное
учреждение Всероссийский научно

исследовательский
институт консервной и овощесушильной промышленности
Россельхозакадемии, директор


Гаврилов Гавриил Борисович


доктор
технических

наук,

з
аслуженный работник пищевой
индустрии

РФ
,

Государственное учреждение Ярославской

о
б
ласти Ярославский государственный институт качества
сырья и п
и
щевых продуктов
, директор


Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетно
е

образовательное учреждение высшего

профессионального образования Национальный

исследовательский Томский политехнический

университет»


Защита диссертаци
и состоится 26 мая 2014 г. в 10:
00 ч. на заседании диссертационн
о
го
совета Д 212.089.01 при ФГБОУ
ВПО Кемеровский технологический институт пищевой
промышленности» по адресу: 650056, г.

Кемерово, б

р Строителей, 47, 4

лекц. ауд., тел/факс:
(8

384

2) 39

68

88.


С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке и на официальном сайте ФГБОУ
ВПО Кемеровский
технологический институт пищевой промышленности»
(
www
.
ketipp
.
ru
).


С авторефератом можно ознакомиться на официальных сайтах ВАК Минобрнауки РФ
(
http
://
vak
.
e
.
ov
.
ru
) и ФГБОУ ВПО КемТИПП» (
www
.
ketipp
.
ru
)
.

Автореферат разослан 25 апреля 2014 г.


Ученый секретарь диссертационного совета




Кригер Ольга Владимиро
в
на



3
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА Р
А
БОТЫ


Актуальность работы.

П
ромышленно
е

про
изводство

продук
тов сп
е
циализ
ированного питания

жизненно необходим
о

больным в критических

и
хронических

состояниях
,
в т.ч.
при нарушении функции пищеварения.
Основ
у

таких продуктов, как правило,
составляют
гидролизаты белков с различной
степенью

гидролиза,
зачастую

являясь

единственно

возможн
ым средством

при
терапевтическом

воздействи
и
, обеспечивающ
е
м
полноценное развитие детей и
жизнедеятельность

взрослых

с различной патологией.

К
таким
патологиям

относится фенилкетонурия



наследственное
заб
о
левание
,

вызванное нарушением перехода фе
нилаланина (незаменимой амин
о
кислоты) в тирозин и приводящее к задержке психического развития и тяжелым
поражениям центральной нер
в
ной системы.

К
оличество фенилаланина в питании таких больных должно быть строго
нормировано с учетом возраста больного
,
что
,

как правило,
достигается

п
о
требл
е
нием специализированных продуктов
.
Одним из направлений получения
таких продуктов является использование
L

фенилаланин

аммоний

лиаз
ы

(
PAL
)
(
КФ
4.3.1.5)
, которая

катализирует реакцию обратимого дезаминирования
L

фенилаланин
а

до
безопасных
для организма
соединений
:
транс

коричной

к
и
слоты

и аммиака
.

PAL

является ключевым
продуктом
метаболизма фенилпропаноидов в
растениях и грибах, где вовлечена в биосинтез вторичных метаболитов (флав
о
ноидов, фуранокумаринов, компонентов клеточ
ный стенки) и существует в в
и
де множественных изоформ
. Она

обнаружена в активной форме

в водорослях,
актиномицетах,
12

видах базидиомицетов, разрушающих древесину. Среди
микроорганизмов, обладающих
PAL

активностью,
известны
некоторые шта
м
мы красных дрожжей

Rhootorua
,
Rhoosporiiu

и
Sporobooyces

и два
представителя актиномицетов


прод
у
центов митомицина
.


Данный фермент
находит применени
е и

как
продукт
самостоятельный в
терапии

и/
или диагно
стике

больных
фенилкетонури
ей
,
как

вспомогательный
в
производст
ве

продуктов питания специального назначения, а также в биотехн
о
логическом
производств
е

L

фенилаланина из транс

коричной кислоты
,

для
п
о
давлени
я

роста злокачественных клеток
, стимулирования роста растений и т.д.

Все
вышесказанное подтверждает
актуальность
работы
.

Степень разработанности.

Существенный в
клад в создание и освоение
технологии получения специализированных продуктов питания внесли

Г.Б.

Гаврилов, Н.Б. Гаврилова, В.И. Ганина, Н.И. Дунченко, И.А. Евдокимов,
В.
И
. Круглик, К.С. Ладодо, Л.А. Остроумов,

А.Н. Петров, В.О. Попов,

Г.Ю. Сажинов, В.А. Тутельян, В.Д. Х
аритонов
,
И.С. Хамагаева, А.Г. Храмцов
;

ферментного препарата
L

фенилаланин

аммоний

лиазы


В.И. Муштаев,

M
.
J
a
son

Мас
Dona
,
H
.
Oru
,
O
.
F
.
Rasussen
.


Разработка новых и усовершенствование су
ществующих технологий
п
о
лучения фермент
ного препарата

PAL

требует
нахождения новых
,

более инте
н
сивных источников его
сверхсинтеза
, что не
возможно без изучения генетич
е
ских особенностей уже известных продуцентов.
В базах данных ге
нетических

4
последовательнос
тей
(
EMBL

и
GeneBank
)
обнаружено

только
2
6

последов
а
тельн
о
стей генома микроорганизмов, обладающих
PAL

активностью
.

Поэтому
акт
у
альны
поиск

микроорганизмов, обладающих L

фенилаланин

аммоний

лиазной активностью,

на основе анализа
генетических последовательно
стей

их

генома
,

разр
а
ботка

техноло
гий

получения

и использования

L

фенилаланин

аммоний

лиазы

в

производстве
специализированных
молочн
ых

продукт
ов
.

Отдельные этапы работы выполнены в рамках:



ФЦП Научные и научно

педагогические кадры инновационной России
н
а 2009

2013 годы» по теме

Молекулярное клонирование и экспрессия гена
pa
, обеспечивающего биотрансформацию фенилаланина с целью разработки
технологии получения продуктов питания для лечения больных фенилкетон
у
рией
»
, г
о
сударственный контракт №

П1701;



Ф
ЦП Научные и научно

педагогические кадры инновационной России
на 2009

2013 годы» по теме

Разработка технологии получения продуктов п
и
тания для больных наследственными нарушениями аминокислотного обмена
»,

гос
ударственный

ко
н
тракт №

16.740.11.0239;




ФЦП
Научные и научно

педагогические кадры инновационной России
на 2009

2013 годы» по теме

Разработка альтернативных подходов получения
продуктов для больных наследственными нарушениями аминокислотного о
б
мена с использованием методов биоинформатики и математи
ческого модел
и
рования
», соглашение №

14.В37.21.0565;

и при финансовой поддержке:



гранта
П
резидента Российской Федерации МД

48.2009.4, договор
№02.120.11.48

МД по теме Биохимический и геномный анализ экспрессии

гена
pa

с целью получения L

фенилаланин

аммоний

лиазы в связи
с
созданием
продуктов питания для больных фенилкет
о
нурией»;



аналитической ведомственной целевой программы Развитие научного
потенциала высшей школы (2009

2011 года)
»
, задание №

2.1.2/3566 по теме
Разработка биотехнологии получения

специфических ферментов, продуц
и
руемых микроорганизмами»
;




Российского онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина (
г.
Москва
, договор №

154/1

от
23.03.2012 г
.
).

Цель и задачи
исследования.
Целью работы является развитие сущес
т
вующих и создание нов
ых био
технологий специализированных молочных пр
о
дуктов с использованием
L

фенилаланин

аммоний

лиазы.

Для
достижения
поставленной
цели

реш
ались

следующие зад
а
чи:



разработать технологию получения направленных гидролизатов
белков
м
о
лочной сыворотки
, предназна
ченных для производства

продуктов
питания
для бол
ь
ных ф
е
нилкетонурией;



сформировать

стратегию скрининга пигментных дрожжей, отлича
ю
щихся способностью к синтезу
L

фенилаланин

аммоний

лиазы
,

и изучить ф
е
нотипические особенности и биохи
мические свойства штамм
ов

пр
о
дуцентов

L

фенилаланин

аммоний

лиазы;



разработать технологию получения
L

фенилаланин

аммоний

лиазы
,

ос
у
ществить в
ыбор штамма
ее
суперпродуцента,
подобрать

компоненты и оптим
и

5
зировать
состав питательной среды для
его
культивирования
,
и
зучить влияние
параметров процесса периодич
е
ского культивирования
выбранного штамма
на
выход
L

фенилаланин

аммоний

лиазы и ее активность, разработать технологию
выдел
е
ния и очистки
полученного фермент
ного препарата
;



разработать технологию иммобилизации
L

фенилаланин

аммо
ний

лиазы
на наночастицы и исследовать основные физико

химические,
биохимические и
каталитические свойства нативной и иммобилиз
о
ванной
L

фенилаланин

аммоний

лиазы;



разработать технологию

лиофилизации
L

фенилаланин

аммоний

лиазы,
обеспечивающую максимальное

сохранение ее активности

в процессе хран
е
ния
;




использовать установленные закономерности для разработки технич
е
ских документов
на ферментный препарат и специализированные молочные
продукты на его основе, а также
внедрения результатов исследования в пр
о
мыш
ленности, в т.ч.

путем трансфер
а технологий.

Научная новизна.

Разработана технология получения целен
а
правленных
гидролизатов
белков
молочной

сыворотки, обеспечивающ
ая

максимальное уд
а
ление фенилаланина из пол
и
пептидной цепи.

Проведен молекулярно

функционал
ьный скрининг группы пигментных
дрожжей, из которых выделено

1
9

новых
прод
у
центов
L

фенилаланин

аммоний

лиазы

(
Aureobasiiu

puuans

Y
863,
Buera

aba

Y
1581,
Buera

pir
i
coa

Y
1577,
Cania

abrata

Y
2813,
C
.
atosa

Y
242,
Cryptococcus

aurentii

Y
227,
C
r
.
acerans

Y
2763,
Cystofiobasiiu

capitatu

Y
1852,
Debaryoyces

casteii

Y
968,
D
.
robertsiae

Y
3392,
Dioszeia

hunarica

Y
3208,
Dioszeia

sp
.

Y
3320,
Geotrichu

kebahnii

Y
3053,
Phaffia

rhoozya

Y
1668,
Rhoosporiiu

iobovatu

Y
1565,
Rh
.
infiroiniatu


Y
1569,
Rh
.
utinis

Y
77,
Rh
.
actosa

Y
2770,
Rh
.
rubra

Y
1193,
Saccharoyces

cerevisiae

Y
1127,
S
.
kuyveri

Y
2559,
Sp
o
robooyces

hosaticus

Y
991,
Tietiopsis

washintonensis

Y
1650,
Toruopsis

apic
o
a

Y
566,
Treea

foiacea

Y
1624,
Tr
.
esenterica

Y
1625).

Установлена корреляция между
генетической организацией штаммов
микроорганизмов и их
биосинтезом

L

фенилаланин

аммоний

лиазы
.

На основе методов случайных процессов, дисперсионного анализа и по
л
ного факторного эксперимента
исследованы
закономерности периодич
еского
глубинного
культивирования пигментных дрожжей и биосинтеза
PAL

с

использованием модели
Людекинга

Пайри
, выделен

высокоактивный

продуцент
PAL



штамм
Aureobasiiu puuans
,
для него
определен

комп
о
нентный состав субстрата, теоретически обоснован
ы и экспериментально
подтверждены

режимы ферме
н
тации
PAL
.


Разработаны методики
организации
биосинтеза, выделения и очистки,
иммобилизации на наноносителях и лиофилизации
PAL
, позволяющие не тол
ь
ко
получить фермент
,

превосходящ
ий

по

качеств
у

существующи
е

а
н
а
лог
и
, но и
гарантировать его сохранность
на прот
я
жении
более
восемь

мес
яцев
.

Исследованы состав, свойства и хранимоспособность новых видов
сп
е
циализированных молочных продуктов с использованием
PAL
, предназначе
н
ных для питания больных ф
е
нилкетонури
ей
.


6
П
р
актическая значимость.
На основе теоретических и экспериментал
ь
ных исследований сформулированы требования к технологическим процессам,
связанным с получением продуктов питания для больных фенилкетонурией: п
а
раметры и условия
гидролиза белков молочной сывор
отки, обеспечивающие ма
к
симальное удаление фенилаланина из полипептидной цепи
;

параметры и у
с
ловия
периодического культивирования
Aureobasiiu puuans

Y
863
;

биосинтеза, в
ы
деления и очистки, иммобилизации на наноносители, лиофилизации
PAL
, напра
в
ленного
гидролиза молочного сырья.

Техническая новизна разработанных техн
о
логических решений подтверждена
патентами РФ


2376893 Способ п
о
лучения
белкового эквивалента продукта, предназначенного для лечения больных фени
л
кетонурией»
;



2415943 Биологически активн
ый пептид, полученный из моло
ч
ного белка»
;



2425879 Способ получения поверхностно

модифицированных
наночастиц для иммобилизации биологических веществ»
;



2437935 Способ
производства мультиферментного препарата»
;



2460790 Способ иммобилиз
а
ции
L

фенилал
анин

аммоний

лиазы на магнитных наноч
а
стицах»
.

Разработаны и утверждены технические условия и технологическая инс
т
рукция на производство
L

фенилаланин

аммоний

лиазы (ТУ 9291

144

02068315

2011 и ТИ 9291

144

02068315

2011).

Разработана и аттестована методика

опр
е
деления коричной кислоты и ее солей методом капиллярного электрофореза в
алкогольных и газированных беза
лкогольных напитках,
не содержащих фенил
а
ланина
гидролизатах

молочных белков (свидетельство №

01.00225/205

21

11
).
Результаты моделирования реализо
ваны в
программе
для ЭВМ


Программа м
о
делирования периодического процесса культивирования пигментных дрожжей
»
(
свидетельс
т
во



2014611451
от

03.02.2014

г
.
).


Составлена

техническая документация на производство белковых проду
к
тов для больных фенилкетонурией

Ф
енилаланин

ф
ри
»

(ТУ
9745

145

020683815

2012

и ТИ 9745

145

020683815

2012
)
;
рецептуры питательных сред для культ
и
вирования пигментных дрожжей (№

01.01264/212

21

11
)
,

методики
выделения и
очистки
PAL

(№

01.00106/006

21

11
); иммобилизации
PAL

на наночастиц
ы о
к
сида железа (№

01.00107/007

21

11
); лиофилизации
PAL

(№

01.00108/008

21

11
);

идентификации ми
к
роорганизмов, обладающих
L

фенилаланин

аммоний

лиазной активностью (№

01.00114/104

21

12
)
.

Наработана
и протестирована
партия фермента
L

фенилаланин

аммоний

лиазы

и проведены
его
опытно

производственные испытания
in vivo
.
В

экспер
и
ментах
in vivo

у
с
тановлена антипролиферативная активность

L

фенилаланин

аммоний

лиазы
,
синтезированно
й

штамм
ом

Aureobasiiu
puuans

Y
863
, что
открывает перспективы ее использован
ия

как
противооп
у
холевого агента.

Результаты

исследований используются в учебном процессе
ФГБОУ ВПО К
е
меровский технологический институт пищевой промышленности»
при
подготовк
е

студентов

и магистрантов
, обучающихся по направле
ниям 240700 Биотехн
о
логия» и

141200 Холодильная, криогенная техника и системы жизнеобеспеч
е
ния», а также при
организации
научно

исследовательской и практической работы аспира
н
тов.

Степень достоверности и апробация результатов.

Основные
результаты работы
представлены
на симпозиумах, к
онгрессах, конференциях,

7
семинарах и
совещаниях различного уровня

за рубежом (
Армения,
Германия,
Канада, США)

и
в России (
Барнаул, Бийск, Волгоград, Звенигород,
Москва,
Новосибирск, Омск,
Санкт

Петербург,
Ставрополь, Тамбов и др.)
.


Результаты диссертацион
ной работы прошли апробацию на предприятиях
биотехнологической и пищевой промышленности
:

ООО 
Биотек
»,
ООО Инн
о
вационно

исследовательский центр»,
Институ
т

молекулярной биологии (ИМБ)
Национальной академии наук Республики Армения (НАН РА), ЗАО Хлад
о
техник
а»,
ФГБОУ ВПО

Национальный исследовательский Томский полите
х
нический университет»

и внедрены в производство
на CusterNanoTech LTD
(
Англи
я
)

путем трансфера т
ехнологий
в рамках
лице
н
зионн
ого

договор
а



4/13

от 20.12.2013 г.

Публикации.

Основные
материал
ы

д
иссертации опубликован
ы

в
более
чем
70

печатных работ
ах
, в том числе монографи
ях
,
стать
ях

в журналах, рекомендова
н
ных ВАК для публикации основных материалов диссертационных исследований:

Journa

of

Anaytica

Cheistry
»,

Biotechnooy

an

Appie

Bioche
istry
», 
Би
о
медицинская химия», 
Нанотехнологии и наноматериалы»,
Известия высших
учебных заведений
.

Серия

Химия и химическ
ая

технологи
я
»,
Биотехнология»,

Фундаментальные исследования
», 
Журнал аналитической химии
»,
Те
х
нология
живых систем», 
Известия

Самарского научного центра Российской академии н
а
ук», 
Вестник ВСГТУ»,

Техника и технология пищевых производств
», 
Д
остиж
е
ния науки и техники АПК
», Молочная промышленность», 
Хранение и перер
а
ботка сельхозсырья
»,
отчетах по НИОКР,
а также
патент
ах

РФ.

О
сновные положения, выносимые на защиту:

1.

Технология получения направленных гидролизатов
белков
молочной
сыв
о
ротки.


2.
С
тратеги
я

молекулярно

функционально
го

поиска
микроорганизмов


продуцентов
L

фенилаланин

аммоний

лиазы
;

последовательност
и

ген
ов
, отве
т
ственн
ых

за синтез
L

фенилаланин

аммоний

лиазы
;

фенотипически
е

особенн
о
ст
и

и биохимически
е

свойств
а
изучаемых

кул
ь
тур.


3
. Факторы
,

повышающие
PAL

активность

биотехнологически
х

проце
с
с
ов
.

4
.
Т
ехнологи
я

получения
L

фенилаланин

аммоний

лиазы
.

5
.
Параметры ис
пользования

L

фенилаланин

аммоний

лиазы в произво
д
стве
продуктов питания для больных фенилкетонурией.

Структура и объем работы
. Диссертация

состоит из

введения,

восьми

глав,
результатов и
выводов, списка использованных литературных источн
и
ков

(
524

наименов
а
ния
)

и

15
приложений. Основной текст изложен на
3
09

стран
и
цах, содержит
83

табли
ц
ы
,
98

рисунк
ов
.


СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ


Введение.

Обоснована актуальность,
сформулированы
научная новизна и
практическая значимость диссертационной работы
, положения
,

выносимые н
а
защиту
.

Глава 1.

Аналитический обзор.
Рассмотрены

особенности строения и
свойств
PAL
,
обобщены обнаруженные в литературе
аспекты
ее получения
,

пок
а

8
заны

направления использования
.

Сформулированы цель и задачи исследов
а
ния.

Глава 2.
Организация, объекты и
методы

п
роведения исследований
.

Теор
е
тические и экспериментальные исследования выполнены в соответствии с
поставленными задачами на кафедре Бионанотехнология» ФГБОУ ВПО К
е
меровский технологический институт пищевой промышленности». Общая сх
е
ма исследовани
й

представлена на рис
унке

1.
Исследования состояли из нескол
ь
ких логически взаимосвязанных бл
о
ков.

Экспериментальный блок исследований

состоял из нескольких взаим
о
связанных этапов: на первом


разрабатывали технологию получения напра
в
ленных гидролизатов
бе
лков
молочной сыворотки, предназначенных для прои
з
водства продуктов для больных фенилкетонурией (варьировали вид и дозу фе
р
ментного препарата, определяли продолжительность процесса, контролировали
степень гидролиза и массовую долю высвобожденного из полипе
птидной цепи
фенилаланина); на втором


разрабатывали

стратегию скрининга пигментных
дрожжей, отличающихся способностью к синтезу
PAL
.

Для этого
проводили
анализ последовательностей ДНК, кодирующих синтез
PAL
, синтезировали ун
и
версальные праймеры, комплеме
нтарные консервативным участкам гена
pa
,

проводили амплификацию фрагмента гена методом полимеразной цепной реа
к
ции, определяли нуклеотидную последовательность данного фрагмента методом
секвенирования по Сэнгеру,

редактировали нуклеотидные последовательнос
ти,
пров
одили их

множественное выравнивание и трансляцию в аминокислотные
последовательности, анализировали оптимальные модели аминокислотных з
а
мен.

Для
филогенетического анализа фрагмента гена
pa

исследуемых видов
бр
а
ли

дополнительные последовательности
данного гена аскомицетов и базидиом
и
цетов из базы данных
NCBI
. Филогенетические деревья строились как дистанц
и
онным методом, так и метод
ом

байесовской статистики. Изучали фенотипические
особенности и биохимические свойства

выбранных культур. Выделили штамм
ы,
обладающие наибольшей
PAL

активностью. В итоге разрабатывали

методику
идент
и
фикации этих микроорганизмов.

Для
реализации

технологии получения
PAL

осуществляли выбор штамма
суперпродуцента, подбор компонентов питательной среды и режимов (с аэрацией
и пе
ремешиванием) периодического культивирования для обеспечения
высокой
PAL

активности
выбранного штамма
.
Подбирали параметры очистки
PAL

с
целью сохранения ее высокой активности

в процессе хранения
.


Третий этап посвящен исследованию физико

химических свойст
в и выбор
у

оптимального носителя (наночастицы
Fe
3
O
4

и
Fe
2
O
3
) для иммобилизации
PAL
.
Подбирали параметры иммобилизации
PAL

на модифицированные и немодиф
и
цированные наночастицы
Fe
3
O
4
. Изучали влияние иммобилизации
PAL

на усл
о
вия (
pH

и температурный оптимумы)

сохранения свойств фермента: анализиров
а
ли физико

химически
е

свойств
а

иммобилизованного ферментного препарата
(удельная активность, операционная стабильность, стабильность при
хранении,
константа Михаэлиса


Ментен, максимальная скорость, изменение энталь
пии,
изменение энтропии, изменение свободной энергии Ги
б
бса).

Изучали теплофизические характеристики (температуропроводность, тепл
о
проводность, плотность, массовая теплоемкость)
PAL

до и после заморажив
а
ния.


9















































10
Исследовали влияние замораживания на активность фермента, определ
я
ли его криоскопические темпер
а
туры.

Моделировали процессы кристаллизации влаги при замораживании фе
р
ментного препарата. Исследовали кинетические особен
ности процесса
лиофил
ь
ной
сушки. О
безв
оживани
е

проводили как при постоянных значениях параме
т
ров на протяжении всего процесса, так и при переменных
в условиях

ступенч
а
той сушк
и
. На основ
ании

проведенных экспериментов
устанавливали

раци
о
нальные режимные параметры

лиофильной сушки фермента
: темп
ератур
у
, те
п
лов
ую

нагрузк
у

и остаточное давление
, которые легли в основу технологии его
лиоф
и
лизации.

П
рактический блок

исследований

связан с

реализацией возможности
п
о
лучен
ия

фермент
ного препарата

в производственных условиях.
Внедрение резул
ь
татов
в произ
водство
обеспечи
ва
ли
путем
разработк
и

технической документации и
трансфера технологий
.

При выполнении работы использовали общепринятые, стандартные и
оригинальные методы исследований.
Для п
оиск
а

гомологичных последовател
ь
ностей
использовали

программ
у
BLAST
2
, для

а
нализ
а

нуклеотидных и амин
о
кислотных последовательностей



G
enerunner
,
C
hroas
, для

м
ножественно
го

выравнивани
я

нуклеотидных последовательностей


C
usta

Oea
, для р
еда
к
тировани
я

и
выравнивания, а также трансляци
и

в аминокислотную последов
а
тельно
сть


BioEit 7.0.0
.
А
нали
з

оптимальной модели аминокислотных замен
осуществляли на
on

ine

сервер
е

ProtTest 3

согласно критерию Akaike (AIC)

(
в
качестве
аутгрупп
ы

использова
ли

последовательность гена
pa

Arabiopsis
thaiana
).

Построени
е

филогенетического

дерева дистанционным метод
ом

пр
о
водил
и

в пакете программ P
hyip

3.69
, д
ля п
остроени
я

деревьев байесовым м
е
тодом
использовали
программ
у

MrBayes 3.2,
для
в
изуализаци
и



TreeGraph 2
,
для построения л
ого

диаграммы


WebLoo.

Секвенирование проводил
и

на а
в
тома
тическом секвенаторе
ABI
3730
x

(
Appie

Biosystes
,
USA
) по методу
Сэнгера согласно протоколу производителя с использованием наборов для се
к
венирования
BiDye
®
Terinator

v
3.1
Cyce

Sequencin

Kit
.

О
лигонуклеотид
ы

получали
на синтезаторе
ABI
3900 (
Appie

B
iosystes
,
USA
).

Результаты эк
с
периментов обрабатывали методами

математической

статистики. Адекватность
уравнений регресси
й

экспериментальным данным проверяли критери
ем

Фиш
е
ра. Довер
и
тельную ошибку коэффициентов уравнения регрессии рассчитывали
по критерию

Сть
ю
дента.

Глава 3. Разработка технологии получения направленных гидролиз
а
тов
белков
молочн
ой сыворотки
.

В ходе исследований проводили
направленный
ги
д
ролиз белков подсырной сыворотки ферментами, обладающими специфичностью к
ароматическим аминокислотам, а

также определяли аллергенные фракции и их
эпитопы.
С целью

наиболее полного удаления фенилаланина из полипептидной ц
е
пи
использовали

энзиматическую систему, состоящую

из

алкалазы, карбок
с
ипе
п
тидазы А и лейци
о
наминопептидазы.

В ходе исследований варьировал
и следующие параметры:
фермент

субстратное соотношение



1:25

1:100
, продолжительность гидролиза



60

120
мин
, температура
45

55
°
С
,
рН среды



7,0
±0,1
, соотношение ферментов

алкал
а
за,

11
карбоксипептидаза А и лейцинаминопептидаза



1:1:1.

Результаты исследова
ний
предс
тавлены на рисунке 2 и таблице 1
.



Таблица
1



Характеристика гидрол
и
затов белков молочной сыворотки, %

Показатель

Глубина гидролиза,

при продолжительн
о
сти, мин

слабо, 30

умеренно, 60

глубоко, 90

Доля расщепленных белков в гидрол
и
зате:




α

лактальбумин

11,3±0,6

45,5±2,3

98,3±4,9

β

лактоглобулин

5,6±0,3

28,7±1,4

77,1±3,8

бычий сыворото
ч
ный альбумин

0

13,9±0,7

58,4±2,9

Массовая доля фракции

с молекулярной ма
с
сой <500 Да

6,8±0,3

12,4±0,6

6
3,4±4,7

Соотношение
α

аминного и общего азота

3,
5±0,2

8,8±0,4

60,2±3,0


Анализ данных показал, что с

увеличением глубины гидролиза (регул
и
руется продолжительностью процесса) возрастает доля расщепленных белков в
гидролизате молочной сыворотки, причем наиболее интенсивно происходит
ферментолиз
α

лакталь
бумина: после 30 мин гидролиза доля расщепленного
белка составляет 11,3%, после 90 мин гидролиза расщепляется 98,3% низком
о
лекулярной фракции белков молочной сыворотки. Менее подвержен гидр
о
лизу
при выбранных параметрах бычий сывороточный альбумин: 30 мин
гидролиза
протекают без расщепления его молекулы, по истечении 90 мин

фе
р
ментолиза
гидролизуется 58,4% высокомолекулярной фракции белков молочной сыворо
т
ки. Что касается
β

лактоглобулина, доля расщепленного бе
л
ка увеличивается с
5,6% при 30 мин

гидролиза д
о 77,1% при 90 мин ферментати
в
ного процесса.

Кроме того
,

в процессе гидролиза
белков
молочной сыворотки

происходит
увеличение

массовой доли низкомолекулярной фракции (молекулярная масса м
е
нее 500 Да): после 90
мин

гидролиза
она

составляет 93,4%. Степень
гидролиза
в
90

мин
утном

ги
д
ролизате молочной сыворотки равна 60,2%.

Установили, что рациональными параметрами направленного ферментати
в
ного гидролиза белков молочной сыворотки комплексом эндо


и экзопептидаз я
в
ляю
тся
:

температура 50±1°С, продолжительность
90
±1

мин, соотношение фе
р
мент

субстрат 1:25.

В таблице
2

представлен

аминокислотный
состав,
гидролизата,
полученного

при выбранном режиме организации гидролиза.

При такой организации процесса
Рисунок
2



Электрофореграмма
ферментативного гидролизата

белков молочной сыворотки при
разной продолжительности гидр
о
лиза: 1



30 мин, 2


60 мин,

3


90 мин. М


маркер
Roti

Mark

Stanar
, 5

98 кДа (
Car

Roth
, Ге
р
мания)



12
удается достичь высокой концентрации свободных аминокислот, сре
ди которых
фенилаланин, валин, изолейцин, лейцин, метионин, аспарагиновая кислота, глут
а
миновая кислота
, тирозин, триптофан,

что
позволяет рекомендовать эти гидрол
и
заты (отвечающие
требуемым
органолептическим
параметр
а
м
, основные физ
и
ко

химические показате
ли приведены в таблице

3
)

для производства продуктов
специализированного
пит
а
ния
, в т.ч.

для больных фенилкетонурией.



Таблица
2



Содержание свободных аминокислот в гидролизате

молочной сыворотки
, г/100 г пр
о
дукта

Аминокислота

М
олочная сыворотка

Г
идроли
зат

Аргинин

0,02
±0,001



Валин

0,04
±0,00
2

0,035±0,002

Гистидин

0,02
±0,001

0,011
±0,001

Изолейцин

0,04
±0,00
2

0,038±0,002

Лейцин

0,07
±0,00
2

0,068±0,003

Лизин

0,07
±0,001

0,032±0,002

Метионин

0,01
±0,001

0,009
±0,004

Треонин

0,04
±0,001

0,027±0,001

Трипто
фан

0,02
±0,00
2

0,0
1
9±0,004

Фенилаланин

0,03
±0,001

0,03
0
±0,002

Аспарагиновая кислота

0,07
±0,001

0,064±0,003

Аланин

0,03
±0,00
2

0,020±0,001

Глицин

0,01
±0,001

0,005±0,00
1

Глутаминовая кислота

0,14
±0,00
2

0,100±0,005

Пролин

0,05
±0,001

0,004±0,00
2

Серин

0
,04
±0,002

0,030±0,001

Тирозин

0,02
±0,001

0,019±0,003

Цистеин

0,01
±0,002



Итого:

0,73
±0,026

0,483
2
±0,0
34


Анализ остаточной антигенности гидролизата показал ее снижение в
96000 раз по сравнению с нерасщепленными белками молочной сыв
о
ротки
, что
явл
я
ется

дополнительным и весьма существенным достоинством.


Таблица
3



Физико

химические показатели гидролизат
а

молочной с
ы
воротки

Показатели

Значение показателя

Плотность, кг/дм
3

1,020±0,01

Массовая доля влаги, %

93,2±0,9
0

жира, %

0,54±0,03

белка, %

0,78±0,
04

золы, %

1,56±0,08

к
альция
, %

0,050±0,0
1

Активная кислотность, рН

7,15±0,36

Массовая доля антигенов молочной сыворотки в белковом

комп
о
ненте продукта

1,0·10

5

Кратность снижения антигенности в сравнении с нерасщепленным
белком молочный сыворо
т
ки, р
аз

96000

Перевариваемость белков
in vitro
, %

85,5±4,3
0


13
Глава 4.
Скрининг пигментных дрожжей, идентификация культур,
продуцирующих
L

фенилаланин

аммоний

лиазу
,

и их физиолого

биохимическая характеристика
.
П
роводили сравнительный анализ
26

нукле
о
тидных пос
ледовательностей гена
pa
, содержащихся в базе данных

генетич
е
ских
последовательностей
GenBank
.

Р
езультаты представлены
на рисунке
3

в виде м
о
лекулярно

филогенетического дерева
,
анализ

которого

показал достаточно выс
о
кое сходство последовательностей

гена
p
a
.
Для каждого кластера множественное
в
ы
равнивание отобранных нуклеотидных последовательностей проводили по
гену
pa

базидиомицетных дрожжей
Rhoosporiiu

toruoies

и
Rhootorua

utinis
,
которые обладают наибольшим родством со штаммами пи
г
ментных дрож
жей.


Рисунок
3


Дендрограмма

нуклеотидных последовательностей гена
pa


Выбранные универсальные праймеры (фланкируют фрагмент гена
pa
, ра
с
положенный с 292 по 1319 нуклеотид, размер полученного фрагмента


1027 п.н.)
представлены в та
б
лице

4
.


Таблица
4



Последовательности универсальных праймеров

Название

Нуклеотидная последовательность праймера

Занимаемая поз
и
ция

PAL2
F

5'


СCGAYAACCCYCTSATMGA


3'

292

308

PAL1R

5'

CAT

YTC

TGC

CGG

YTG

AAC

RTG


3'

1299

1319


14
Для сконструированных пар праймеров рассчит
аны температура отжига и
параметры
амплификации. Установлены условия проведения ПЦР

реакции:
95
±1
º
С, 60 с, 30 циклов (95
±1
º
С, 30 с; 64
±1
º
С, 30 с; 72
±1
º
С, 60 с).

Полученные

результаты легли в основу
ПЦР

тест система для

идентификации гена
pa


пи
г
ментных д
рожжей.

Прямое секве
н
ирование подтвердило, что полученные амплификаты явл
я
ются фрагментами гена
pa
.
Установлено, что только штаммы

Aureobasiiu
puuans

Y863,
Buera
aba

Y1581,
Buera
piricoa

Y1577,
Cania
abrata

Y
2813,
C.
atosa

Y
242,
Cryptococ
cus

aurentii

Y227,
Cr
.
acerans

Y
2763,
Cyst
o
fiobasiiu

capitatu

Y
1852,
Debaryoyces

casteii

Y
968,
D
.
robertsiae

Y
3392,
Dioszeia

hunarica

Y
3208,
Dioszeia

sp
.

Y
3320,
Geotrichu

kebahnii

Y
3053,
Phaffia

rhoozya

Y
1668,
Rhoosporiiu

iobovatu

Y
156
5,
Rh
.
infiroini
a
tu

Y
1569,
Rh
.
utinis

Y
77,
Rh
.
actosa

Y
2770,
Rh
.
rubra

Y
1193,
Saccharoyces

cerevisiae

Y
1127,
S
.
kuyveri

Y
2559,
Sporobooyces

hosaticus

Y
991,
Tietiopsis

washintonensis

Y
1650,
Toruopsis

apicoa

Y
566,
Treea

foiacea

Y
1624,
Tr
.


e
senterica

Y
1625

содержат в своем составе ген
pa

и, соответственно, будут и
с
пользоваться в дальнейших исследован
и
ях.

Составили матрицу идентичности нуклеотидных и аминокислотных посл
е
довательностей (таблица
х

5

и
6
)
.

С
тепень идентичности как нуклеотидны
х, так и
аминокислотных последовательностей очень высока и составляет порядка 93

97%
для некоторых видов.

Исследование фенотипических особенностей и биохимических свойств

в
ы
бранных культур

проводили по совокупности микро


и макроморфологических
свойств. У
становлено, что клетки

выделенных дрожжей имеют круглую, овал
ь
ную
и цилиндрическую форму.
Размеры взрослых» дрожжевых клеток варьи
р
у
ются у
разных видов от 1,
0

до
8,0

мкм по ширине и достигают
17,0

мкм в длину у продо
л
говатых клеток
,

п
ри этом консистенция
у всех клеток пастообразная (та
б
лица 7).

Далее
определяли
PAL

активность выбранных штаммов пигментных
дрожжей. В результате

установлено, что

наибольшей активностью обладают
штаммы
Aureobasiiu

puuans

Y
863,
Rhoosporiiu

infiroiniatu

Y
1569,
Cania

abrata

Y
2813,
C
.
atose

Y
242,
Debaryoyces

robertsiae

Y
3392,
Rh
o
osporiiu

iobovatu

Y
1565,
Rh
.
actose

Y
2770,
Saccharoyces

cerevisiae

Y
1127,
Tietiopsis

washintonensis

Y
1650,
Toruopsis

apicoa

Y
566,
Treea

f
o
iacea

Y
1624,
Rhootorua

rubra

Y
11
93,
Debaryoyces

casteii

Y
968,
что позв
о
ляет рекомендовать их для дальнейших исследований
с целью разработки те
х
нологии
получение
ферментного препар
а
та
PAL
.

Моделирование
периодического

процесса культивирования
пигментных
дрожжей
проводили с целью

выделения
наиболее активного
штамма

пр
одуцента
PAL
.
Пусть
)
(
t
X



средняя концентрация биомассы мг/
см
3

в м
о
мент времени
t
,
)
,
0



t

и
)
(
t
D



соответствующая дисперсия. Из модели, опр
е
деляющей пр
о
цесс рождения и гибели с постоянной средней скорос
тью роста и
средней скоростью гибели популяции
,

пропорциональной численности попул
я
ции, получили систему ура
в
нений:



15
Таблица 5



Идентичность нуклеотидных последовательностей фрагмента гена
pa


некоторых видов, %




Таблица 6



Идентичность нуклеотидны
х последовательностей фрагмента

гена
pa

некоторых видов, %




Таблица 7


Фенотипические свойства колоний пигментных дрожжей


Название ш
тамм
а

Размер,
мкм

Форма

Характер

ко
н
кура края

Рельеф

Повер
х
ность

Цвет

Cania abrata

Y2813

2,5

6,0

овальная

неро
вные края

гладкий

матовая

кремовый

Aureobasiiu puuans
Y863

8,0

6

элипсовидная

неровные края

складчатый

матовая

кремовый

Treea foiacea

Y1624

2
,0

6,5

круглая

неровные края

гладкий

блест
я
щая

кремовый

Phaffia rhoozya

Y1668

3,8

10,0

от круглой

д
о овал
ь
ной

неровные края

гладкий

матовая

красно

оранжевый

Rhootorua actose

Y2770

2,5

8,0

от овальной

до вытян
у
той

неровные края

гладкий

блест
я
щая

красно

розовый

Rhoosporiiu iobovatu
Y1565

1,0

9,0

от круглой до овал
ь
ной

неровные края

складчатый

м
атовая

красно

розовый

Rhootorua rubra

Y1193

2,3

6,5

от овальной

до вытян
у
той

ровные края

гладкий

блест
я
щая

красно

розовый

Treea esenterica

Y1625

2
,0

8,5

от круглой до овал
ь
ной

неровные края

гладкий

блест
я
щая

кремовый

Debaroyces casteii

Y

968

3
,8

8,5

от круглой до овал
ь
ной

неровные края

складчатый

матовая

белый

Cania atose

Y242

2,0

7,0

от круглой

до цилиндрич
е
ской

ровные края

гладкий

блест
я
щая

кремовый

Rhoosporiiu capitatu
Y1567

1,0

14,0

от круглой

до цилиндрич
е
ской

ровные края

гладк
ий

матовая

розово

оранжевый

Saccharoyces kuyveri

Y2559

5,0

12,0

от круглой

до цилиндрич
е
ской

ровные края

гладкий

блест
я
щая

кремов
а
тый

Buera aba

Y

1581

2
,0

6,5

овальная

неровные края

гладкий

матовая

кремовый

Rhootorua utinis

Y77

2,3

10,0

от кр
углой до овал
ь
ной

ровные края

гладкий

матовая

красно

розовый

Rhoosporiiu

infiroiniatu

Y1569

1,0

10,0

от круглой до овал
ь
ной

ровные края

гладк
ий

матовая

красно

розовый

Debaryoyces

robertsiae

Y3392

2,8

8,0

от круглой до овал
ь
ной

неровные края

складч
атый

матовая

белый

Saccharoyces

cerevisiae

Y1127

5,0

12

от круглой

до цилиндрич
е
ской

ровные края

гладк
ий

блест
я
щая

кремов
а
тый

Tietiopsis washintonensis

Y1650

1,0

17,0

круглой

до цилиндр
и
ческой

неровные края

складчатая

матовая

кремовый

Toruopsis a
picoa

Y566

2,0

6,0

от круглой до овал
ь
ной

ровные края

гладк
ий

блест
я
щая

желтовато

кремовый


Примечание. Консистенция всех штаммов пастообразная
.


)
(
)
(
t
X
t
t
X
X
X




,
0
0
)
(
X
t
X

;

(1)





)
(
2
)
(
)
(
)
(
2
)
(
)
(
)
(
2
2
t
X
t
X
t
X
t
D
t
X
t
X
t
D
t

X
X









,
0
0
)
(
D
t
D



(2)


где
X


и
X




интенсивность рождения и гибели популяции в единицу врем
е
ни;
0
t



момент времени, в который начинается фаза активного (экспоненц
и
ального) роста биомассы.

Если
)
(
t
P



концентрация целевого продукта из модели Людекинга


Па
й
ри,
то
,

учитывая уравнение (2), для количества синтезируемого продукта им
е
ем:

P
P
t
t
X
t
t
P




)
(
)
(
,
0
0
)
(
P
t
P

, (3)

где
P




средний выход продукта, отнесенный к образовавшейся биомассе,
мг/г;
P




коэффициент, определяющий долю продукта, выделяемого поги
б
шими членами популяции, мг/(
см
3

ч).

Таким образом, модель представляется системой трех диф
ференциальных
уравнений, решение которых имеет сл
е
дующий вид:

)
(
0
0
)
(
t
t
X
X
X
X
X
e
X
t
X



















;

















t
X
X
t
X
X
e
X
e
t
D




0
)
1
(
)
(
; (4)

0
0
0
)
(
)
)
(
(
)
(
P
t
t
X
t
X
t
P
P
P







.

Пусть
0
t
,
1
t



моменты времени, с которых начинает
ся

и заканчивается ф
а
з
а
экспоненциального роста периодического процесса культивирования,

t
2



момент
времени, начиная с которого гибель начинает преобладать над рождением членов
популяции. По разработанной методике на интервале от
0
t

до
1
t

(рассматривая
процесс чистого рождения) определяли среднюю скорость ро
ж
дения
X

, от
1
t

до
2
t



среднюю скорость
гибели
X


членов популяции в единицу вр
е
мени.

Можно считать,
что
63
,
0

P


мг/г, усредненное значение параме
т
ра


1
,
0

P


мг/(
см
3

ч) (если считать

параметр
P


незначимым, т.е. равным 0, то
ошибка расчета для образцов рассматриваемых штаммов составляла от 5 до
12%). Пол
ученные результаты для рассмотренных штаммов пигментных дро
ж
жей приведены в таблиц
е

8

и на
рисунке
4
.

По количеству вырабатываемого
белка можно выделить штаммы
Y
1565,
Y
2770 и
Y
1650.


Таблица
8



П
араметр
ы

моделирования периодического процесса


культивиров
а
ния пигментных дрожжей

Штамм

0
t

X


1
t

X


2
t

P


P


Tietiopsis washintonensis
Y
1650

0,5

2,599

2,0

0,183

6,0

0,63

0
,08

Rhootorua actose
Y
2770

0,5

2,103

2,0

0,188

6,0

0,63

0,21

Rhoosporiiu iobovatu

Y
1565

4,5

1,090

10,0

0,053

16,0

0,63

0,16

Aureobasiiu puuans
Y
86
3

2,0

1,655

3,0

0,154

6,0

0,63

0,14

Treea foiacea
Y
1
624

7,0

2,065

9,0

0,211

15,0

0,63

0,0
2

Cania
abrata

Y
2
813

6,0

1,130

10,0

0,121

15,0

0,63

0,04



18














































19














































20
















































21































































22














































23
Получены следующие уравнения регрессии
:








WT
,
WV
,
T
,
V
,
W
,
,
Z
0005
0
0000
0
0953
0
0028
0
0003
0
05727
0
1

WVT
,
VT
,
0000
0
00405
0


,








WT
,
WV
,
T
,
V
,
W
,
Z
0017
0
0006
0
8090
0
0605
0
0061
0
6889
,
2
2

WVT
,
VT
,
0002
0
0171
0


.

По критерию Стьюдента в этих уравн
ениях незначимыми оказались по
четыре

коэффициента. Коэффициенты критерия Фишера меньше теоретич
е
ских
, поэтому
уравнения
с вероятностью 0,95
не противоречат описанию связи
выделенных факторов
.

Н
а качество и количеств
о вырабатываемого фермента
наибольшее влияние оказывают скорость перемешивания
W

среды культивир
о
вания и продолжительность культивирования
T



как самостоятельно, так и в
совокупности. Увеличение продолжительности процесса биосинтеза и скорости
перемешиван
ия среды культивирования позволяет увеличить и качество, и к
о
личество вырабатываемого белка, в то время как характер влияния количества
вводимого воздуха как самостоятельно, так и в совокупности с другими факт
о
рами не однозначен (рис
унок

1
1
). Культивирован
ие с перемешиванием и аэр
а
цией на протяжении 5 ч приводит к значительному увеличению активности и
количества синтезируемого белка (по активности до 29%, по количеству до
40%). Увеличение продолжительности процесса до 6 ч привело к увеличению
количества бе
л
ка до 23%, но уменьшило его активность.

0,5
0,75
1
1,25
1,5
1,75
0
1
2
3
4
5
6
1
2
3

0,8
1,1
1,4
1,7
2
2,3
0
1
2
3
4
5
6
1
2
3


Рисунок 1
1



Влияние режима организации процесса культивирования на а
к
тивность (а), концентрацию белка (б): 1


0

W

об/мин,
0

V

дм
3
/мин; 2


100

W

об/мин,
10

V

дм
3
/мин; 3


300

W

об/мин,
15

V

дм
3
/мин


При организации процесса биосинтеза
PAL

придерживались
следующей
технологической схемы: культивир
ование продуцента в ферментёре объёмом 5
дм
3

при

температуре 26
±1
°С, рН 7,0, в течение 5 ч с
интенсивным перемешив
а
нием (100 об/мин) и принудительной подачей воздуха (10
дм
3
/мин
).

Для разработки
технологи
и

выделения и очистки
L

фенилаланин

аммоний

лиазы
и
зучали влияние высоких концентраций солей

(NaC, KC и
(NH
4
)
2
SO
4
) на активность очищенного препарата
PAL
.
У
становили, что
в иссл
е
дуемых условиях
активность значительно ингибировалась

на 26

48% и 26

44%,
соответственно для солей

NaC и
K
C
, присутствия кото
рых

желательно избегать в
реакцио
н
ной смеси.

а)

б)

Акти
в
ность, Е/см
3

Продолжительность, ч

Продолжительность, ч

Концентрация , мг/см
3


24
Далее
исследова
ли влияние

параметров очистки
PAL

на ее
удельн
ую

а
к
тивност
ь
.
С
хема очистки представлена в таблице

1
1
, при которой
удельная а
к
тивность
фермента
увеличивается в 10,7 раз и составляет 3,0
E
/мг белка
.


Таблица
1
1



Схема

очистки
PAL

Стадия оч
и
стки

Удельная
акти
в
ность,
Е/мг

Акти
в
ность,
Е/
см
3

Б
е
лок,
мг/см
3

Об
ъ
ем,
см
3

Сумм
.

а
кти
в
ность, Е

Сумм
.


белок,
мг

В
ы
ход,
%

Экстракт

0,28

4,20

15,00

95

399,00

1425,00

100

I дробное осажд
е
ние
сульфатом а
м
мония

0,92

18,40

20,00

20

368,00

400,00

99

II осаждение

сульфатом амм
о
ния

2,02

10,91

5,40

18

196,34

97,20

67

Гидрофобная

хром
а
тография

3,00

9,00

3,00

22

198,00

66,00

67


Глава 6.

Оптимизация параметров иммобилизации

L

фенилаланин

аммоний

лиазы на наночастицы
.

Сравнение
химического
состава и физических свойств частиц оксида железа
Fe
2
O
3

и
Fe
3
O
4

приведено в
таблиц
е
1
2
.

Носителем
для иммобилизации фермент
а

выбран
ы

наночастицы
Fe
3
O
4
, удельн
ая

поверхност
ь

которых (35,7
м
2
/г)

в 10 раз превышает удельную п
о
вер
х
ность

наночастиц
Fe
2
O
3

(
3,155
м
2
/г).


Таблица
1
2



Свойства наночастиц
Fe
2
O
3

и
Fe
3
O
4

Оксид

железа

Д
иаметр

частиц, нм

У
дельн
ая


поверхност
ь
, м
2


Массовая доля

примесей, %

A

Si

С

Fe
2
O
3

53,7±0,4

3,155 ± 0,110

0,62±0,01

1,67±0,03

1,10±0,02

Fe
3
O
4

75,3±9,3

35,7
00
±1,1
00

0,75
±0,02

3,0
0
±0,05

0,04±0,01


Изучали влияние
способа иммобилизации
L

фенилаланин

аммоний

лиазы на частицы
Fe
3
O
4

(
метод тиофенового ацетилир
о
вания, карбодиимидный
и адсорбционный методы
) на

PAL

(рис
унок

1
2
).













Рисунок 1
2



Зависимость

PAL


активности
Aureobasiiu puuans
Y863

от те
м
пературы при различных
способах

иммобилизации:

1


нативный фе
р
мент.

Способ иммобилизации:

2


тиофенового ацетил
и
рования,

3


карбодиимидный,

4


адсорбционный

Удельная ак
ти
в
ность, Е/см
3

Температура, °С


25
Установлено, что

нативный и иммобилизованный фермент имеют ра
з
личные оптимальные температуры действия (рисунок 1
2
). Оптимум температ
у
ры смещен на 3±1
º
С в случае иммобилизации
L

фенилаланин

аммоний

лиазы
на немодифицированные наночастицы и на 5±1
º
С для фермента, иммобилиз
о
ванного на наночастицы
Fe
3
O
4
, функционализированные тиофеновыми групп
а
ми или карбодиимидом
,

по сравнению с нативным ферментом. Кроме того, для
фермента, иммобилизованного на наночастицы
Fe
3
O
4
,

модифицированные ти
о
феновыми группами, при температуре выше 75±

С сохраняется приблизител
ь
но 75% удельной активности, в то время как нативная
PAL

практически полн
о
стью инактив
и
руется.

В
ыяснили, что
PAL

активна в пределах значений рН от 6,0 до 8,0

(рис
у
нок 1
3
),

значение рН для проявления активности нативной и иммобил
изова
н
ной
PAL

одинаково и лежит

в пределах от 6,5 до 7,5.





Из
таблицы 1
3

следует, что максимальная активность
PAL

(94% от н
а
тивного препарата) сохраняется после иммобилизации фермента, на наночаст
и
цах
Fe
3
O
4

методом тиофенового ацет
илирования. Установлено, что иммобил
и
зованный фермент после пятикратного использования в реакции с образован
и
ем транс

коричной кислоты сохраняет 85%, 69% и 27% активности
PAL
, имм
о
билизованной методом тиофенового ацетилирования, карбодиимидным и а
д
сорбционным методами
,

соответственно, что является дополнительным свид
е
тельством эффективности ковалентного
взаимодействия
PAL

с наночастицами
оксида железа.


Таблица 1
3



Характеристики
L

фенилаланин

аммоний

лиазы
, иммобилизова
н
ной на наночастицах
Fe
3
O
4

с

использованием физического и химических спос
о
бов

Наночастицы
Fe
3
O
4

Содержание белка в
и
м
мобилизованном
препарате, мкг/мг
частиц

Удельная а
к
тивность пр
е
парата,
Е
/мг

Активность иммоб
и
лизованного преп
а
рата, % от нативного

Нефункционализирова
н
ные

15,
0
0
±0,75

1,62
±0,08

54,
0
0
±3,12

Ф
ункционализир
о
ванные

тиофеновыми группами

55,
0
0
±3,34

2,82
±0,15

94,
0
0
±5,56

Ф
ункционализированные

карбодиим
и
дом

27,
0
0
±1,62

2,28
±0,14

76,
0
0
±4,56

рН

Удельная акти
в
ность, Е/см
3

Рисунок 1
3



Зависимость
PAL




активности
Aureobasiiu puuans

от
значений рН буфера (инкубация 4 ч), при
различных способах иммобилиз
а
ции:

1


нативный фермент.

Способ иммобилизации
:

2


тиофенового ацетилир
о
вания,

3


карбодиимидный,

4


адсорбционный


26
Результаты изучения кинетических характеристик процесса, катализ
и
руемого иммобилизован
ной
PAL

(таблица
1
4
), свидетельствуют о том, что при
иммобилизации фермента величина максимальной скорости (
V
ax
)
возрастает
, а
значение константы Михаэлиса

Ментен (
K
M
) уменьшается.
При этом,
чем в
ы
ше сродство
PAL

и наноразмерного носителя, тем
больше
знач
ение
V
ax

и
меньше

знач
е
ние
K
M
.

Таблица 1
4



Кинетические параметры нативной и иммобилизованной

PAL

Способ иммобилизации фермента

V
ax
,
моль
/

(мин·
см
3
)

K
M
, м
моль

Нативная
L

фенилаланин

аммоний

лиаза

3,974±0,056

0,485±0,021

Методом тиофенового ацет
и
лиров
ания

4,335±0,061

0,412±0,016

Карбодиимидным м
е
тодом

4,123±0,058

0,430±0,017

Адсорбционным мет
о
дом

4,098±0,057

0,456±0,018


Т
ермодинамические характеристики сорбции
PAL

на поверхности
изучали
расчетом

предельной сорбции на магнитном носителе (для темпер
атур 5, 24 и 45°С)
из уравнения Ленгмюра в прямолинейной форме. По полученным константам сор
б
ции вычислили
величины изменения энтальпии (
Δ
Н) и изобарно

изотермического
потенциала (
Δ
G
) сорбционного процесса
.

Р
езультаты
представлены
в таблице
1
5
.


Таблица
1
5



Основные термодинамические характеристики иммобил
и
зации

PAL

на наночастицы
Fe
3
O
4

Способ

иммобилизации

Нефункционализ
и
рованные наноч
а
стицы
Fe
3
O
4

Наночастицы
Fe
3
O
4
, функционализирова
н
ные

ка
р
бодиимидом

тиофеновыми

гру
п
пами

Температура, °С

5

5

5

24

24

24

45

45

45

Величина

сорбции
,

мг/г частиц

31,2

123,8

224,5

12,3

76,5

167,9

2,6

44,0

119,8

Константа сорбции,
10

3

530,12

786,56

956,4

327,81

504,7

665,7

210,73

423,7

325,8

Δ
H
, кДж/моль

23,91

55,4

70,9

Δ
G
, кДж/моль

53,84

22,8


35,4

17,0
8

17,7


45,3

13,68

11,0


73,5

Δ
S
, Дж/моль·К

62,28

86,5

112,4

33,61

53,4

69,7

31,84

48,1

34,3


Динамика

активности нативной и иммобилизованной
PAL

в процессе
хранения отражен
а

в таблице 1
6
. Полученные данные свидетельствует о том,
что иммобилизованн
ая
PAL

в течение длительного времени сохраняет более
высокую активность, чем нативная. За 8 мес хранения при 4°С или 6°С в 0,15
моль

трис

HCI

буфере (рН 8,8) нативная
PAL

теряет 50% своей активности, т
о

27
гда как иммобилизованная химическими способами сохраня
ет практически
первоначальный уровень активности фермента
(
не м
е
нее 69%).


Таблица 1
6




А
ктивност
ь

нативной и иммобилизованной
PAL

в процессе
хранения (Е/мг бе
л
ка)

Способ иммобилизации

Продолжительность хранения,
мес

0

3

4

6

8

Нативный фермент

3,00±0,1
2

2,77±0,11

2,13±0,08

1,88±0,07

1,45±0,06

Адсорбционный

1,62±0,07

1,44±0,06

1,35±0,05

1,23±0,05

1,12±0,05

Т
иофенового

ац
е
тилирования

2,82±0,11

2,78±0,11

2,76±0,11

2,74±0,11

2,71±0,11

Карбодиимидный

2,28±0,09

2,16±0,09

2,08±0,08

1,99±0,08

1,94±0,08


Лучшие качества показала
PAL
, иммобилизованн
ая

на наночастицы

окс
и
да железа метод
ом

тиофенового ацетилирования.


Глава
7
.
Разработка технологии

лиофилизации

PAL
.

Для

определ
е
ния
рационального режима
лиофилизации

PAL

изучали ее
теплофизические
свойства.
Р
езультаты представлены в табл
ице

1
7
.

Т
еплофизические характер
и
стики
PAL

в значительной степени определяются содержанием и состоянием в
ней влаги. Теплопроводность фермента при замораживании

возрастает прибл
и
зительно в
4

раза и составляет
2,18 Вт/(м

К)
. При

обезвоживании теплопрово
д
ность сухого
препарата увеличивается приблизительно в
6

раз и с
о
ставляет 3,36
Вт/(м

К).
Теплоемкость при замораживании уменьшается приблизительно в
2

раза и составляет 1979 Дж/(кг

К), при обезвоживании уменьшается незначител
ь
но.
Т
емпературопроводность при замораживании препарата возрастает в
9

раз, а
при обезвоживании

увеличивается только на 20% и составляет
11,97 и 14,94 м
2

,

соответстве
н
но.


Таблица
1
7



Теплофизические характеристики
PAL

до и после замор
а
живания

Состояние

Темпе
р
а
туропр
о
водность,
м
2
/с (±5%)

Теплопр
о
водность,
Вт/(м

К)
(±5%)

Пло
т
ность,
кг/м
3

(±2%)

Массовая
теплое
м
кость,
Дж/(кг

К)

(±5%)

Ж
идкий препарат (
t



18
±
1


C
)

1,37

0,56

1013

4166

З
амороженный препарат (
t




24
±
1


C)

11,97

2,18

920

1979

С
ухой препарат (
t



2
0
±
1


C)

14,94

3,36

1192

1888


Изучали влияние
замораживания
на сохранение
акти
в
ность
PAL

(таблица
18
).

Установили, что при однократном цикле замораживания


размораживания
потери активн
о
сти фермента составили 12 %.

Изуч
ено

влияние растворителей (
трис

HC
, трегалоза 0,5%, поливили
л
пирролидон 0,5%) в процессе замораживания на активность
PAL

(таблица
19
).



28
Таблица
18



Влияние замораживания на активность
PAL

Состояние

Удельная акти
в
ность, Е/мг

Потери активн
о
сти, %

До замораживания

3,00
±0,15

0

После размор
ажив
а
ния

2,64
±0,12

12
±0,6


Наилучшим стабилизатором активности
PAL

при лиофилизации является
0,5%

ны
й

раствор
D

трегалозы, который не приводит к потер
е

активности ферме
н
та.


Таблица
19



Влияние растворителей на активность
PAL

в процессе

зам
о
раживания

О
бразец

Удельная активность,
Е/мг белка

Потер
я

активн
о
сти, %

До сушки (контроль)

2,99
±0,15

0

Т
рис

HC

2,58
±
0,12

13,8
0
±
0,11

Трегалоза 0,5%

3,00
±
0,16

0

Поливилилпирролидон 0,5%

2,83
±
0,15

5,3
0
±
0,26


И
сследовали зависимость криоскопической температуры ферм
ента от
концентрации белка в препарате

(
рисунок 1
4
).

При изменении концентрации
белка в препарате от 3,5 до 7,5 мг/см
3

его криоскопическая температура изм
е
няется на 0,3

0,6°С; от 7,5 до 11,5 мг/см
3



0,6

1,3°С.

1
2
3
2
1
3,5
5
6,5
8
9,5
11



Исследовано

влияни
е

уровня стабилиз
ации температуры высохшего слоя на
продолжительность лиофилизации
. Установлено
, что с повышением уровня ст
а
билизации температуры высохшего слоя увеличивается количество влаги, уд
а
ленной в период
лиофилизации
, и уменьшается количество влаги, удаленной в п
е
р
иод прогрева

(рисунок 1
5
)
. Температура, равная 20

40°С, является
рекоменд
о
ванной
для
организации
процесса сушки
PAL
, поскольку интенсифицируется уд
а
ление влаги ферментного препарата и сокращается продолжительность су
ш
ки.

Продолжительность лиофильной сушки
PAL

осуществляли при разли
ч
ных значениях температуры
сушки: 20
±1
º
С
, 30
±1
º
С

и 40
±1
º
С (рис
у
нок 1
6
).

Выбрана продолжительность лиофильной сушки фермента 6 ч

при температуре
20
±1
º
С, поскольку
повышение температуры сушки фермента от 20
±1

до 40
±1
º
С
приводит к ув
еличению ее продолж
и
тельности более чем на 10 ч.


Концентрация белка, мг/см
3

Криоскопическая

температ
у
ра,
о
С

Рисунок 1
4



Зависимость
криоскопическо
й

температ
у
ры
PAL

от концентрации
белка:

1


расчетное знач
е
ние
;

2


эк
с
перимент



29



Рисунок 1
5



Зависимость

темп
е
ратуры

высохшего слоя

PAL

от

температ
у
ры сушки
:

1


40
±1
°С;

2


30
±1
°С;

3


20
±1
°С







Таким образом, о
пределены оптимальные параметры процесса лиофилиз
а
ции

ферментного препарата
L

фенилаланин

аммоний

лиазы: продолжительность пр
о
цесса


6 ч; плотность теплового потока


9,2 кВт/м
²;
остаточное давление



250
±
10
Па.

Установили, что наилучшим стабилизатором активности
PAL

при ли
о
филизации обладает 0,5%

ный

ра
с
т
вор
D

трегалозы.


Глава
8
.
Разработка технологии получения
специализированных
м
о
лочных продуктов и п
рактическая реализация

результатов исследований
.
Проведенный ц
икл комплексных экспериментальных и теоретических исследов
а
ний послужил предпосылкой для созда
ния новых видов специализированных
продуктов
питания
с использованием

L

фенилаланин

аммоний

лиазы
.

Технология
включа
ет

в себя
ферментативную обработку молочного сырья энзиматической
системой
,

состоящей из эндо


и эк
з
опептидаз с целью максимального удаления

фенилаланина из полипептидной цепи с последующей биотехнологической обр
а
боткой
L

фенилаланин

аммоний

лиазой, обеспечивающей биотрансформацию
фенилаланина в соединения, не оказывающие токсического действия на о
р
ганизм
больного
,

и
,

тем самым
,

уменьшени
е

его

содержания

в молочном эквиваленте до
Рис
унок

1
6



Продолжительность
лиофильной

сушки
PAL

в зависимости от температуры су
ш
ки:




температура
сушки 20
±1
º
С;




температура сушки 30
±1
º
С;




температура сушки 40
±1
º
С

20 30 40

Продолжительность сушки, мин

Температура сушки, °С

Температура, °С

Продолжительность сушки, ч


30
0,001%. Данный молочный эквивалент может быть основной для создания целого
ряда специализированных молочных продуктов для больных фенилкетонурией
(молочных
, белковых

и пр.). Технологические принципы получения белкового

э
к
вивалента продукта, предназначенного для лечения больных фенилкетонурией
,

легли в основу ряда патентов и других документов.

Основные научно

технические разработки, полученные при выполнении
работы, показаны в та
б
лице 20.

Таблица 20


Н
аучно

технические

разработки, полученные при выполнении раб
о
ты


п/п

Вид

документа

Наименование документа

Номер док
у
мента и дата

Место
и дата внедр
е
ни
и
я

Специализированные продукты

1

Патент РФ

Способ получения белков
о
го
эквивалента продукта, пре
д
назначенного для лечения

больных фенилкетон
у
рией

2376893

от
27.12.2009

ООО Биотек»
,

11.05.2012 г.

2

Патент РФ

Б
иологически активный

пептид, полученный из

молочн
о
го белка

2415943

от 10.04.2011

ООО Биотек»
,

20.09.2013 г.

3

Патент РФ

С
пособ получения поверхн
о
стно

модифицирован
ных

наночастиц для иммобилиз
а
ции биологических в
е
ществ

2425879

от 10.08.2011

ООО Биотек»
,

16.01.2012 г.

4

Патент РФ

Способ производства

мультиферментного

препар
а
та

2437935

от
27.12.2011

ООО Инновацио
н
но

исследовательский
центр»
, 05.07.2012 г.

5

Пате
нт РФ

Способ иммобилизации

L

фенилаланин

аммоний

лиазы на магнитных

наноч
а
стицах

2460790

от 10.09.2012

CusterNanoTech LTD
(
Англия)
,

лицензио
н
ный договор №
4/13


от 20.12.2013 г.

6

Технич
е
ские
усл
о
вия

Технология производства
белковых продуктов для
боль
ных фенилкетонурией:
Фелинфри

9197

145

02068315

2012 от
28.01.2013

CusterNanoTech LTD

(Ан
г
лия)
, 20.12.2013 г.

7

Технологич
е
ская

инстру
к
ция

Технология производства
белковых продуктов для
больных фенилкетонурией:
Фелинфри

9197

145

02068315

2012

от 28.01
.2013

CusterNanoTech LTD

(Ан
г
лия)
, 20.12.2013 г.

Ферментный препарат

8

Технич
е
ские
усл
о
вия

Производство

L

фенилаланин

аммоний

лиазы

9291

144

02068315

2011
от 27.07.2011

CusterNanoTech LTD

(Ан
г
лия)
, 20.12.2013 г.

9

Технологич
е
ская

инстру
к
ция

Произв
одство

L

фенилаланин

аммоний

лиазы

9291

144

02068315

2011
от 27.07.2011

CusterNanoTech LTD

(Ан
г
лия)
, 20.12.2013 г.

10

УМК

по н
а
правлению
240700
Биотехн
о
логия»

Рабочие программы, курс
лекций, лабораторные раб
о
ты


ФГБОУ ВПО Кем
е
ровский технологич
е
ский
институт пищ
е
вой промышленн
о
сти»
, 10.02.2014 г.

1
1

Методика

Методика
идентификации
01.00114/

Институт молекуля
р

31
микроорганизмов,

облада
ю
щих
L

фенилаланин

аммоний

лиазной

активн
о
стью

104

21

12

от 16.09.2013

ной биологии (ИМБ)
Национальной акад
е
мии наук Ре
спублики
Армения (НАН РА)
,
10.02.2014 г.

12

Рецептуры

Рецептуры питательных

сред для культивирования
пигментных дрожжей

01.01264/

212

21

11

от 16.09.2013

Институт молекуля
р
ной биологии (ИМБ)
Национальной акад
е
мии наук Республики
Армения (НАН РА)
,
10.02.2
014 г.

13

Методики

Методики выделения и

оч
и
стки
PAL

01.00106/

006

21

11 от
10.10.2013

Институт молекуля
р
ной биологии (ИМБ)
Национальной акад
е
мии наук Республики
Армения (НАН РА)
,
10.02.2014 г.

14

Методика

Методика иммобилизации
PAL

на наночастицы окс
и
да

железа

01.00107/

007

21

11 от
31.10.2013

ФГБОУ ВПО Н
а
циональный исслед
о
вательский Томский
политехнический
университет»,
09.09.2013 г.

15

Методика

Методика лиофилизации
PAL

01.00108/

008

21

11 от
05.11.2013

ЗАО Хладотехн
и
ка»
,

10.02.2014 г.

16

Свиде

т
ел
ь
ство

Методика определения

к
о
ричной кислоты и ее солей
методом капиллярного

электрофореза в алкогол
ь
ных
и газированных безалкогол
ь
ных напитках, гидр
о
лизатах

м
о
лочных белков

01.00225/

205

21

11

от 19.04.2011

CusterNanoTech LTD

(Ан
г
лия),

20.12.2013 г
.

17

Свиде

тел
ь
ство

Программа моделирования

периодического процесса
культивирования пигмен
т
ных
дрожжей

2014611451 от
03.02.2014 г.

Институт молекуля
р
ной биологии (ИМБ)
Национальной акад
е
мии наук Ре
с
публики
Армения (НАН РА),
ФГБОУ ВПО Кем
е
ровский техноло
гич
е
ский институт пищевой
промышленности»,
10.02.2014 г.


Основная часть технологических разработок прошла апробацию
на
предприятиях биотехнологической и пищевой промышленности:

в Институте

молекулярной биологии (ИМБ)
Национальной академии наук Республики

А
р
мения (НАН РА), ЗАО Хладотехника»,
ФГБОУ ВПО

Национальный иссл
е
довательский Томский политехнический университет»
и внедрены в произво
д
ство в Англии (CusterNanoTech LTD) путем трансфера технологий в рамках л
и
цензионного договора №4/13

от
20.12.2013 г
.


32
РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ


1.

На основании анализа результатов собственных исследований
разраб
о
тана биотехнология
специализированных молочных продуктов с использован
и
ем
L

фенилаланин

аммоний

лиазы
,

сущность

которой заключается в фермент
а
тивной обработке молочного
сырья энзиматической системой
,

состоящей из
эндо


и эк
з
опептидаз с целью максимального удаления фенилаланина из пол
и
пептидной цепи с последующей биотехнологической обработкой
L

фенилаланин

аммоний

лиазой, обеспечивающей биотрансформацию фенилал
а
нина в
соед
инения,

не оказывающие токсического действия на организм бол
ь
ного
,

и
,

тем самым
,

уменьшени
е

его содержания

в молочном эквиваленте до
0,001%
. Раскрыты технологические параметры получения
L

фенилаланин

аммоний

лиаз
ы

и специализированных продуктов на ее основ
е,
исследованы
биотехнологические процессы, обеспечивающие формирование их органоле
п
тических, физико

химических и микробиологических п
о
казателей.

2.

Р
азработа
на

технологи
я

получения направленных гидролизатов
белков
молочной сыворотки,
предназначенных
для

полу
чени
я

продуктов
для
больных ф
е
нилкетонурией.
Подобрана
энзиматическая система: алкалаза, карбоксипептидаза
А, лейцинаминопептидаза

в соотношении 1:1:1
, обеспечивающая максимальное
удаление фенилаланина из полипептидной цепи белков молочной сыворотки. П
о
доб
раны оптимальные параметры процесса гидролиза:
температура 50±1°С, пр
о
должительность 90

мин
, соотношение фермент

субстрат 1:25, рН среды 7,0
0
±0,01
.

3.

Р
азработана стратегия скрининга пигментных дрожжей, отлича
ю
щихся
высоким уровнем синтеза
PAL
,

и проведено фи
логенетическое позициониров
а
ние выбранных штаммов

продуцентов
L

фенилаланин

аммоний

лиазы.
Создана

ПЦР

тест система для

идентификации гена
pa

пи
г
ментных дрожжей. В
ыбраны
следующие универсальные праймеры:
п
рямой

Ra
2
F

(
5'


СCGAYAACCCYCTSATMGA

3'

и о
братны
й праймер
RaR


(5'


ATGCCCTCGTCGTCCTTGACCTTGA

3'
.

Установлены оптимальные пар
а
метры проведения процесса амплификации:

95
±1
º
С, 60
±1

с, 30 циклов (95
±1
º
С,
30
±1

с.; 64
±1
º
С, 30 с; 72
±1
º
С
;

60
±1

с).


4.

Проведено прямое секвенирование ПЦР

фрагментов исследуемых
шт
аммов
.
У
становлено, что
штаммы
Aureobasiiu

puuans

Y
863,
Buera

aba

Y
1581,
B
.
piricoa

Y
1577,
Cania

abrata

Y
2813,
C
.

atosa

Y
242,
Cryptoco
c
cus

aurentii

Y
227,
Cr
.
acerans

Y
2763,
Cystofiobasiiu

capitatu

Y
1852,
Debary
o
yces

casteii

Y
968,
D
.
robertsiae

Y
3392,
Dioszeia

hunarica

Y
3208,
D
.
sp
.
Y
3320,
Geotrichu

kebahnii

Y
3053,
Phaffia

rhoozya

Y
1668,
Rhoosporiiu

iobovatu

Y
1565,
Rh
.
infiroiniatu

Y
1569,
Rhootorua

utinis

Y
77,
Rh
.
a
c
tosa

Y
2770,
Rh
.
rubra

Y
1193,
Saccharoyces

cerevisia
e

Y
1127,
S
.

kuyveri

Y
2559,
Sporobooyces

hosaticus

Y
991 содержат ген
pa
.
А
нализ сходства нуклеоти
д
ных и аминокислотных последовательностей гена
pa

изучаемых и референ
т
ных штаммов из базы данных
GenBank

для некоторых видов

показал
93

97%
принадлежность

последовательностей к генам
pa
.

У
становлено
, что

клетки

в
ы
деленных
дрожжей имеют круглую, овальную и
цилиндрическую

форму
, р
азм
е
ры взрослых» клеток


от 1,
0

до
8,0

мкм по ширине и
до
стигают

17

мкм в
длину у

33
продолговатых кл
е
ток.

Выявлены штаммы, обладаю
щие наибольшей
PAL

активностью:
Aureob
a
siiu

puuans

Y863
,
Rhoosporiiu

infiroiniatu

Y
1569,
Cania

abrata

Y
2813,
C
.
atose

Y
242,
Debaryoyces

robertsiae

Y
3392,
Rhoosporiiu

iob
o
vatu

Y
1565,
Rhootorua

actose

Y
2770,
Saccharoyces

cerevisiae

Y
1127,
Ti
e
tiopsis

washintonensis

Y
1650,
Toruopsis

apicoa

Y
566,
Treea

foiacea

Y
1624,
Rh
.

rubra

Y
1193,
Debaryoyces

casteii

Y
968
.

На основании

моделировани
я

пр
о
цесса биосинтеза
PAL

пигментными дрожжами
с
формулированы рекомендации
выбора активного

продуцента
PAL
.
Показано, что ш
тамм

Aureobasiiu puuans

Y
863 обладает, при прочих равных условиях, большей
PAL

активность
ю

по сра
в
нению
c

другими штаммами прод
у
центами.

4
.
Разработа
на

технологи
я

получени
я

PAL
.
Сформирован

с
остав

пит
а
тельной среды:
Na
C

(0,5%), глюкоз
а

(20%), дрожжево
й

экстракт (5%), пептон
(10%),

тирозин (0,2%).

Выявлено
, что
рекомендуемым
и параметрами

периодич
е
ского
культивирования в ферментёре объёмом 5
дм
3

явля
ются: т
емператур
а

26
±1
°С, рН 7,0, продолжительность процесса 5

ч
, интенс
ивное перемешивание

(100 об/мин) и принудительн
ая

подач
а

воздуха (10

д
м
3
/мин).
При этом достигается
концентр
а
ция белка
не менее
9,45 г/
д
м
3

и активность
L

фенилаланин

аммоний

лиазы
не менее
1,61 Е/
см
3
.


5
.

Разработана
методика

очистки
L

фенилаланин

аммоний

лиазы
из кл
е
ток
Aureobasiiu puuans

Y
863
,
включающая

дробное осаждение сульфатом
аммония и гидрофобную хроматографию. При гидрофобной хроматографии
фермент элюируется двумя пиками. 70% фермента эллюируется в первой фра
к
ции с удельной активностью 3,0 Е
/мг

белка
, и около 30% фермента с удельной
а
к
тивностью 2,4 Е/мг
белка


во второй фракции.

6
.
Разраб
о
тана технология получения иммобилизованной
L

фенилаланин

аммоний

лиазы
,

включающая следующие стадии: химическая функционализ
а
ция наночастиц
Fe
3
O
4

тиофенов
ыми группами; отмывка наночастиц
Fe
3
O
4
от
остатков продуктов реакции; высушивание наночастиц
Fe
3
O
4
; иммобилизация
PAL

на функционализированные наночастицы
Fe
3
O
4
; высушивание иммобил
и
зованного препарата; хранение и реализация препарата.

Т
ехнология

лиофилиз
а
ции
PAL
, обеспечивающ
ая

максимальное сохранение ее активности
,

определяется
продолжительность
ю

процесса 6
,0
±
0,
1

ч
; плотность
ю

теплового потока 9,2 кВт/м
²;
остаточн
ым

давление
м

250
±
10

Па.

Установл
ено
, что наилучшим стабилизатором
активности
PAL

при лиофили
зации обладает 0,5%

ны
й

ра
с
твор
D

трегалозы.

8
.
Сформулированы
и экспериментально
подтверждены
технологические
принципы
получения
специализированных
молочных продуктов
с использован
и
ем

L

фенилаланин

аммоний

лиазы
, предназначенных для питания больных ф
е
нилк
етонурией
.
Созданы оригинальные технические решения

(
новизна подтве
р
ждена патен
тами РФ
),

которые прошли апробацию на предприятиях
отра
с
ли.







34
Основные публикации по материалам диссертации:


Монографии


1.

Бабич, О.О
.
Технология получения биологически активн
ых пептидов из
белков молока / О.О. Бабич, О.В. Козлова, И.С. Разумникова.



Кемерово:

Ку
з
бассвузиздат, 2011.



120 с.

2.

Бабич, О.О.

Биотехнология L

фенилаланин

аммоний

лиазы / О.О Бабич.


Новосибирск: Наука, 2013
.



199

с.


Статьи
,

индексируемы
е

в

Scopus

и

Web

of

Science


3.

Prosekov
,

A.Yu. Deterination of cinnaic aci by capiary zone eectrophoresis
usin ion

pair reaents / A.Yu. Prosekov, O.V. Murikova,
O.O. Babich

// Journa of
Anaytica Cheistry.



2012.


V
.
67.


№ 5.


С
. 474

477
.

4.

Recobinant
L

phen
yaanine aonia yase fro
Rhoosporiiu toruoies

as a
potentia anticancer aent / O
.
O. Babich, V
.
S. Pokrovsky, N
.
Yu. Anisiova, N
.
N. Sok
o
ov, A
.
Yu. Prosekov // Biotechnooy an Appie Biocheistry.


2013.


V
.
60
.



3
.


P. 316

322
.

5.

Babich, O.O.

Eff
ect of

yophiization
conitions of r
ecobinant L

phenyaanine

a
onia

yase on
e
nzye
p
roperties / O.O. Babich, L.S. Dyshyuk, A.Y. Prosekov //
Mie

East Journa of Scientific Research.


2013.


№15 (10).


Р. 1455

1459.


Статьи в журналах, рекомендован
ных ВАК


6.

Биологически активные пептиды из белков молока /

О.В. Козлова, И.С. Разумникова,
О.О. Бабич
, А.Ю. Просеков // Молочная пр
о
мышле
н
ность.


№9.


2010.


С.

68

69.

7.

Сухих, С.А.
Технология выделения и очистки
L

фенилаланин

аммоний

лиазы

/
С
.
А
.
Сухих
,
О.
О
.
Бабич
,
Л.С. Солдатова

//
Д
остижения

науки и техники
АПК.


№9
.


2010.


С.

78

80.

8.

Бабич
,

О.О.

Б
иологически активные ферментативные гидролизаты /

О.О. Бабич, О.В.

Козлова // Молочная промышленность.


2011.


№ 12.


С.

71

71.

9.

Бабич, О.О.
Клонир
ование и экспрессия гена L

фенилаланин

аммоний

лиазы в
Escherichia coi

и выделение рекомбинантного белка /
О.О. Бабич,

Л.С. Солдатова,

И.С. Разумникова

// Техника и технология пищевых прои
з
водств.


2011.


№1.


С.

8

13.

10.

Бабич
,

О.О.

Особенности биотрансфор
мации фенилаланина в технологии
продуктов питания для больных фенилкетонурией
/ О.О. Бабич, Л.С. Солдат
о
ва, И.С. Разумникова //
Техника и технология пищевых производств.


2011.


№2.


С.

103

109.

11.

Бабич, О.О.

Клонирование и экспрессия гена
pa

и х
а
рактеристи
ка

L

фенилаланин

аммоний

лиазы / О.О. Бабич, Л.С. Солдатова, А.Ю. Просеков //
Биотехнол
о
гия.


2011.


№4.


С.

31

39.

12.

Выделение, очистка и некоторые свойства рекомбинантной
L

фенилаланин


35
аммоний

лиазы
R
hoosporiiu toruoies
, экспрессированной в клетках
E
. coi

/
О.О. Бабич
, Л.С. Солдатова, И.С. Разумникова, А.Ю. Просеков

//

Фундаме
н
тальные исследования.


2011.


№8.


С.

597

602.

13.

Бабич, О.О.
Сравнительная оценка адсорбционного и глутаральдегидного
методов иммобилизации
L

фенилаланин

аммоний

лиазы на частица
х Fe
3
O
4

/
О.О. Бабич, Л.С. Солдатова, А.Ю. Просеков //

Фундаментальные исследов
а
ния.


2011.


№8.


С.

672

677.

14.

Изменение протеолитической активности иммобилизованного фермента х
и
мотрипсина в процессе хранения / Л.С. Солдатова,
О.О. Бабич
, Е.В. Короткая,
М.Г
. Курбанова // Хранение и переработка сельхозсырья.


2011.


№11.


С.41

43.

15.

Бабич, О.О.
Особенности биотрансформации фенилаланина в технологии
продуктов питания для больных фенилкетонурией / О.О. Бабич, Л.С. Солдат
о
ва, И.С. Разумникова // Техника и технолог
ия пищевых производств.


2011.


Т.21.


№ 2.


С.

103

108.

16.

Просеков, А.Ю.
Опыт кафедры 
Б
ионанотехнология»
К
емеровского те
х
нологического института пищевой промышленности в области биотехнологии
получения рекомбинантных ферментных препаратов / А.Ю. Просеков,

О.О. Бабич
, Л.С. Солдатова // Техника и технология пищевых производств.


2012.


Т.3.


№ 26.


С.

102

111.

17.

Просеков
,

А.Ю.
О
пределение коричной кислоты методом зонного капи
л
лярного электрофореза с использованием ион

парных реагентов / А.Ю. Прос
е
ков, О.В. Муд
рикова,
О.О. Бабич

// Журнал аналитической химии.


2012
.


Т.67.


№ 5
.


С.

531.

18.

Бабич, О.О.

Оптимизация параметров лиофилизации рекомб
и
нантной

L

фенилаланин

аммоний

лиазы / О.О. Бабич, С.А. Сухих, Л.С. Солдатова,

А.Ю. Просеков // Технологии живых систем.


2013.


Т.10.


№ 1.


С.028

034.

19.

Ферментативный гидролиз молочно

белкового концентрата / О.В. Бессон
о
ва,
О.О. Бабич
, Г.В. Борисова, И.Е. Драгунов // Молочная промышленность.


2012.


№ 12.


С.

55

56.

20.


Бабич
,

О.О.

Изучение свойств свободной и иммобилизова
н
ной


L

фенилаланин

аммоний

лиазы из
R
hoosporiiu toruoies

на силохроме С

80
/

О.О. Бабич, Л.С. Солдатова // Известия Самарского научного центра Росси
й
ской академии наук.


2012.


Т.14.


№ 1.


С.

279

282.

21.

Особенности получения иммобилизованного протеолитиче
ского фермента
на основе наночастиц
F
e
3
O
4

для молочной промышленности / Л.С. Солдат
о
ва,
О.О. Бабич
, А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая // Хранение и переработка сельхо
з
сырья.


2012.


№ 8.


С.

47

50.

22.

Ostrouov, L.A. Usee of ik prouction waste for obtainin f
unctiona foo
proucts for baby an ietetic nutrition / L.A. Ostrouov, A.Y. Prosekov,
O.O. Babich
,
I.S. Mienteva, A.I. Linnik, M.M. Sutorina // European Journa of Natura History.


2013.


№ 2.


С
. 41

45.

23.

Бабич, О.О.
Оптимизация параметров лиофилизаци
и рекомбинантной

L

фенилаланин

аммоний

лиазы
/ О.О. Бабич
, Л.С. Солдатова, А.Ю. Просеков
// Технология живых систем.


2013.


Т.10.


№1.


С.

28

34
.

24.

Особенности ферментативного гидролиза молочного белкового концентрата

36
эндои экзопептидазами / О.В. Бессонова
,
О.О. Бабич
,

Г.В. Борисова, И.Е. Драг
у
нов // Хранение и переработка се
льхозсырья.


2013.


№ 1.


С. 33

35.

25.

Остроумов
,

Л.А. Оценка состава и физико

химических свойств фермент
а
тивных гидролизатов казеина /

Л.А.
Остроумов,
О.О.
Бабич
,
И.С.
Милент
ь
ева
//
Вес
тник ВСГТУ.


2013.


№ 1.


С. 82

85.

26.

Бабич
,

О.О.

Оптимизация лиофилизации
L

фенилаланин

аммоний

лиазы /
О.О. Бабич, А.Ю. Просеков // Биомедицинская химия.


2013.


В
ып.6
.


Т
.59.


С
тр.

682

692.

27.

Бабич
,

О.О.

Очистка целевого белка и иммобилизация
L

фенилаланин

аммоний

лиазы на наночастицы оксида железа /
О.О. Бабич, А.Ю. Прос
е
ков
//
Нанотехнологии и наноматериалы.


2013.



3.


С. 55

59.

28.

Бабич
,

О.О.

Моделирование непрерывного биотехнологического процесса
получения
L

фенилаланин

аммоний

лиазы / О.О. Бабич, А.Ю. П
росеков,

Л.С. Солдатова // Известия высших учебных заведений: Серия Химия и хим
и
ческие технологии.


2013.


Т
.
56.


Вып. 4.


С.

106

109.


Научные труды институтов


29.

Особенности использования
L

тирозин

аммоний

лиазы в технологии пр
о
дуктов специального назначе
ния / А.В. Дороганова,
О.О. Бабич
,

А.Ю. Просеков // Продукты питания и рациональное использование сырьевых
ресурсов:
с
борник научных работ
.


Кемерово
,

2009.


В
ы
пуск 20.


С.

27

28.

30.

Babich
,
O
.
O
.
Expression

of


recobinant


L

phenyaanine

aonia

yase

in

E
scherichia

coi

/
O
.
O
.
Babich
,
L
.
S
.
Dushyuk
,
I
.
S
.
Mient'eva // Foos an Raw M
a
terias.


2013.


V
.
1.


№1.


Р. 48

53
.

31.

Babich, O.O.

Stuy of physicocheica an thera properties of

L

phenyaanine aonia

yase / O.O. Babich, E.V. Urih // Foos an Ra
w Mat
e
rias.


2013.


Vo
. 1 (№2).


P
. 50

56.

32.

Antituor activity of recobinant L

phenyaanine aonia yases /

О
.
О
. Babich
, M.V. Novoseova, V.S. Pokrovsky, N.Yu. Anisiova, N.N. Sokoov,
A.Yu. Prosekov //

Biooica Journa of Arenia.


2013.


V.1 (65)
.


P.

47

49.

33.

Investiation of
tf

ene expression in peripas of
е
.coi ces 118 /

M. Novoseova,
O. Babich
, L. Dyshyuk, A. Prosekov //

Biooica Journa of Ar
e
nia.


2013.


V
.1 (65).


P
. 118

119.


Материалы
зарубежных
симпозиумов, конгрессов, конфере
нций


34.

Солдатова, Л.С. Свойства L

фенилаланин

аммоний

лиазы, иммобилиз
о
ванной на наночастицах Fe
3
O
4

/ Л.С. Солдатова,
О.О. Бабич

//

Международная
научная студенческая конференция

2011: сборник научных работ.


Новос
и
бирск, 2011.


С. 95.

35.

Babich
,

O
.
O
.
Receivi
n

L


phenyaanine

aonia

yase

fro

ce

E.
с
oi

an
stuy its cataytic activity / О.О. Babich, M.V. Novoseova, A.J. Prosekov // Sc
i
ence,
Technooy an Hiher Eucation: aterias of the internationa research an pra
c
tice conference
.


Westwoo, 2012
.


P.

335

338.


37
36.


Babich
,

O.O.

The Seection of L

phenyaanine
а
onia


yase

yophiization
p
araeters / O.O. Babich, A.J. Prosekov, M.V. Novoseova //
European Appie
Sciences:
oern approaches in scientific researche:

3
r

Internationa scientific co
n
fer
ence
.


Habur
, 2013.


P
. 8

9.

37.


Optiization of freeze starters for irect inocuation
paraeters
/

A.
Y
. Prosekov,
O.O. Babich
,
S.A. Suhih,
S.J. Noskova

//
European Appie
Sciences:
oern approaches in scientific researches:

4
r

Interna
tiona scientific

co
n
fe
r
ence
.


Habur
, 2013.


P
. 142

143.

38.


Babich
,
O.O.

The ain aspects of iobiization of L

phenyaanine a
o
nia

yase on iron oxie nanopartices /
О
.
О
. Babich
, L.S. Dyshjuk, A.
Y
. Prosekov
//
European Appie Sciences:
oern approaches in scientifi
c researches:
4
r

Intern
a
tiona scientific conference
.


Habur
, 2013.


P
. 77

78.

39.


Babich
,

O
.
O
.

Pecuiarities of the recobinant enzye L

phenyaanine a
o
nia

yase

/ O.O. Babich
// Appie Sciences an technooies in the Unite States an
Europe: coon

chaenes an scientific finins
: Papers of the 1
st

Internationa
Scientific Conference
.


New York, 2013.


P.175

176.

40.


Babich, O.O.

Deveopent of chroatoraphic syste for aocation an
ceanin of
L

phenyaanine aonia

yase
receive by enetic e
nineerin

/

O.O. Babich, L.S. Dyshjuk, A.Y. Prosekov // Research Journa of Internationa St
u
ies.


2013.


№6(13).


Р
.24

26.

41.


Babich
,

O.O.

Desinin of L

phenyaanine

aonia

yase strain

proucer on
the basis of ces Escherichia coi

/ O.O. Babich, A
.Y. Prosekov
//

Theoretica &

A
p
pie Science Wor of Science»: aterias of the Internationa
Scientific Practica
Conference.


Habur.


2013.


P.
65

68.

42.


Babich, O.O
. The ain aspects of iobiization of L

phenyaanine a
o
nia

yase on iron oxie nan
opartices / O.O. Babich, L.S. Dyshjuk, A.Y. Prosekov // Eur
o
pean Appie Sciences: oern approaches in scientific researches, proceeins of the
4th Inter
nationa scientific conference.


Stuttart:
ORT Pubishin.


2013.


P. 77

78.


Материалы
российских

симпозиумов, конгрессов, конференций


43.

Разработка технологии иммобилизации L

фенилаланин

аммоний

лиазы на
ферромагнитные наночастицы /
Л.С.
Солдатова
,

О.О. Бабич
,
А.Ю.
Пр
о
секов //
Материалы Всероссийской конференции с элементами научной школы для

м
о
лодежи
.


Белгород.


2009.


С. 7

8
.

44.


Нанокомпозитный материал для иммобилизации и фракционирования фе
р
ментов в биотехнологии / Л.С. Солдатова,
О.О. Бабич
,

А.Ю. Просеков // Наук
о
емкие технические технологии

2009
: сборник тезисов докладов III Молодежной
научно

техн
ической конференции
.


Москва
,

2009
.


С. 84.

45.


Солдатова, Л.С.
Особенности получения нанокомпозитных материалов
для иммобилизации и фракционирования биологических веществ в молекуля
р
ной биологии, генной инженерии и пищевой промышленности / Л.С. Солдат
о
ва,
О.
О. Бабич
, А.Ю. Просеков // Втор
ой

международный конкурс работ мол
о
дых ученых в области нанотехнологий
:

с
борник тезисов докладов участников
.


Москва
,

2009.


С. 810

811.


38
46.


Метод Дюма как способ кон
т
роля концентрации белка при получении
иммобилизованных фермен
тов для молочной промышленности / Л.С. Солдат
о
ва,
О.О. Бабич
, А.В. Крупин // Инструментальные методы для исследования
живых систем в пищевых производствах
: материалы всероссийской конфере
н
ции с эл
е
ментами научной школы
.


Кемерово, 2009
.


С. 83

86.

47.


Солдато
ва, Л.С.
Применение поверхностно

модифицированных наноч
а
стиц
Fe
3
O
4

для и
м
мобилизации биомолекул

/
Л.С. Солдатова, О.В. Мудрикова,

О.О. Бабич
, Н.С. Величкович
// IX Конференция молодых ученых Актуальные
пр
о
блемы современной неорганической химии и материа
ловедения: нанохимия,
н
а
номатериалы и нанотехнологии
: тезисы докладов
.


Звенигород, 2009.


С. 50
.

48.


Бабич
,

О.О.

Особенности экспрессии гена
L

фенилаланин

аммоний

лиазы
R
hoosporiiu toruoies
в клетках
E
.
с
oi

/

О.О. Бабич, И.С. Разумникова,

А.Ю. Просеко
в //
Исследование, разработка и применение высоких технологий в
пр
о
мышленности:
сборник трудов десятой международной научно

практической
конференции
.


Санкт

Петербург, 2010.


С. 27

28.

49.


Получение
L

фенилаланин

аммоний

лиазы с целью разработки технол
о
гии пр
одуктов питания для больных фенилкетонурией /
О.О. Бабич
,

Л.С. Солдатова, А.Ю. Просеков //
Современная наука: теория и практика
: сбо
р
ник нау
ч
ных работ
.


Ставрополь, 2010.


С. 403

406.

50.


Особенности получения L

фенилаланин

аммоний

лиазы
Rhoosporiiu
toru
oies

в клетках
E. coi

/
O
.
О. Бабич
, А.Ю. Просеков //
Н
а
учно

практические аспекты развития современной техники и технологий в условиях
курса на инновации
: сборник трудов I всероссийской научно

практической (з
а
очной) конференции.


М.: Издательско

полиграфи
ческий комплекс НИИРРР,
2010.


С. 6

8.

51.



Бабич О.О
. Разработка технологии очистки рекомб
и
нантной

L

фенилаланин

аммоний

лиазы //
Наука и современность


2011: Наука и совр
е
менность


2011
: сборник
докладов
VIII международной научно

практической
конференции
.


Новосибирск: Изд
а
тельство НГТУ.


2010.


С.

17

21.

52.


Бабич
,

О.О
.Разработка техн
о
логии получение
L

фенилаланин

аммоний

лиазы и изучение возможности ее использования в технологии продуктов пит
а
ния для больных фенилкетонурией / О.О. Бабич, Л.С. Солдатова, И.
С. Разумн
и
кова //
Инновационность и многоуровневый менеджмент в современном Ро
с
сийском обществе:
в
сероссийская научно

практическая конференция.


Волг
о
град
,

2011.


С. 304

307.

53.

Бабич, О.О.

Выбор оптимальных значений лиофилизации ферментного
препарата L

фенил
аланин

аммоний

лиазы
/ О.О. Бабич
// Наука в современном
мире: материалы
VIII

международной научно

практической конференции.


М.:
Изд
а
тельство Перо», 2011.


26

28.

54.


Бабич
,

О.О
. Определение каталитической активности фе
р
мента


L

фенилаланин

аммоний

лиазы, п
олученной для производствапродуктов пит
а
ния больных фенилкетонурией /
О.О. Бабич, Л.С. Солдатова, С.А. Сухих

//

М
о
лодежная наука


пищевой промышленности
: материалы
II

международной н
а
учной конференции
.


СевКавГТУ
,

2011.


С.

4

7.


39
55.



Бабич
,

О.О
. Изучение вли
яния температуры лиофилизации на свойства
L

фенилаланин

аммоний

лиазы

/

О.О. Бабич, И.С. Разумникова

//

Современное
состояние естественных

и

технических наук: материалы II
м
еждународной н
а
учно

практической конф
е
ренции.


Москва,
2011.


С.

18

20.

56.



Бабич
,

О.
О
.

Изучение ст
а
бильности фермента L

фенилаланин

аммоний

лиазы в процессе замораживания и оттаивания

/

О.О. Бабич, С.А. Сухих, И.С. Р
а
зумникова

//
Современное состояние естественных технических наук: м
а
териалы
II Международной научно

практической конференци
и.


Москва, 2
011.


С. 21

23.

57.


Бабич
,

О.О
.

Особенности лиофилизации
L

фенилаланин

аммоний

лиазы

//

Современные достижения биотехнологии» и межд
у
народного

научно

практического семинара
Феномен молочной сыворотки: синтез науки, теории и
практики
: сборник мате
риалов международной научно

технической конфере
н
ции
.


Ч
.
2.


Москва,
2011.


С.

4

5
.

58.



Бабич
,

О.О.

О
сновные этапы экспрессии
L

фенилаланин

аммоний

лиазы
Rhoosporiiu toruoies

в клетках
E.
с
oi

// Современное состояние естестве
н
ных и технических наук
: ма
териалы
III

Межднародной научно

практической
конференции
.


М.: Издательство Спутник

»
,

2011.


С.

24

26.

59.



Бабич
,

О.О.
Основные при
н
ципы очистки рекомбинантной

L

фенилаланин

аммоний

лиазы // Актуа
льные вопросы современной науки: материалы
XII

Ме
ж
дународной

научно

практической конференции
.


М.: Издательство Спутник »
,

2011.


С.160

163.

60.


Измерение активности

L

фенилаланин

аммоний

лиазы
,

выделенной из
Rhoosporiiu toruoies

с целью создания функциональных и специализир
о
ванных продуктов питания /
О.О. Баби
ч
, И.С. Разумникова, С.А.
C
ухих,

Ю.С. Малова // Технологии и оборудование химической, биотехнологической и
п
и
щевой промышленности
: материалы 4

й всероссийской научно

практической
конференции студентов, аспирантов и молодых ученых с международным уч
а
стием
.


Бийск
,
2011.


С.

258

261.

61.


Бабич
,

О.О.
О
сновные принципы измерения каталитической активности

L

фенилаланин

аммоний

лиазы, выделенной методом клонирования // Актуал
ь
ные проблемы естественных наук
: матери
а
лы международной заочной научно

практической конфе
ренции
.


Новос
и
бирск
,

2011.


С.

7

10.

62.



Измерение активности
L

фенилаланин

аммоний

лиазы, выделенной из
Rhoosporiiu toruoies

с целью применения ее в пищевой промышленности
для создания функциональных и специализированных продуктов питания /
О.О. Бабич
, И.С. Разумникова, С.А. Сухих, Ю.С. Малова //
Материалы
4

ой

в
сероссийск
ой

научно

практическ
ой

конференци
и

студентов, аспирантов и м
о
лодых ученых с
м
еждународным участием
.


Бийск: Издательство Алтайского
государственн
о
го технического университета
,

20
1
1
.


С.

258

261.


Патенты
РФ


63.


Патент №

2376893
РФ
, МПК А23L 1/
305
. Способ получения белкового экв
и
валента продукта, предназначенного

для лечения больных фенилкетонурией /


40
А.Ю. Просеков,
О.О. Бабич
, Л.А. Остроумов; патентообладатели


А.Ю. Прос
е
ков,
О.О. Бабич
, Л.А. Остроумов; заявл.
04
.0
6
.200
8
; опубл. 2
7
.12.200
9
.


Бюл. №
36
.


64.


Патент


2415943

РФ.

Биологически активный пептид, полученный из
молочного белка

/ О.В. К
озлова,
И.С.
Разумникова,
О.О.

Бабич
,
А.Ю.
Прос
е
ков,
М.Г.
Курбанова
; патентообладатели


О.В. Ко
злова, И.С. Разумникова,
О.О.

Бабич
, А.Ю. Просеков, М.Г. Курбанова
, заявл. 16.02.2010
;

опубл.
10.04.2011
.


Б
юл. №10.


65.

Патент



2425879 РФ. Способ получения поверхностно

модифицированных наночастиц для иммобилизации биологических веществ /
А.Ю. Просеков,
О.
О.
Бабич
, Л.С. Солдатова; заявитель и патентообладатель
Кемеровский технологический институт пищевой промышленности, заявл.
16.02.2010; опубл. 10.08.2011 г.


Бюл. №1
6.

66.


Патент №

2437935 РФ. Способ производства мультиферментного преп
а
рата / А.В. Крупин,
О.О
. Бабич
, С.А. Сухих, А.Ю. Просеков, Е.В. Короткая;
заявитель и патентообладатель ООО Инновационно

исследовательский
центр», заявл. 10.09.2009
;
опубл
. 27.12.2011 г.


Бюл. №36.

67.

Патент №

2460790 РФ. Способ иммобилизации
L

фенилаланин

аммоний

лиазы на магнитн
ых наночастицах / А.Ю. Просеков,
О.О. Бабич
, Л.С. Солдат
о
ва; заявитель и патентообладатель Кемеровский технологический институт п
и
щевой промышленности; заявл. 06.07.2010; опубл. 10.09.2012.


Бюл. №25.


Отчеты по НИОКР


76
. Молекулярное клонирование и эк
спрессия гена
pa
, обеспечивающего би
о
трансформацию фенилаланина с целью разработки технологии получения пр
о
дуктов питания для лечения больных фенилкетонурией / С.А. Сухих
,

О.О. Бабич

// Научно

технический отчет №02201050595
по государственному

контракту
№П1701.


Кемер
о
во, 2009.


46 с.

77
. Молекулярное клонирование и экспрессия гена
pa
, обеспечивающего би
о
трансформацию фенилаланина с целью разработки технологии получения пр
о
дуктов питания для лечения больных фенилкетонурией /
С.А. Сухих,

О.О. Бабич

// На
учно

техни
ческий отчет №02201056337 по государственному

контракту №П1701.


Кемерово, 2010.


81 с.

78.
Разработка технологии получения продуктов питания для больных насле
д
ственными нарушениями аминокислотного обмена / И.С. Разумникова
,

О.О. Бабич

// Научно

технический отчет №02201056857
по государственному

ко
н
тракту

№16.740.11.0239.


Кемерово, 2010.


81 с.

79.
Разработка альтернативных подходов получения продуктов для больных н
а
следственными нарушениями аминокислотного обмена с использованием м
е
тодов биоинф
орматики и математического моделирования / А.Ю. Просеков,
О.О. Бабич
, И.С. Милентьева, С.А. Сухих // Научно

технический отчет
№02201356197 по соглашению №14.В37.21.0565.



Кемерово, 2012.



114 с.





41
ПЕРЕЧЕНЬ СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ


pa



ген
L

фенилаланин

аммоний

лиазы

PAL



фермент
L

фенилаланин

аммоний

лиаза

X


концентрация биомассы, г/дм
3

Р


концентрация
PAL
, г/дм
3

t


продолжительность
, ч

µ


удельная скорость роста

по модели Людекинга

Пайри, ч

1

α


константа растущих ассоциатов по модели

Людекинга

Пайри, г/г

β


константа нерастущих ассоциатов по модели Людекинга

Пайри, г/(г·ч)

µ
ax



максимальная удельная скорость роста, ч

1

K
i



константа ингибирования
PAL
, г/дм
3

S



концентрация фенилаланина, г/дм
3

P




максимальная концентрация
PAL
, г
/дм
3

K
s



константа лимитирования фенилаланина, г/дм
3

D



скорость

разбавления, ч

1

S
f



концентрация фенилаланина в поступающем потоке, г/дм
3

q
sax



максимальная удельная скорость утилизации фенилаланина, г/(г·ч)

P
i



предельная концентрация
PAL
, г/дм
3

q
pax



максимальная удельная скорость производства
PAL
, г/(г·ч)

Q
p



продуктивность, г/(дм
3
·ч)

К
М


константа Михаэлиса, ммоль

V
ax



максимальная скорость реакции,
моль / (мин·
см
3
)

Δ
Н


изменени
е

энтальпии
,
кДж/моль

Δ
G



изменение
изоба
р
но

изотермического

потенциала
,
кДж/моль

Δ
S



изменение

энтропии,
Дж/моль·К

Г


величина сорбции,
мг/г частиц

К


константа сорбции,
10

3








Подписано в печать

26
.0
2
.
20
14
. Формат 60х86/16. Тираж
120

экз. Объем
2
,
5

п.л.
З
а
каз №
20

Кемеровский технологический институт пище
вой промышленности.


650056, г. Кемерово, б

р Строителей, 47.


Отпечатано в лабор
атории множительной техники

Кемеровского

технологического института пищевой промышленности

65000
2
, г. Кемер
о
во, ул.

Институтская
,
7



Приложенные файлы

  • pdf 5186668
    Размер файла: 5 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий