КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОПАТОЛОГИЯ Саидов М.З., Далгатова А.А., Израилова Г.Р., Курбанов. of Physico-Chemical Biology and Department of Immunology, Biological Faculty, Lomonosov Moscow


Чтобы посмотреть этот PDF файл с форматированием и разметкой, скачайте его и откройте на своем компьютере.
Двухмесячный научно-практический журнал
ОСН
ВАН В ЯНВАРЕ 1980
ÈÌÌÓÍÎËÎÃÈß
Журнал входит в рекомендуемый ВАК перечень ведущих рецензируемых
научных журналов и изданий, в которых должны быть опубликованы
основные научные результаты диссертаций на соискание ученой степени
доктора и кандидата наук
Главный редактор
академик РАН
ИТО
ОЛОГИИ Ф
ЕРА
ОГО М
ДИКО-БИОЛОГИЧ
КОГО
ВА
IMMUNOLOGIYA
ditor-in-
MD, PhD, DSc, Prof., academician of RAS
A
MY OF M
AL S
OF
OLOGY OF F
RAL M
AL A
AL AG
IZDATEL'STVO
115088, Moscow,
Novoostapovskaya str., 5,
Tel.:-7(495) 670-65-94
www.medlit.ru
ЛР № 010215 от 29.04.97
Volume 37
THE EDITORIAL BOARD:
LEONID A
, corresponding member of RAS, MD, PhD, Dsc., prof.,
AT
, MD, PhD, Dsc., prof., FIRUZ GARIB, MD, PhD, Dsc., prof.,
Y G
, DBS, PhD, Dsc., prof.,
G
, corresponding mem
ber of RAS, MD, PhD, Dsc., prof.,
NATALIA
I
, MD, PhD, Dsc., prof.,
, MD, PhD, Dsc., prof.,
K
, DBS, PhD, Dsc.,
, corresponding member of RAS, MD, PhD, Dsc., prof.,
Y M
, Academicial of RAS, MD, PhD, Dsc.,
P
, Academi
cial of RA
P
(Deputy Editor), MD, PhD, Dsc., prof.,
R
MD, PhD, Dsc., prof.,
Y S
IMBIRTSTE
, MD, PhD, Dsc., prof.,
F
ILATO
, DBS, PhD, Dsc., prof.,
F
, corresponding member of
HAITO
V, MD, P
THE EDITORIAL
E
(St. Petersburg),
K
(
L
(Moscow),
W M
(
ARAT
(Makhachkala),
S
(Moscow),
S
(Rostov-on-Don),
NATALIA
S
(Ivanovo),
T
(Ekaterinburg),
VALER
Y
(Ekaterinburg)
ATIO
AL EDITORIAL
T.U. A
(Tashkent, Uzbekistan),
(Erevan , Armeniya),
M.P. P
OTAP
Lgimlmta.A,A,*.Arasjjaifalmt.P,G,*.Ifagrmt.P,K,*.Ifagrmt.K,P,.
Alrgtgpaj.aargtgrw.md.bgddcpclr.rwncq.md.fskal.kaapmnfaecq
Pwabmt.T,T,*.Emkbmxfanmta.A,C,*.Pmemtqiawa.Ws,T,*.Gtalwsi.
C,C,*.Ixfwqfimuqia.H,E,*.Iapnmt.P,Q,.
Dslargmlaj.njaqrgagrw.
md.kmlmawrcq-kaapmnfaecq.gl.nmqr-gldapargml.aapbgaa.pcecl
cpargml.alb.pckmbcjgle
Qaiflm.J,T,*.Qfctcja.C,Wa,*.Rgifmlmta.K,A,*.Mqralgl.A,A,*.
Afcplwif.C,P,
.Kmjcasjap.kcafalgqkq.md.K0.kaapmnfaec.gk
kslmqsnnpcqqgtc.aargtgrw
CYTOKINES
Ipsejmt.A,A,*.Lmqclim*.K,A,*.Implcct.I,T,*.Qtgpwacta.C,L,*.
Bpsrqiawa.K,Q,*.Gbajem.If,*.Lcbmqnaqmt.Q,A,.
Pcacgtgle.alb.
npcjgkglapw.afapaarcpgxargml.md.kgac.ugrf.eclcrga.bcdgagclaw.md.
Ipatrqmt.A,J,*.Aspwjgla.A,D,*.Ijwscta.Q,L,*.Qfafsimtqiawa.
R,L,.
Rfc.kmbsjargle.cddcar.md.nmjwmvgbmlgsk.ml.rfc.pcaargtgrw.
EXPERIMENTAL AND CLINICAL ALLERGOLOGY
Qfcpqfaimta.L,L,*.Bapabmafigla.C,L,*.Albpcct.Q,K,*.Qfa
balmta.B,B,*.Qkgplmt.T,T,*.Iakgqflgimt.M,Ws,*.Ifagrmt.
Dsjjcpclc.A
.aoscmsq.qmjsrgml.bmcq.lmr.qfmu.aasrc.rmv
Qfcpqfaimta.L,L,*.Albpcct.Q,K,*.Bapabmafigla.C,L,*.Qfa
balmta.B,B,*.Kaiapmta.C,A,*.Ifagrmt.K,P,.
Alrg-ajjcpega.
aargtgrw.md.uarcp-qmjsbjc.dsjjcpclc.A
IMMUNOPATHOLOGY AND CLINICAL IMMUNOLOGY
Qagbmt.K,X,*.Bajearmta.A,A,*.Gxpagjmta.E,P,*.Ispbalmt.I,X,.
Narfmeclcrga.qgelgdgaalac.md.amppcjargml.bcruccl.dgespc.md.
abanrgtc.gkkslc.qwqrck.gl.apsqf.qwlbpmkc
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
КЛЕТОЧНАЯ ИММУНОЛОГИЯ
ВТ
ОРО
К 616.24-002-022-092:612.112.95
Никонова А.А.
, Атауллаханов Р.И.
, Хаитов Р.М.
, Хаитов М.Р.
СТ
И ПРО
ИРУ
СТ
И РА
КИХ МАКРОФАГО
ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, г. Москва;
ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, 115088, г. Москва
Макрофаги присутствуют в секретах дыхательных путей человека и могут играть ключевую роль в развитии острых
и хронических заболеваний легких человека, в том числе инфекционной природы. В данной работе мы исследо
вали противовирусную активность разных типов макрофагов в ответ на заражение респираторными вирусами.
Для этого макрофаги дифференцировали из моноцитов крови человека, поляризовали их в М1 тип посредством
ФНО-альфа и ИФН-гамма, в М2 тип — IL-4 или не обрабатывали ничем (М0-тип). Дифференцированные и по
ляризованные клетки заражали различными дозами риновирусов (16 и 1B) и через определенные промежутки
времени отбирали материал, который исследовали методом ПЦР, ИФА или проточной цитометрии. В результате
проведенных исследований продемонстрирован дефицитный иммунный ответ у альтернативно активированных
макрофагов при заражении вирусами, который был вызван пониженным производством интерферонов 1-го и 3-го
типов. М2 макрофаги характеризовались конститутивной продукцией хемокинов MDC и TARC. Также методом
проточной цитометрии установлены поверхностные маркеры поляризации М1-клеток. Эти данные можно исполь
зовать в дальнейшем для определения роли различных популяций Мф в патогенезе острых и хронических забо
леваний легких.
Ключевые слова:
макрофаги; респираторный вирусы; бронхиальная астма; поляризация; маркеры.
Для цитирования:
Никонова А.А., Атауллаханов Р.И., Хаитов Р.М., Хаитов М.Р. Особенности противовирусной
активности разных типов человеческих макрофагов. Иммунология. 2016; 37(6): 300-305. DOI: 10.18821/0206-4952-
Nikonova A.A.
, Ataullakhanov R.I.
ANTIVIRAL ACTIVITY OF DIFFERENT TYPES OF HUMAN MACROPHAGES
Institute of Immunology FMBA, 115478, Moscow, Russia
accines and Sera, 115088, Moscow, Russia
Macrophages are the prominent cells in the airway mucosa and undoubtedly play an important role in disease pathogenesis.
In this project we investigate antiviral capacity of different subset of macrophages in response to infections with respiratory
viruses. The de�cient immune response of the infected alternatively activated macrophages has been observed.
macrophages; respiratory viruses; bronchial asthma; polarization; markers.
For correspondence:
PhD, DSc, Professor of Immunology, Director
E-mail: mr.khaitovBnrcii.ru
For citation:
Nikonova A.A., Ataullakhanov R.I., Khaitov R.M., Khaitov M.R. Antiviral activity of different types of human
macrophages. Immunologiya.2016; 37(6): 300-305. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-300-305
Nikonova A.A.,
http://orcid.org/0000-0001-9610-0935
http://orcid.org/0000-0002-4767-6409.
http://orcid.org/0000-0003-3064-8871.
http://orcid.org/0000-0003-4961-9640.
The work was performed with �nancial support from grant RSF 16-14-10188.
on�ict of interest.
The authors declare no con�ict of interest.
ведение
По определению ВОЗ, бронхиальная астма (БА) — «хро
ническое заболевание, основой которого является воспа
лительный процесс в дыхательных путях с участием раз
нообразных клеточных элементов, включая тучные клетки,
эозинофилы и Т-лимфоциты» [1]. Воспаление, обусловли
вающее гиперреактивность бронхов, развивается под влия
нием T-хелперов 2-го типа (Th2-ответ). Доминирующим при
БА служит эозинофильный тип воспаления, характеризую
щийся ростом уровня интерлейкинов (IL)-4, -5 и -13-го типов
[1]. Подавляющее число случаев обострения БА связано с
респираторными вирусными инфекциями, при этом 60' из
них представлены риновирусами человека (РВ) [2]. В работе
orne J. и соавт. показано, что течение респираторной инфек
ции, вызванной РВ, было более тяжелым и продолжитель
Для корреспонденции:
Хаитов Муса Рахимович
, д-р мед.
наук, проф., и.о. директора ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии»
ФМБА России, E-mail: mr.khaitovBnrcii.ru
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
ным у пациентов с диагностированной БА, чем у здоровых
людей [3].
Макрофаги (Мф) присутствуют в секретах дыхательных
путей человека и, бесспорно, могут играть ключевую роль в
развитии БА [4]. Существует два основных типа Мф: М1 и
М2, активированных и поляризованных Th1 (ИФН-гамма) и
Th2 (IL-4, -13) сигналом соответственно [5]. Кроме классиче
ских М1- и М2-стимуляторов поляризацию и активацию Мф
могут запускать другие факторы, такие как гранулоцитарно-
макрофагальный колониестимулирующий фактор (ГМ-КСФ),
фактор некроза опухолей (ФНО), липосахариды (ЛПС), IL-10
и иммунные комплексы [6]. Идентификация М1 и М2 основана
на определении уровня экспрессии мембранных рецепторов,
продукции различных цитокинов, хемокинов и эффекторных
медиаторов (например, синтетазы оксида азота и аргиназы) [6,
7]. Теория активации Мф сформулирована на основании дан
ных, полученных в системе
in vitro,
и в большинстве случаев
с использованием клеток грызунов. Предполагают, что М2
участвуют в патогенезе некоторых заболеваний, в том числе
БА, а М1 — в противовирусном иммунитете. Однако еще не
получено достаточно экспериментальных данных
in vivo,
для
того
чтобы сделать окончательные выводы о роли М1 и М2 в
патогенезе тех или иных заболеваний.
Цель нашей работы заключалась в изучении противо
вирусной активности поляризованных человеческих Мф
vitro.
Мы установили, что для
М1 характерна повышенная
экспрессия
D54 и
D197 на клеточной по
верхности. Кроме того, М1 служат продуцентами противо
вирусных интерферонов и более устойчивы к заражению
риновирусами 16-го и 1B-типа. Мы не выявили специфиче
ских поверхностных маркеров М2 человека. Оказалось, что
в отличие от Мф мыши
D206, HLA-DR и
D163 не
являются специфическими поверхностными маркерами М2
человека. М2 отличаются от М1 производством хемокинов
TAR
и MD
, а также цитокина IL-10. Противовирусная ак
тивность М2 в отношении риновирусов существенно ниже
таковой у М1 человека.
Материал и методы
Вирусы
. В работе использованы РВ16-го и 1В-типов, по
лученные из
Medical Research
old Unit
(Великобритания). Вирусы культивировали в культуре кле
ток Hela Ohio с использованием питательной среды ДМЕМ
(PAA) и 2' фетальной сыворотки коров (ФСК). Титрование
вируса осуществляли в культуре клеток Hela H1. Титр ис
пользуемых вирусов (РВ16-го и 1В-типов) составлял 6,32 •
и 1,5 • 10
ТЦД
/мл (тканевых цитотоксических доз в 1
мл) соответственно.
Изоляция моноцитов крови, их дифференциация в ма
крофаги и заражение РВ.
Моноциты периферической крови
(МПК) выделяли из цельной крови здоровых доноров центрифу
гированием в одноступенчатом градиенте фиколл-урографина.
Выделенные клетки ресуспендировали в макрофагальной бес
сыворточной среде (M
SF, Invitrogen) и инкубировали в тече
ние 2 ч при 37 °
. После инкубации неприкрепленные клетки
удаляли, к монослою добавляли среду M
SF, содержащую
10 нг/мл гранулоцитарно-макрофагального колониестимули
рующего фактора (GM-
SF, Invitrogen) и смесь антибиотиков
пенициллин/стрептомицин (Invitrogen). Клетки инкубировали
в этих условиях в течение 7 дней. После дифференциации мо
ноцитов в макрофаги проводили поляризацию последних. Для
этого клетки инкубировали 18 ч в среде M
SF, содержащей
2 нг/мл ФНО-альфа и 20 нг/мл ИФН-гамма (R&D Systems)
или 20 нг/мл IL-4 (Invitrogen) для получения М1- или М2-
фенотипов соответственно. Неполяризованные Мф (М0)
инкубировали в среде M
SF. Далее в поляризованные и не
поляризованные клетки добавляли инфекционные или инакти
вированные ультрафиолетовым излучением вирусы (РВ16 или
РВ1В) в дозах 0,1; 0,5; 1; 2 MOI (множественность инфекции
— количество тканевых цитотоксических доз, приходящихся
на 1 клетку). После часа инкубации вирус удаляли, клетки три
раза промывали бессывороточной средой и добавляли среду
SF (сразу после этого проводили первый отбор образцов
— эта точка на графиках обозначена как нулевая). Через 0, 4.
8, 24, 48 и 72 ч после заражения образцы супернатантов и ли
заты клеток отбирали, замораживали при – 80 °
и хранили до
момента исследования.
Исследование образцов методом проточной цитоме
Поляризованные в экспериментах
in vitro
Мф исследо
вали методом проточной цитометрии. Макрофаги, дифферен
цированные и поляризованные
in vitro,
отделяли от подложки
после инкубации клеток в течение 20 мин при 37 °
в среде
RPMI 1640 (PAA), содержащей 5 мМ ЭДТА. Для того чтобы
исключить мертвые клетки из анализа, использовали набор
The LI
E/DEAD Fixable Dead
ell Stain Kit (Invitrogen). Не
специфическое связывание антител предотвращали инкуба
цией клеток (15 мин, 4 °
) в среде, содержащей 10' чело
веческой сыворотки. Далее каждый образец инкубировали в
течение 30 мин при 4 °
в 100 мкл буфера для проточной ци
тометрии (фосфатно-солевой буфер, содержащий 2' ФСК и
10 мМ EDTA) с флуоресцентно-меченными антителами к по
верхностным антигенам. Мы использовали следующие анти
тела: анти-
D14-Paci�c-Blue (clone M5E2, BD Biosciences);
анти-HLA-DR-Qdot 605 (clone Tь36, Invitrogen): анти-
y7 (clone 15-2, BioLegend); анти-
y 7 (clone
3D12, BD Biosciences); анти-
(clone
B38, BD
Biosciences); анти-
D80-PE (clone L307.4, BD Biosciences);
(clone HA58, BD Biosciences). После инку
бации с антителами клетки фиксировали 2' раствором па
рафольмадегида. Для анализа клеток использовали прибор
BD LSR II (BD Biosciences). Анализ полученных данных
выполняли при помощи программного обеспечения FlowJo
software version 7.6.3 (Tree Star). Результаты выражали в виде
процента положительных клеток или как интенсивность
флуоресценции (mean �uorescence intensity (MFI)).
Экстракция РНК, проведение реакций обратной
транскрипции и ПЦР с детекцией в режиме реального
времени.
Экстракцию РНК проводили при помощи набора
easy Mini Kit (Qiagen) согласно инструкции производи
теля. Для синтеза кДНК в реакции обратной транскрипции
использовали набор Omniscript RT (Qiagen). Последователь
ности использованных в реакции ПЦР праймеров и зондов, а
также условия проведения реакции описаны в статье Хаито
ва М.Р. и соавт. [8].
Иммуноферментный анализ.
Уровень экспрессии раз
личных цитокинов и хемокинов определяли с помощью ком
мерческих наборов для иммуноферментного анализа (ИФА),
следуя инструкциям производителей. В данной работе ис
пользовали следующие наборы для ИФА: IF
-α human
iKine ELISA kit (Interferon Source); IF
-β ELISA kit (FUJIRE
BIO I
.); human IL-10 ELISA Ready-Set-Go! (eBioscience);
, IL-29/IL-28B (IF
L17/TAR
L18/PAR
DuoSets ELISA kits (R&D Systems).
Статистический анализ.
Статистическую обработку
данных проводили при помощи программного обеспечения
GraphPad Prism version 4.0. Данные считали достоверными
езультаты
Классически активированные макрофаги более устой
чивы к заражению риновирусами из-за повышенной продук
ции интерферонов 1-го и 3-го типов.
В экспериментах
in vit
мы исследовали индукцию интерферонов 1-го и 3-го типов
различными типами Мф в ответ на заражение риновирусами
РВ16 и 1B. Продукция интерферонов α, β и λ 1/3 была детекти
рована во всех видах Мф, однако уровень ИФН-α и -β оказался
достоверно выше в обработанных РВ16 М1 через 4, 8, 24, 48 и
72 ч после заражения (
< 0,05;
< 0,01;
< 0,001) и ИФН-λ1/3
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
через 24, 48 и 72 ч (
< 0,05;
< 0,01) по сравнению с М0 и
М2 (рис. 1). Чтобы определить, является ли индукция интер
феронов в Мф дозозависимой, мы обработали клетки разными
дозами РВ16 (0,1; 0,5 и 2 MOI). Через 24 ч после заражения мы
измеряли уровень ИФН-λ 1/3 посредством ИФА. Выявили до
стоверную зависимость между дозой заражения РВ16 и уров
нем продукции ИФН-λ 1/3 в М1 (рис. 2) (
< 0,05;
< 0,01;
< 0,001). Аналогичную зависимость мы наблюдали в клетках,
обработанных разными дозами РВ1B (данные не представле
ны). Это наблюдение свидетельствует о том, что продукция
ИФН-λ 1/3 в М1 дозозависима, но рецепторнезависима. Кроме
того, мы не обнаружили продукцию интерферонов в клетках,
обработанных УФ-инактивированными РВ16 и РВ1B (данные
не представлены). Таким образом, можно сделать вывод о том,
что продукция интерферонов 1-го и 3-го типов в М1 зависит от
репликации вируса, а не от присутствия его белков.
Для того чтобы определить, с какой эффективностью
происходит репликация вируса в разных фенотипах Мф, мы
измеряли титр вируса в супернатантах зараженных клеток.
Титрование проводили в культуре чувствительных клеток
HeLa H1, результаты выражали в ТЦД
/мл (тканевых цито
токсических дозах, вызывающих гибель 50' клеток). Пока
зано, что М2 и М0 характеризуются более эффективной ре
пликацией РВ16 (рис. 3) и РВ 1B (данные не представлены) с
максимальным титром через 24 ч после заражения (
< 0,05;
< 0,01) по сравнению с М1, в которых наблюдали полную
элиминацию вируса.
Альтернативно активированные макрофаги продуци
руют повышенный уровень IL-10, хемокинов TARC и MDC.
Показано, что продукция IL-10 была повышена в М2, зара
женных РВ16, через 72 ч после заражения (
< 0,05;
< 0,01)
по сравнению с М1 и М0 (рис. 4,
). Продукция хемокинов
TAR
и MD
была повышена как в зараженных, так и неза
раженных M2. Увеличенную продукцию TAR
наблюдали в
М2 через 24, 48 и 72 ч после обработки (
< 0,05;
< 0,01),
— через 24 и 48 ч (
< 0,05;
< 0,001) по сравнению с
М0 и М1 (см. рис. 4,
). Таким образом, выявлена консти
тутивная продукция TAR
Специфический поверхностный маркер классически
активированных макрофагов, определенный посредством
проточной цитометрии.
Активация М1 фенотипа индуци
руется ИФН-γ, ФНОα или бактериальными компонентами,
такими как ЛПС [6]. В наших экспериментах поляризация в
М1 посредством ИФН-γ и ФНОα индуцирует повышенную
Рис. 1. Кинетика уровня экспрессии ИФН-α, -β, -λ1/3 (
) в за
раженных и незараженных РВ16 (1 MOI) М1, М2 и М0 макрофагах.
ИФН — интерферон; М0 — неполяризованные макрофаги; М1 — клас
сически активированные макрофаги; М2 — альтернативно активирован
ные макрофаги. По оси
уровень продукции разных типов интерферо
нов, измерянный посредством ИФА. По оси
— время после заражения
вирусом.
Рис. 2. Дозозависимый эффект индукции интерферона 3-го типа в
М1-макрофагах в ответ на заражение риновирусом 16-го типа.
Измерение уровня продукции белка проводили в ИФА через 24 ч после
заражения разными дозами вирусов всех типов макрофагов (ось
). В
качестве отрицательного контроля (К-) использовали незараженные ма
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
экспрессию
D197 и
D54 (рис. 5) (
< 0,05;
< 0,01;
< 0,001) на поверхности клеток. Экспрессия
повышена и в М0 Мф
< 0,001). Мы провели анализ по
верхностных антигенов как в зараженных РВ16, так и неза
раженных клетках (данные не представлены). Показано, что
через 24 ч после заражения уровень экспрессии поверхност
ных белков у М1 Мф не меняется, тогда как у М0 и М2 на
блюдают достоверное увеличение уровня
D80 на поверхно
сти клеток (
< 0,05;
< 0,01) в сравнении с незараженными
клетками. Также было показано, что М1 Мф характеризуют
ся повышенным уровнем I
AM-1 (
< 0,05) по сравнению с
М2 поляризация развивается в присутствии IL-4 или IL-
13 (M2a), иммунных комплексов (M2b), IL-10, TGFβ или
глюкокортикоидов (M2c) [6]. Мы использовали IL-4 для М2-
поляризации. Посредством проточной цитометрии оценили
уровень экспрессии
D36 и HLA-DR на по
верхности поляризованных Мф. Мы не выявили достоверных
различий в уровне перечисленных маркеров на поверхности
различных типов Мф (данные не представлены). Таким об
разом, мы не обнаружили поверхностных антигенов, продук
ция которых увеличивается под действием IL-4 в Мф.
Обсуждение
Макрофаги наряду с другими клетками иммунной систе
мы служат инициаторами иммунного ответа на инфекцию.
Мф активируются после взаимодействия с вирусными или
бактериальными агентами и секретируют широкий спектр
антивирусных, провоспалительных и/или иммуномодули
рующих цитокинов [9]. В работе Laza-Stanca
. и соавт. в си
in vitro
показано, что репликация РВ имеет место в Мф,
дифференцированных из моноцитов крови человека, и в от
вет на заражение эти клетки секретируют ИФН-α, β и γ [10].
Предполагают, что легочные макрофаги также могут быть
источником интерферонов 1-го и 3-го типа при заражении РВ
in vivo
. В литературе встречается относительно небольшое
количество публикаций, посвященных исследованию взаи
модействий различных фенотипов Мф с вирусами [11, 12].
В ходе проведенных нами исследований показано, что
М1 в отличие от М2 и М0 характеризуются более высоким
уровнем продукции антивирусных интерферонов 1-го и 3-го
типов (см. рис. 1, 2) и более устойчивы к заражению РВ16
(см. рис. 3) и РВ1B. Согласно имеющимся в литературе дан
ным, М1-поляризация ассоциируется с наиболее значитель
ными изменениями транскриптома, в частности с активацией
факторов регуляции активности интерферона IRF-1, IRF-7
[13] и IRF-5 [14]. Активация указанных факторов обусловли
вает повышенную продукцию интерферонов в М1 в ответ на
Рис. 3. Титр РВ16 в разных типах макрофагов.
Уровень репродукции вируса определяли в супернатантах зараженных
макрофагов посредством титрования в культуре чувствительных клеток.
По оси
— титр вируса, выраженный в ТЦД
/мл. По оси
— время
сбора образцов после заражения РВ16.
Рис. 4. Кинетика уровня экспрессии белков IL-10, TAR
и MD
(
) в зараженных и незараженных РВ16 (1 MOI) М1, М2 и М0 ма
По оси
уровень продукции IL-10, TAR
и MD
, измерянный посред
ством ИФА. По оси
— время после заражения вирусом.
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
заражение РВ. В работе
ark P.A. показано, что первичные
клетки бронхиального эпителия астматиков отличаются по
ниженной продукцией ИФН-β [15]. Интересно, что подобная
дефицитная продукция ИФН 1-го и 3-го типов выявлена в
альвеолярных Мф астматиков, зараженных РВ16
in vitro
Согласно полученным нами данным, М2 Мф характеризу
ются повышенной продукцией супрессорного цитокина IL-
10 в ответ на заражение РВ (см. рис. 4,
). IL-10 — самый
известный маркер М2 [17], так же как и экспрессия некото
рых хемокинов (TAR
, PAR
и MD
) [18, 19]. В наших экс
периментах мы выявили индукцию TAR
и MD
только в
зараженных и незараженных М2 (см. рис. 4,
). Согласно
литературным данным, эти два хемокина — ключевые при
миграции активированных Th2-клеток, экспрессирующих
рецептор
R4 к месту аллергического воспаления [20].
Вследствие повышенной продукции IL-4 и IL-13 активиро
ванными Th2-лимфоцитами поляризация Мф в М2-фенотип
может увеличиваться [6]. Повышенное содержание TAR
об
наружено в плазме крови у детей с хронической астмой [21],
а также в сыворотке и слюне у астматиков [22, 23]. Эти факты
опосредованно могут указывать на повышенное содержание
М2-фенотипа Мф у пациентов с диагностированной БА.
Спорным остается вопрос, касающийся разницы между
Мф человека и грызунов. Некоторые исследователи полагают,
что эта разница существенна. Так, например, IL-4 не вызывает
индукцию человеческих гомологов мышиных М2-маркеров —
arginase 1, Fizz1, MMP1,
m1 [13] и i
OS [24]. В нашей ра
боте методом проточной цитометрии в незараженных и за
раженных РВ16,
in vitro
дифференцированных М1, М2 и М0
Мф, мы исследовали экспрессию некоторых поверхностных
антигенов, для того чтобы выявить специфические маркеры
для идентификации различных фенотипов Мф. Основываясь
на литературных данных, мы выбрали М1 маркеры (
D14,
D197,
D80,
D54/I
AM-1) и М2 маркеры (
D36,
D206,
HLA-DR и
D163) [6, 13]. Мы обнаружили, что М1 характери
зуются повышенной экспрессией
D197,
D14,
D80 и
D54
(см. рис. 5). Из литературных данных известно, что
D14
участвует в распознавании вирусных белков и нуклеиновых
кислот некоторых вирусов [25],
D80 обеспечивает необхо
димый сигнал для активации Т-клеток [26],
D197 участвует
в миграции клеток иммунной системы к вторичным лимфо
идным органам [27], а
D54 обеспечивает миграцию нейтро
филов, моноцитов и лимфоцитов к очагу воспаления и также
участвует в контактных взаимодействиях клеток в иммунных
реакциях [28]. Таким образом, наши экспериментальные дан
ные свидетельствуют о том, что М1 Мф по сравнению с М2 и
М0 обладают более повышенным потенциалом при распозна
вании патогена и антигенпрезентации.
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что в
отличие от мышиных Мф
D206, HLA-DR и
D163 не
являются специфическими маркерами М2-активации в чело
веческих клетках. Поэтому для оценки фенотипа популяции
альвеолярных Мф (АМф) можно использовать уровень экс
прессии
D80 и
D54. В литературе встре
чаются работы, в которых исследователи пытались опреде
лить фенотип популяции АМф при различных заболеваниях
легких человека (астме, хронической обструктивной болезни
легких и саркоидозе) [29—32]. Однако четких доказательств
роли М1 и М2 в патогенезе перечисленных заболеваний вы
явлено не было.
ыводы
1. М1 служат потенциальными продуцентами противови
русных интерферонов и более устойчивы к заражению рино
вирусами 16-го и 1B-типа.
2. Экспрессия
D54 и
D197 повышена на
поверхности М1-макрофагов. Не выявлено специфических
М2 маркеров.
Эти данные можно использовать в дальнейшем для опре
деления роли различных популяций Мф в патогенезе острых
и хронических заболеваний легких.
Финансирование
Работа была выполнена при финансо
вой поддержке гранта РНФ 16-14-10188.
Конфликт интересов.
Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
ЕРА
РА
., Lemanske R.F., Jr. Asthma.
N. Engl. J. Med;
Johnston S.L. Innate immunity in the pathogenesis of virus-induced
Proc. Am. Thorac. Soc.
C
orne J.M. et al.; Frequency, severity, and duration of rhinovirus in
fections in asthmatic and non-asthmatic individuals: a longitudinal
cohort study.
Holgate S.T. Pathogenesis of asthma.
Clin. Exp. Allergy.
2008; 38(6):
Biswas S.K., Mantovani A. Macrophage plasticity and interaction
with lymphocyte subsets: cancer as a paradigm
. Nat. Immunol.
2010;
11(10): 889—96.
Mantovani A. et al. The chemokine system in diverse forms of mac
rophage activation and polarization.
Trends Immunol
. 2004; 25(12):
Mege J.L., Mehraj
. Macrophage polarization and bacte
Curr. Opin Infect. Di
s; 2011; 24(3): 230—4.
Khaitov M.R. et al. Respiratory virus induction of alpha-, beta- and
lambda-interferons in bronchial epithelial cells and peripheral blood
Allergy.
9.
Porcheray F. et al. Macrophage activation switching: an asset for the
. et al. Rhinovirus replication in human macrophages
F-kappaB-dependent tumor necrosis factor alpha produc
J. Virol.
11.
C
assol E. et al. M1 and M2a polarization of human monocyte-derived
macrophages inhibits HI
-1 replication by distinct mechanisms.
J.
Рис. 5. Экспрессия
D197 и
D54 (
) на поверх
ности М1, М2 и М0-макрофагов.
Уровень
D80,
D14,
D197 и
D54 определяли посредством проточной
цитометрии. Для
D14 и
D54 он выражен в единицах MFI (уро
вень флуоресценции), для
D197 — как процент позитивных клеток.
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
.M. et al. Activation of human macrophages by bacterial
components relieves the restriction on replication of an interferon-
inducing parain�uenza virus 5 (PI
5) P/
mutant.
Microbes Infect
2011; 13(4): 359—68.
Martinez F.O. et al. Transcriptional pro�ling of the human monocyte-
to-macrophage differentiation and polarization: new molecules and
. 2006; 177(10): 7303—11.
Krausgruber T. et al. IRF5 promotes in�ammatory macrophage
polarization and TH1—TH17 responses
. Nat. Immunol
. 2011; 12(3):
W
ark P.A. et al. Asthmatic bronchial epithelial cells have a de�cient
innate immune response to infection with rhinovirus
J. Exp. Med
C
ontoli M. et al. Role of de�cient type III interferon-lambda
production in asthma exacerbations
Nat. Med
. 2006; 12(9):
Mosser D.M., Edwards J.P. Exploring the full spectrum of macrophage
Nat. Rev. Immuno
Gordon S. Alternative activation of macrophages.
Nat. Rev. Immuno
V
arin A. et al. Alternative activation of macrophages by IL-4 impairs
phagocytosis of pathogens but potentiates microbial-induced
. 2010; 115(2): 353—62.
Goebeler M. et al. Differential and sequential expression of multiple
chemokines during elicitation of allergic contact hypersensitivity.
Leung T.F. et al. Plasma concentration of thymus and activation-
regulated chemokine is elevated in childhood asthma
. J. Allergy Clin.
. 2002; 110(3): 404—9.
. et al. TAR
in allergic disease.
Allergy.
2002; 57(2):
Sekiya T. et al. Increased levels of a TH2-type
chemokine thymus
and activation-regulated chemokine (TAR
) in serum and induced
Allergy.
24.
Schneemann M., Schoeden G. Macrophage biology and immunology:
25.
X
agorari A.,
hlichlia K. Toll-like receptors and viruses: induction of
. Open Microbiol. J
C
hen L.
o-inhibitory molecules of the B7-
D28 family in the control
of T-cell immunity
. Nat. Rev. Immunol
Forster R., Davalos-Misslitz A.
., Rot A.
R7 and its ligands:
balancing immunity and tolerance
Nat. Rev. Immunol
. 2008; 8(5):
Roebuck K.A., Finnegan A. Regulation of intercellular adhesion
molecule-1 (
D54) gene expression.
J. Leukoc. Biol
. 1999; 66(6):
W
iken M. et al.
o evidence of altered alveolar macrophage
polarization, but reduced expression of TLR2, in bronchoalveolar
. Respir. Res
. 2010; 11: 121.
St-Laurent J. et al. Alveolar macrophage subpopulations in
bronchoalveolar lavage and induced sputum of asthmatic and control
J. Asthma
Pons A.R. et al. Phenotypic characterisation of alveolar macrophages
and peripheral blood monocytes in
Eur. Respir. J
. 2005;
Subrata L.S. et al. Interactions between innate antiviral and atopic
immunoin�ammatory pathways precipitate and sustain asthma
Поступила 09.07.16
Принята в печать 16.08.16
ВТ
ОРО
К 616.127-005.8-06:616-002]-092:612.112.95
Рябов В.В.
, Гомбожапова А.Э.
, Роговская Ю.В.
, Иванюк Е.Э.
, Кжышковская Ю.Г.
Карпов Р.С.
ФУ
СТ
СТь
/МАКРОФАГО
ПРО
ССТ
РА
СТ
ФАРК
ОГО
ИРО
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт кардиологии», 634012, г. Томск;
ФГАОУ высшего образования «Национальный исследовательский Томский государственный университет»,
634050, г. Томск;
ГБОУ высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет»
Министерства здравоохранения Российской Федерации, 634055, г. Томск;
Гейдельбергский университет им. Рупрехта и Карла, 68167, г. Мангейм, Германия
В последние годы предметом научного интереса стали моноциты/макрофаги как в здоровых тканях, так и при
различной патологии. Моноциты/макрофаги, которые участвуют в процессах воспаления — воспалительные М1
макрофаги, — обладают бактерицидной активностью и экспрессируют провоспалительные цитокины. Выявлено,
что чрезмерное воспаление, опосредованное активностью моноцитов/макрофагов, приводит к нарушению про
цесса заживления миокарда. Вместе с тем установлены новые функции, свойственные этим клеткам: противо
воспалительная, адаптивная и обновления ткани. Макрофаги, которые выполняют эти недавно открытые новые
функции, называют альтернативно активированными М2-макрофагами, обладающими противовоспалительными
свойствами. Таким образом, при инфаркте миокарда воспаление развивается в ответ на некроз кардиомиоцитов
и является универсальной биологической реакцией — типовым патологическим процессом, который завершается
фазой репарации/регенерации. Моноциты/макрофаги и резидентные макрофаги — ключевые участники воспа
лительной реакции. Они секретируют про- и противовоспалительные факторы, фагоцитируют погибшие клетки,
способствуют формированию соединительной ткани, выделяют факторы ангиогенеза и фиброгенеза, во многом
могут определять ремоделирование сердца, выделяя эластазу, коллагеназу и гиалуронидазу, а также воздействуя
на процессы апоптоза и пролиферации кардиомиоцитов.
Ключевые слова:
инфаркт миокарда; воспаление; моноциты; макрофаги; ремоделирование.
Для корреспонденции:
Гомбожапова Александра Энхэевна
, аспирант и врач-кардиолог отделения неотложной кардиологии НИИ
кардиологии, г. Томск; младший научный сотрудник лаборатории трансляционной клеточной и молекулярной биомедицины ТГУ,
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
Для цитирования:
Рябов В.В., Гомбожапова А.Э., Роговская Ю.В., Иванюк Е.Э., Кжышковская Ю.Г., Карпов Р.С.
Функциональная пластичность моноцитов/макрофагов в процессах восстановительной регенерации и остинфаркт
ного ремоделирования сердца. Иммунология. 2016; 37(6): 305-312. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-305-312
Ryabov V.V.
, Gombozhapova A.E.
, Rogovskaya Yu.V.
, Ivanyuk E.E.
FUNCTIONAL PLASTICITY
OF MONOCYTES/MACROPHAGES IN POST-INFARCTION CARDIAC
REGENERATION AND REMODELING
«Scienti�c-research Institute of cardiology», 634012, Tomsk;
ational research Tomsk state University», 634050, Tomsk;
ian Federation, 634055, Tomsk;
Ruprecht and Karl Heidelberg University, 68167, Mannheim, Germany
Recently, monocytes/macrophages have become a subject of scienti�c interest under both normal and pathological
conditions. In�ammatory M1 macrophages exhibit a strong bactericidal activity and secret large amounts of pro-in�ammatory
cytokines. It was found that excessive in�ammation, mediated by monocytes/macrophages leads to disruption of myocardial
healing process. At the same time new functions of these cells, such as anti-in�ammatory, adaptive and regenerative,
have been established. Macrophages performing all that functions are anti-in�ammatory alternatively activated M2
macrophages. Thus, in�ammation following myocardial infarction is a universal biological response to the tissue injury
resulted in reparation/regeneration phase. Monocytes/macrophages and resident macrophages are key participants of
in�ammatory response, they produce pro- and anti-in�ammatory factors, promote resorption of cellular debris, regulation
of granulation tissue formation, neoangiogenesis and �brogenesis. In many ways, they determine cardiac remodeling and
healing after myocardial infarction both through secretion of elastase, collagenase and hyaluronidase and in�uencing
myocardial infarction; in�ammation; monocytes; macrophages; remodeling.
For citation:
Ryabov V.V., Gombozhapova A.E., Rogovskaya Yu.V., Ivanyuk E.E., Kzhyshkowska J.G., Karpov R.S. Functional
plasticity of monocytes/macrophages in post-infarction cardiac regeneration and remodeling. Immunologiya.2016; 37(6):
For correspondence:
ardiac Emergency Department,
ardiac Emergency Department, RI
ardiology, Tomsk, Russian Federation; Junior Research Fellow
of the Laboratory of Translational
ational Research Tomsk State University,
Tomsk, Russian Federation; E-mail: gombozhapovaBgmail.com
Информация об авторах/
Рябов В.В./Ryabov V.V.,
http://orcid.org/0000-0002-4358-7329
Гомбожапова А.Э./Gombozhapova A.E.,
http://orcid.org/0000-0003-1281-3714
Роговская Ю.В./Rogovskaya Yu.V.,
http://orcid.org/0000-0001-5553-7831
Иванюк Е.Э./Ivanyuk E.E.,
http://orcid.org/0000-0002-2785-6699
Кжышковская Ю.Г./Kzhyshkowska J.G.,
http://orcid.org/0000-0003-0898-3075
Карпов Р.С./Karpov R.S.,
https://orcid.org/0000-0002-7011-4316
on�ict of interest.
Con�ict of interest is not declared.
Foundation for Basic Research, grant №16-04-01268, 2016-2018
Острый инфаркт миокарда (ОИМ) — одно из наиболее тя
желых сердечно-сосудистых заболеваний, сопровождающее
ся рядом серьезных осложнений. Основные из них: разрывы
сердца, формирование аневризмы левого желудочка, тромбо
эмболический синдром, перикардит, нарушения ритма и про
водимости, ранняя постинфарктная стенокардия, рецидиви
рующий и повторный ОИМ, развитие острой и хронической
сердечной недостаточности. В результате совершенствова
ния и развития медицинских технологий, накопления дан
ных и новых знаний, касающихся сердечной недостаточно
сти, произошла эволюция взглядов на патофизиологические
модели формирования и прогрессирования этого синдрома:
кардиальная, кардиоренальная, циркуляторная и нейрогумо
ральная, цитокиновая [1]. С патофизиологической точки зре
ния именно ухудшение насосных свойств сердца в результате
потери части кардиомиоцитов, т. е. миокардиальной недоста
точности, либо нарушения релаксационных свойств миокар
да после инфаркта — основа инициации и прогрессирования
сердечной недостаточности, приводящей к гибели пациента.
Последние данные свидетельствуют и о том, что современ
ные методики инвазивного и медикаментозного лечения
полностью реализовали свой потенциал по ограничению раз
мера некроза, снижению смертности и улучшению функции
миокарда у больных во время и после инфаркта миокарда [2].
Результаты исследований в отделении неотложной кардиоло
гии НИИ кардиологии (Томск), а также данные зарубежных
коллег свидетельствуют о том, что даже в случае выполнения
всех рекомендованных мероприятий при ОИМ с подъемом
сегмента ST у 30' пациентов наблюдают прогрессирующее
ремоделирование сердца, завершающееся развитием сердеч
ной недостаточности. При этом у остальных больных оно
либо отсутствует или имеет обратимый характер (раннее из
менение с последующим восстановлением в отдаленные сро
ки), либо все же развивается в отдаленные сроки [3, 4].
В последние годы произошло смещение акцента ис
следований в сторону изучения значения хронического
асептического воспаления и его последствий как клеточно-
молекулярной основы постинфарктного ремоделирования
сердца [5]. Одной из важнейших неразрешенных проблем
в патофизиологии по-прежнему остается оценка характера
воспалительной реакции, которая развивается в миокарде в
ответ на ишемическое повреждение. Развивающиеся в от
вет на гибель миоцитов морфологические изменения как
в очаге некроза, периинфарктной зоне, так и в отдаленных
участках миокарда имеют хорошо изученную определенную
временную последовательность. В то же время процессы
заживления инфарцированного участка и ремоделирования
миокарда даже в сходных клинических ситуациях протекают
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
по-разному. При равных условиях: размер инфаркта, локали
зация, время от начала клиники до начала лечения, стратегия
лечения, фоновая патология, возраст — в одних случаях в
раннем периоде развиваются смертельные осложнения: кар
диогенный, аритмогенный шок, наружный разрыв миокарда
с гемотампонадой, в других — формируется хроническая
аневризма левого желудочка либо диффузная дилатация его
полости с развитием ремоделирования сердца и хронической
сердечной недостаточности, в третьих — отмечается благо
приятное течение заболевания.
Клеточно-молекулярная основа постинфарктного
поражения миокарда
Работы, посвященные анализу клинико-морфологических
и лабораторных параллелей выраженности воспалительного
процесса в участке инфаркта и периинфарктной зоне, со
стоянию внеклеточного матрикса, помогли определить не
которые предикторы неблагоприятного исхода заболевания.
Однако механизм развития неблагоприятного ремоделирова
ния миокарда до сих пор остается во многом не ясным [6]. В
этой связи в последние годы предметом научного интереса
стали моноциты/макрофаги как в здоровых тканях, так и при
различной патологии. Большое количество работ посвяще
но определению функционирования моноцитов/макрофагов
при хронических воспалительных процессах. Справедливо
сти ради надо отметить, что этот интерес был всегда. Однако
современные приборы и технологии позволили по-новому
подойти к расшифровке особенностей жизнедеятельности
и функционирования моноцитов/макрофагов в норме и при
патологии [7]. Известно, что сердце состоит из нескольких
типов клеток, включая кардиомиоциты, сердечные фибро
бласты, эндотелиальные и гладкомышечные клетки. В до
полнение к этим основным типам клеток установлено, что
в физиологических условиях также присутствуют в неболь
ших количествах сердечные макрофаги. Недавно определе
но, что резидентные макрофаги выполняют витальные функ
ции в поддержании тканей и гомеостаза во многих органах,
включая головной мозг, печень, жировую ткань, лимфати
ческую систему и желудочно-кишечный тракт. Удаление
поврежденных клеток и молекул при повреждении кардио
миоцитов и провоспалительные эффекты макрофагов — их
обычная функция (классическая активация макрофагов или
M1-макрофагов), и это показано ранее [8]. При гибели кле
ток происходит высвобождение их содержимого, активиру
ется система врожденного иммунитета и запускается воспа
лительная реакция. Помимо выполнения функции «системы
предупреждения» о распознавании «своего» и «чужого»
врожденный иммунитет представляет собой сложную моле
кулярную сеть, чувствительную к «сигналам опасности», вы
деляющимся в процессе гибели клеток и внеклеточного ма
трикса. При повреждении миокарда активируются несколько
механизмов врожденного иммунитета. Образование в про
цессе некроза клеток и экстрацеллюлярного матрикса мо
лекулярных паттернов, связанных с повреждением (damage
associated molecular patterns, DAMPs), активизирует мембра
носвязанные Толл-подобные рецепторы (Toll-like recertors,
TLRs). Помимо этого происходит активация системы ком
племента и рецепторов конечных продуктов гликирования
(receptor for advance glycation end-products, RAGE). Передача
сигнала от вовлеченных механизмов врожденного иммуни
тета сводится к активации нуклеарного фактора (
который управляет продукцией цитокинов и хемокинов.
Провоспалительные цитокины в свою очередь регулируют
ответ на повреждение миокарда. Образование IL-1 приводит
к синтезу хемокинов и стимуляции лейкоцитарной инфиль
трации в инфарцированном участке миокарда [9]. Генерация
активного IL-1b происходит путем преобразования его неак
тивного предшественника про-IL-1b ферментом каспазой-1
(англ. caspase; cysteine-dependent aspartate speci�c protease).
Активность каспазы-1 строго регулируется специальными
белковыми комплексами, называемыми инфламмасомами
[10]. Активация инфламмасом в зоне некроза происходит как
в лейкоцитах, так и в резидентных фибробластах и управ
ляет IL-1-зависимой клеточной инфильтрацией и синтезом
цитокинов [11]. Образование активных форм кислорода и
потеря калия играют важную роль в активации инфламмасом
фибробластов, подвергаемых процессам гипоксии и реокси
генации. В провоспалительной среде области заживления
инфаркта происходит регулируемая макрофагальным коло
ниестимулирующим фактором дифференцировка моноцитов
в макрофаги [12]. Во время разрешения постинфарктного
воспаления макрофаги способны оказывать ингибирующее
действие как путем секреции медиаторов, подавляющих вос
паление, так и посредством элиминирования воспалитель
ных лейкоцитов. Несмотря на накопленные доказательства,
демонстрирующие обилие макрофагов в инфарцированном
миокарде и их возможности в регуляции воспалительно
го ответа, наши знания о роли макрофаг-опосредованных
взаимодействий в подавлении воспалительных сигналов и
разрешении лейкоцитарной инфильтрации остаются крайне
ограниченными. Ключом для понимания роли этих клеток в
процессах репарации миокарда служит определение измене
ний фенотипа макрофагов, зависящих от временного факто
ра и функций различных их субпопуляций.
Повторяя классификацию Т-хелперов, разделяющую
клетки на Th1 и Th2-типы, макрофаги были разделены на две
различные субпопуляции [13]: классически активированные
М1-макрофаги и альтернативно активированные макрофаги
М2 [14]. Считается, что М1-макрофаги инициируют воспа
лительную реакцию, проявляя высокую цитотоксическую и
бактерицидную активность и поддерживая Th1-зависимый
иммунный ответ [15]. Моноциты/макрофаги, которые уча
ствуют в процессах воспаления — так называемые воспали
тельные М1 или
D80 и
D25-позитивные, обладают бакте
рицидной активностью и экспрессируют провоспалительные
цитокины. М1-макрофаги характеризуются экспрессией мо
лекул главного комплекса гистосовместимости II класса и
D86, а также способностью к секреции провоспалительных
цитокинов T
F, IL-12, IL-23, IL-1, IL-6, IL-18 и хемокинов
L8-11,
L13 и
М1 эффективно уничтожают внутриклеточных патогенов пу
тем эндоцитоза бактерий и вирусов, продукции
O посред
ством индуцибельной
O-синтазы (i
OS), синтеза активных
форм кислорода и за счет ограничения доступности железа и
других веществ, требуемых для бактериального роста и ви
русной репликации [16].
Альтернативная активация макрофагов в антивоспали
тельный фенотип М2 происходит под действием иных фак
торов; в результате такой активации среди макрофагов М2
возникает несколько функциональных подтипов: M2a возни
кают в ответ 8 на стимуляцию IL-4 и IL-13; M2b — в ответ
на действие иммунных комплексов, липополисахаридов и/
или IL-1β; а M2c-макрофаги — под действием IL-10, транс
формирующего фактора роста бета (TGFβ) и глюкокортикои
дов [17]. Эти подтипы М2-макрофагов различаются набором
поверхностных маркеров и секретируемых цитокинов. Так,
для М2a-макрофагов характерным поверхностным маркером
служит
D206 (маннозный рецептор), для М2b —
D86 (ко
стимулирующая молекула к главному комплексу гистосов
местимости (ГКГС) II класса) и молекулы белков ГКГС II
класса, а для М2с —
D163 (гемоглобин-гаптоглобиновый
рецептор).
Все перечисленные подтипы М2-макрофагов продуциру
ют высокий уровень IL-10 и низкий IL-12; макрофаги М2a
и М2c помимо вышеперечисленных факторов секретируют
высокие уровни
L18 и TGFβ; подтип М2b — хемоки
L1 (хемоаттрактант для моноцитов, B-лимфоцитов и
дендритных клеток), а М2a — еще и
L24 (хемоаттрактант
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
для эозинофилов и Т-лимфоцитов) [18]. В целом субпопуля
ция макрофагов М2 стимулирует ангиогенез, перестройку и
репарацию ткани путем активации фибробластов и гладко
мышечных клеток к пролиферации и синтезу межклеточно
го матрикса [19]. Кроме того, М2-макрофаги поддерживают
Th2-зависимый иммунный ответ при некоторых аллергиче
ских реакциях и паразитарных инфекциях, привлекая эозино
филы в очаг воспаления. Основная задача М2-макрофагов —
способствовать подавлению воспалительной реакции и вос
становлению ткани [20].
Выявлена неблагоприятная взаимосвязь между постин
фарктным моноцитозом и отдаленными кардиальными со
бытиями; показано, что увеличение количества моноцитов в
периферической крови вызывает повышаемую ими инфиль
трацию миокарда, стимулирует воспалительный процесс,
экспансию инфаркта и ремоделирование сердца [21]. Иными
словами, чрезмерное воспаление, опосредованное активно
стью моноцитов/макрофагов, приводит к нарушению про
цесса заживления миокарда во время и после инфаркта. Вме
сте с тем в последние годы установленные учеными новые
функции, свойственные этим клеткам: противовоспалитель
ная, адаптивная и обновления ткани. При патологических со
стояниях М2-макрофаги приобретают стабилин-1,
D163 и
D206-позитивный фенотип [22].
Таким образом, при инфаркте миокарда воспаление раз
вивается в ответ на некроз кардиомиоцитов и оказывается
универсальной биологической реакцией — типовым пато
логическим процессом, который завершается фазой репа
рации/регенерации. Моноциты/макрофаги и резидентные
макрофаги — ключевые участники воспалительной реакции,
секретируют про- и противовоспалительные факторы, фаго
цитируют погибшие клетки, способствуют формированию
соединительной ткани, выделяют факторы ангиогенеза и
фиброгенеза, во многом могут определять ремоделирова
ние сердца, выделяя эластазу, коллагеназу и гиалуронидазу,
а также воздействуя на процессы апоптоза и пролиферации
кардиомиоцитов.
оль изменения фенотипа макрофагов при инфар
кте миокарда
Интересный, активно изучающийся аспект — феномен
пластичности макрофагов. В эксперименте доказана возмож
ность трансформации одного фенотипа макрофагов в другой
(М1 в М2) в зависимости от стадии воспаления, воздействия
цитокинов и других сигнальных молекул, секретируемых
клетками окружения и химических веществ (фармакологиче
ские препараты, вещества растительного происхождения).
Важный клеточный механизм в разрешении воспаления —
освобождение поврежденной ткани от апоптотических ча
стиц [23]. Этот процесс ассоциирован с активной супрессией
воспаления, поскольку клетки, фагоцитирующие апоптоти
ческие тельца, выделяют большое количество медиаторов
торможения [24]. Нейтрофилы, инфильтрирующие инфарци
рованный миокард, представляют собой пул короткоживу
щих воспалительных клеток, направленных на процесс апоп
тоза. Их удаление из зоны повреждения при помощи
макрофагов направлено на активацию механизмов ингибиро
вания воспаления. Продолжительность жизни нейтрофилов
может быть увеличена в провоспалительной среде инфаркта
благодаря эффектам ФНОα и IL-1b. Тем не менее через 3—7
дней после острого коронарного события нейтрофильная ин
фильтрация разрешается в экспериментальных моделях ин
фаркта у мышей и собак, поскольку большинство гранулоци
тов подвергается апоптозу. Как все погибающие клетки,
апоптотические нейтрофилы привлекают «захватчиков»,
продуцируя сигналы для своего обнаружения (липидные ме
диаторы и нуклеотиды), и экспрессируют сигналы (лизофос
фатидилхолин), способствующие собственному поглоще
нию. Апоптотические гранулоциты способны к подавлению
воспаления благодаря двум механизмам. Во-первых, умира
ющие клетки выделяют медиаторы, которые препятствуют
дальнейшему привлечению нейтрофилов, такие как аннек
син A1 и лактоферрин [25]. Эти посредники также выступа
ют в качестве хемоаттрактантов для фагоцитов, способствуя
тем самым разрешению нейтрофильного инфильтрата. Во-
вторых, поглощение апоптотических нейтрофилов активиру
ет противовоспалительную программу макрофагов, способ
ствующую образованию и высвобождению IL-10, TGFβ и
ряда липидных медиаторов (липоксинов и резолвинов) [26].
Хотя фундаментальная биология воспалительного ответа
предполагает решающую роль макрофаг-опосредованного
фагоцитоза апоптотических нейтрофилов в запуске противо
воспалительных сигналов, значение этих взаимодействий в
инфарцированном миокарде до сих пор не исследовалось.
Благодаря способности продуцировать и выделять ингиби
рующие медиаторы, такие как IL-10 и TGFβ, субпопуляции
моноцитов-супрессоров идеально подходят на роль негатив
ных регуляторов воспаления. За последнее десятилетие наши
познания о вовлечении моноцитов в реакции иммунного от
вета расширились: обнаружена их комплексная роль и функ
циональная гетерогенность в условиях воспаления [27]. У
мышей документировано две основные субпопуляции моно
цитов: 1) субпопуляция Ly6
hi воспалительных моноцитов,
мигрирующих в поврежденные ткани и экспрессирующих
высокий уровень рецептора
-хемокинов —
R2 и низ
кий уровень рецептора
R1 (Ly-6
2) меньшая субпопуляция Ly6
резидентных моноцитов [28]. Субпопуляции моноцитов с
различными модуляторными воздействиями на воспалитель
ные реакции описаны и в организме человека:
D16 — моно
циты человека экспрессируют высокие уровни
R2 и име
ют провоспалительные свойства, напоминающие мышиные
Ly6
hi клетки [29]. Следующая за инфарктом миокарда ран
няя индукция
R2 лиганда, моноцитарного хемотаксиче
ского протеина (monocyte chemoattractant protein, M
[30] отвечает за привлечение провоспалительных Ly-6
моноцитов; эти клетки захватывают дебрис и выделяют вос
палительные цитокины и матрикс-деградирующие протеина
зы [31]. Угнетение воспалительных сигналов связано с при
влечением Ly6
R1hi моноцитов, которые
продуцируют медиаторы ангиогенеза и способствуют про
цессам репарации. Конкретные взаимодействия хемокинов и
их рецепторов, стимулирующие рекрутирование субпопуля
ций моноцитов-супрессоров для своевременного подавления
постинфарктного воспаления в зоне репарации миокарда,
остаются неизвестными. В клинических исследованиях гете
рогенность моноцитов также продемонстрирована у пациен
тов с ОИМ. У больных инфарктом миокарда с подъемом сег
мента ST зафиксирован ранний пик циркулирующих
провоспалительных
D16-клеток и отмечено его не
гативное влияние на процессы восстановления функции ми
окарда [32]. Ранее был известен только один способ актива
ции макрофагов, который в настоящее время носит название
классического способа активации. Такая активация происхо
дит при контакте макрофага с активированным Т-лимфоцитом
хелпером 1-го типа (Th-1) [33]. Th-1 клетки образуются при
попадании в организм вирусов и некоторых бактерий (преи
мущественно внутриклеточных патогенных агентов). Стиму
лом для их дифференцировки из незрелых эффекторных
Т-лимфоцитов (Th0) служит выделение IL-12 дендритными
клетками и γ-интерферона (γ-ИФН) естественными киллера
ми (
K-клетками). После активации Th-клетка начинает вы
делять определенный спектр цитокинов, в частности γ-ИФН,
а на ее поверхности экспрессируется лиганд
D40. Эти бел
ки связываются с соответствующими рецепторами на по
верхности макрофага и вызывают его активацию. После та
кой первичной активации макрофаг, встречаясь с патогеном,
фагоцитирует его, подвергает переработке (процессингу), за
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
ноподобного фактора роста (IGF) и ТРФ, — усиливается так
же ангиогенез, в котором, кроме указанных факторов, важ
ную роль играет фактор роста эндотелия сосудов (
endothelial growth factor,
EGF). Все эти молекулы продуци
руются альтернативно активированными макрофагами [34].
Классификации макрофагов, подразделяющая их на М1
и М2, достаточно упрощена; все чаще признают, что ткани,
в которых протекают процессы воспаления, содержат более
широкий спектр субпопуляций макрофагов с различными
свойствами и функциональными характеристиками [35].
Возможно, фенотипы М1 и М2 представляют собой лишь
крайние состояния поляризации макрофагального фенотипа,
между которыми существует ряд промежуточных состояний
[36]. В зоне инфаркта миокарда происходит пространствен
ная и временная регуляция экспрессии различных цитокинов,
хемокинов, факторов роста, что может влиять на фенотип ма
крофагов и приводить к последующему образованию их раз
личных субпопуляций. Во время фазы разрешения воспаления
макрофаги, фагоцитирующие апоптотические нейтрофилы,
могут приобрести фенотип регуляторных путем экспрессии
большого количества медиаторов торможения и подавления
воспалительной реакции. К сожалению, экспериментальные
исследования, изучающие роль субпопуляций макрофагов в
процессе рубцевания миокарда, не проводились. Фенотипи
ческие характеристики, молекулярный профиль и функцио
нальная роль этих клеток отчасти остаются неизвестными.
Для определения активации макрофагов по фенотипам М1
гружает полученные в результате переработки антигена пеп
тиды в молекулы главного комплекса гистосовместимости
(ГКГ) II класса, представляет комплекс молекулы ГКГ с пеп
тидом на свою поверхность Т-клеткам. Весь этот процесс со
провождается продукцией провоспалительных цитокинов и
экспрессией их рецепторов (IL-8/
L8; IP-10/
L5; IL-1; IL-6; ФНОα). При этом усиливается
высвобождение оксида азота, активных форм кислорода,
протеолитических ферментов, включая металлопротеиназы
(ММР)-1, -2, -7, -9 и -12, которые разрушают коллаген, эла
стин, фибронектин и другие компоненты внеклеточного ма
трикса. Повышение продукции
O обусловлено повышени
ем экспрессии индуцибельной
O-синтазы (i
OS). Активные
формы кислорода и
O обусловливают цитотоксическую ак
тивность активированных макрофагов. Кроме этого, на их
поверхности усиливается экспрессия
D40 и рецепторов к
фактору некроза опухоли α (ФНОα). Макрофаг начинает ак
тивно продуцировать ФНОα, который аутокринным спосо
бом действует на рецепторы, находящиеся на поверхности
макрофага, и усиливает его активацию. Активированный
классическим путем макрофаг претерпевает изменения, су
щественно увеличивающие его эффективность в борьбе с
патогенными агентами и способность усиливать иммунный
ответ. Описанные механизмы направлены на защиту хозяина,
но при условии длительного неконтролируемого или резкого
высвобождения в большом количестве могут параллельно
быть причиной разрушения клеточных и внеклеточных
структур макроорганизма. Таким образом, классически акти
вированные макрофаги выделяют провоспалительные цито
кины фенотипа Т-хелперов 1-го типа, способствуют разви
тию воспаления, разрушению внеклеточного матрикса и
апоптозу. Механизм альтернативной активации макрофагов
состоит в следующем. Захват растворимого антигена проис
ходит с помощью пиноцитоза. Достаточными стимулами для
подержания активности макрофага служат IL-4 и IL-13, вы
деляемые Т-лимфоцитами хелперами 2-го типа (Th-2). По
глощенный с помощью пиноцитоза растворимый антиген за
гружается в молекулы ГКГ II класса, комплекс молекулы ГКГ
с пептидом выводится на поверхность макрофага для презен
тации Т-клеткам. Альтернативно активированные макрофаги
также выделяют цитокины, однако в их составе превалируют
противовоспалительные цитокины — IL-4, IL-13, IL-10,
TGFβ, воздействуя на фибробласты, усиливают их способ
ность продуцировать элементы внеклеточного матрикса.
Альтернативно активированные макрофаги усиливают ак
тивность фермента аргиназа І, который вовлекает пролин в
биосинтез полиаминов, что также способствует восстановле
нию внеклеточного матрикса. Кроме усиления пролифера
ции клеток под влиянием цитокинов — тромбоцитарного
фактора роста (Platelet-derived growth factor, PDGF), инсули
Таблица 1
тимулы для поляризации макрофагов по фенотипам М1 и М2
• Th-1 цитокины (ИФН-γ,
•Патоген-ассоциированные
молекулярные комплексы (ЛПС,
липопротеины, dsPHK, липо
теикоевая кислота).
• Различные грамположительные
и грамотрицательные микроор
ганизмы, цитомегаловирус
• Белки теплового шока, компо
ненты внеклеточного матрикса,
бокс 1 высокомобильной груп
• Th-2 цитокины (IL-4, IL-13)
• Иммунные комплексы в со
четании с IL-1β
• IL-10, TGFβ
• Агонисты PPAR-g (ядерного
рецептора, контролирующего
макрофагальное воспаление).
• В некоторых ситуациях
внутриклеточные патогены
• Витамин D
• Гормоны (глюкокортикоиды)
• Апоптотические клетки
Таблица 2
равнение фенотипов М1 и М2: секреция цитокинов и других
OS (выработка
0 и пероксинитрита)
• Синтез АФК
• Провоспалительные ци
токины (IL-lβ, IL-6, ФНОα,
• Трансформирующий ростовой
фактор-β (TGFβ)
• Экспрессируют маннозные
рецепторы
• Аргиназа-1 (выработка мо
чевины, орнитина и пролина),
отсутствие выработки
L17 (TAR
(эотаксин-3)
• Фибронектин
Таблица 3
равнение фенотипов М1 и М2: поверхностные маркеры
• TLR-2
• TLR-4
1, маннозный
рецептор)
• Нуклеотидные рецепторы
11,
• С-типа лектиноподобный ре
цептор Дектин-1
• Фагоцитарные рецепторы
R4, фузин (
• TRAIL
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
и М2 используют различные маркеры. Основные активато
ры поляризации макрофагов по М1- и М2-фенотипу пред
ставлены в табл. 1. В табл. 2 представлена сравнительная
характеристика секреции цитокинов и других биологически
активных веществ (БАВ) М1- и М2-макрофагами. В табл. 3
приведен список основных маркеров, экспрессируемых на
поверхности макрофагов М1- и М2-фенотипа [37].
Заключение
Таким образом, функция альтернативно активированных
макрофагов в отличие от классически активированных ма
крофагов направлена на разрешение воспаления и усиление
репаративных процессов. Однако следует учитывать, что на
ряду с благоприятной для организма активностью альтерна
тивно активированные макрофаги имеют важное значение в
развитии аутоиммунного воспаления.
Возвращаясь к идее о том, что для обеспечения опти
мальных условий рубцевания и предотвращения развития
неблагоприятного ремоделирования миокарда необходимо
своевременное подавление и сдерживание воспалительных
сигналов [38], возникает вопрос о факторах, способных при
водить к дефектам и отклонениям в пространственной и вре
менной регуляции постинфарктной воспалительной реакции.
Ранее доказана возможность перепрограммирования одного
фенотипа макрофагов в другой (М1 в М2) [28]. Учитывая
многофункциональность и пластичность макрофагов, пони
маем, что они привлекают к себе пристальное внимание как
потенциальная целевая клетка — терапевтическая мишень,
которая может изменять процесс репарации (заживления) и
структурно-функциональной перестройки сердца во время и
после инфаркта миокарда.
Наиболее важным в настоящее время оказывается опре
деление биологических маркеров и факторов, определяющих
пластичность макрофагов. Так, в экспериментальных работах
выявлено, что к таковым следует отнести дендритные клетки.
Ученые выяснили, что устранение дендритных клеток приво
дит к увеличению количества моноцитов и М1-макрофагов,
что влечет к стимуляции воспаления и деградации экстра
целлюлярного матрикса посредством снижения количества
противовоспалительных моноцитов и М2-макрофагов. Та
ким образом, дендритные клетки могут выполнять протек
тивную функцию при инфаркте миокарда, влияя на гомео
стаз моноцитов и макрофагов, а также на переход воспаления
в репарацию во время и после инфаркта миокарда [39]. Неко
торые исследования показали кардиопротективные эффекты
сердечных макрофагов с помощью липосом клодроната в мо
делях грызунов. Назначение липосом клодроната гипертен
зивным крысам снижало количество сердечных макрофагов,
это приводило к снижению сократимости сердца. В модели
инфаркта миокарда назначение этих липосом приводило к
замедлению процессов заживления миокарда, замедлению
ангиогенеза, прогрессированию дилатации сердца и высокой
смертности. Авторы заключают, что сердечные макрофаги
принимают активное участие в заживлении сердца и могут
ограничивать последствия инфаркта миокарда.
Таким образом, при инфаркте миокарда воспаление раз
вивается в ответ на некроз кардиомиоцитов и служит уни
версальной биологической реакцией — типовым патологи
ческим процессом, который завершается фазой репарации/
регенерации. Моноциты/макрофаги и резидентные макро
фаги — ключевые участники воспалительной реакции. Они
секретируют про- и противовоспалительные факторы, фаго
цитируют погибшие клетки, способствуют формированию
соединительной ткани, выделяют факторы ангиогенеза и
фиброгенеза, во многом могут определять ремоделирование
сердца, выделяя эластазу, коллагеназу и гиалуронидазу, а так
же воздействуя на процессы апоптоза и пролиферации карди
омиоцитов. В перспективе существенный интерес представ
ляет проведение клинико-экспериментальных исследований,
посвященных изучению роли субпопуляций макрофагов в
процессе рубцевания миокарда. Фенотипические характери
стики, молекулярный профиль и функциональная роль этих
клеток остаются малоизвестными [41].
Конфликт интересов.
Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
Финансирование.
Работа выполнена при поддержке
гранта РФФИ №16-04-01268, сроки выполнения — 2016—
2018 гг.
ЕРА
РА
Марков В.А., Рябов В.В., Вышлов Е.В., Рябова Т.Р., Шурупов В.С.,
Оюнаров Э.О. и др.
Особенности ремоделирования сердца после
инфаркта миокарда при фармакоинвазивных методах реперфу
зии и усиленной наружной контрпульсации
. Томск: STT; 2014.
Монастырская Е.А., Лямина С.В., Малышев И.Ю. М1 и М2 фе
нотипы активированных макрофагов и их роль в иммунном от
вете и патологии.
Патогенез.
Eisen A., Benderly M., Behar S., Goldbourt U., Haim M. In�ammation
and future risk of symptomatic heart failure in patients with stable
N
ian M., Lee P., Khaper
., Liu P. In�ammatory cytokines and
postmyocardial infarction remodeling.
Circ. Res
. 2004; 94(12):
N
drepepa G., Mehilli J., Martinoff S.. Evolution of left ventricular
ejection fraction and its relationship to infarct size after acute
J. Am. Coll. Cardiol.
4.
Markov
.A., Ryabov
.,
ishlov E.
., Ryabova T.R., Shurupov
.S., Oyunarov E.O. et al.
Postinfarction Heart Remodeling after
Acute Myocardial Infarction and Pharmakoinvasive Reperfusion and
. Tomsk: STT; 2014. (in Russian)
Ishii H., Amano T., Matsubara T., Murohara T. Pharmacological
intervention for prevention of left ventricular remodeling and
improving prognosis in myocardial infarction.
Circulation.
118(25): 2708—10.
.I., Gona P., Larson M.G.,
ang T.J.,
Levy D. et al. Long-term trends in myocardial infarction incidence
and case fatality in the
ational Heart, Lung, and Blood Institute’s
Framingham Heart Study.
Circulation.
2009; 119(9): 1203—10.
Porto I., Gaudino M., De Maria G.L., Di
ito L.,
ergallo R., Bruno
P. et al. Long-term morphofunctional remodeling of internal thoracic
artery grafts: a frequency-domain optical coherence tomography
study.
Circ. Cardiovasc. Interv.
8.
Ismahil M.A., Hamid T., Bansal S.S., Patel B., Kingery J.R., Prabhu
S.D. Remodeling of the mononuclear phagocyte network underlies
chronic in�ammation and disease progression in heart failure: critical
Circ. Res.
2014; 114(2): 266—82.
Anzai T. Post-infarction in�ammation and left ventricular remodeling:
Circ. J..
Burch�eld J.S.,
ie M., Hill J.A. Pathological ventricular remodeling:
Circulation.
11.
C
hristia P., Frangogiannis
.G. Targeting in�ammatory pathways in
Eur. J. Clin. Invest.
.G. The in�ammatory response in myocardial injury,
repair, and remodelling.
Nature Rev. Cardiol.
2014; 11(5): 255—65.
Murray P.J.,
ynn T.A. Protective and pathogenic functions of
Nature Rev. Immunol.
2011; 11(11): 723—37.
Fujiu K.,
agai R..
ontributions of cardiomyocyte-cardiac
�broblast-immune cell interactions in heart failure development.
Basic Res. Cardiol.
Fujiu K.,
ang J.,
agai R.
ardioprotective function of cardiac
Cardiovasc. Res.
Fujiu K.,
agai R.
ontributions of cardiomyocyte-cardiac �broblast-
immune cell interactions in heart failure development.
Basic Res.
Cardiol.
Bujak M., Dobaczewski M.,
hatila K., Mendoza L.H., Li
., Reddy A.
et al. Interleukin-1 receptor type I signaling critically regulates infarct
Schroder K., Tschopp J. The in�ammasomes.
2010; 140(6):
Immunology. 2016; 37(6)
DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-311-315
ARTICLE
– 311 –
Kawaguchi M., Takahashi M., Hata T., Kashima
., Usui F.,
Morimoto H. et al. In�ammasome activation of cardiac �broblasts
is essential for myocardial ischemia/reperfusion injury.
Circulation.
2011; 123(6): 594—604.
.G. Pathophysiology of myocardial infarction.
Compr. Physiol
Martinez F.O., Sica A., Mantovani A., Locati M. Macrophage
Front. Biosci.
Biswas S.K., Mantovani A. Macrophage plasticity and interaction
with lymphocyte subsets: cancer as a paradigm.
Nature Immunol.
2010; 11(10): 889—96.
Geissmann F., Gordon S., Hume D.A., Mowat A.M., Randolph G.J.
Unravelling mononuclear phagocyte heterogeneity.
Nature Rev.
W
olfs I.M., Donners M.M., de
inther M.P. Differentiation fac
tors and cytokines in the atherosclerotic plaque micro-environment
as a trigger for macrophage polarisation.
Thromb. Haemost.
2011;
Fairweather D.,
ihakova D. Alternatively activated macrophages in in
fection and autoimmunity.
J. Autoimmun.
26.
Panizzi P., Swirski F.K., Figueiredo J.L.,
aterman P., Sosnovik D.E.,
Aikawa E. et al. Impaired infarct healing in atherosclerotic mice with
Ly-6
J. Am. Coll. Cardiol.
Frantz S.,
ahrendorf M.
ardiac macrophages and their role in
Cardiovasc. Res.
Kzhyshkowska J.,
orkman G.,
ila M., Arap
., Pasqual
ini R., Gratchev A. et al.
ovel function of alternatively activated
macrophages: stabilin-1-mediated clearance of SPAR
J. Immunol.
Bouhlel M.A., Derudas B., Rigamonti E., Diиvart R., Brozek J.,
Haulon S. et al. PPARgamma activation primes human monocytes
into alternative M2 macrophages with anti-in�ammatory properties.
Bournazou I., Pound J.D., Duf�n R., Bournazos S., Melville L.A.,
Brown S.B. et al. Apoptotic human cells inhibit migration of granulo
2009; 119(1): 20—32.
Soehnlein O., Lindbom L. Phagocyte partnership during the onset and
Nature Rev. Immunol
Geissmann F., Jung S., Littman D.R. Blood monocytes consist of two
principal subsets with distinct migratory properties.
Immunity.
Dewald O., Zymek P.,
inkelmann K., Bournazos S., Melville L.A.,
Brown S.B. et al.
hemoattractant Protein-1 regu
lates in�ammatory responses critical to healing myocardial infarcts.
Circ. Res.
N
ahrendorf M., Swirski F.K., Aikawa E., Stangenberg L.,
T., Figueiredo J.L. et al. The healing myocardium sequentially mobi
lizes two monocyte subsets with divergent and complementary func
35.
Ikejima H., Imanishi T., Tsujioka H., Kuroi A., Tanimoto T., Kitabata
H. et al. Effect of human peripheral monocyte subsets on coronary
�ow reserve in infarct-related artery in patients with primary anterior
acute myocardial infarction.
Clin. Exp. Pharmacol. Physiol.
2010;
Martinez F.O., Gordon S., Locati M., Mantovani A. Transcriptional
pro�ling of the human monocyte-to-macrophage differentiation and
polarization: new molecules and patterns of gene expression.
J. Im
2006; 177(10): 7303—11.
Monastirskaya E.A., Lyamina S.
., Malishev I.U. M1 and M2 phe
notypes of activated macrophages and their role in the immune re
Johnson J.L.,
ewby A.
. Macrophage heterogeneity in atheroscle
Curr. Opin. Lipidol
Mosser D.M., Edwards J.P. Exploring the full spectrum of mac
Nature Rev. Immunol.
Dobaczewski M., de Haan J.J., Frangogiannis
.G. The extracellular
matrix modulates �broblast phenotype and function in the infarcted
J. Cardiovasc. Transl. Res.
Anzai A., Anzai T.,
agai S., Maekawa
aito K., Kaneko H. et
al. Regulatory role of dendritic cells in postinfarction healing and left
Circulation.
Поступила 04.06.16
Принята в печать 16.08.16
ВТ
ОРО
К 612.112.95.017.1:577.27.083.3
Сахно Л.В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Останин А.А., Черных Е.Р.
КУ
СТ
М2-МАКРОФАГО
ФГБНУ «НИИ фундаментальной и клинической иммунологии», 630099, г. Новосибирск
Макрофаги относятся к клеткам врожденного иммунитета и играют важную роль в защите организма от патогенно
го воздействия, поддержании тканевого гомеостаза (элиминации стареющих, опухолевых и поврежденных клеток)
и процессах заживления. Анализ данных литературы позволяет вычленить как минимум два функциональных
типа макрофагов — классические провоспалительные и противовоспалительные макрофаги, получившие назва
ние М1- и М2-клеток соответственно. М1- и М2-клетки имеют фенотипические особенности и характерный для
каждого типа цитокиновый профиль. М2-макрофаги, генерируемые в условиях дефицита ростовых факторов, об
ладают повышенной цитотоксической и цитостатической активностью по сравнению с М1-клетками. Причем из 4
анализируемых коингибиторных и проапоптогенных молекул (B7-H1, CD206, TRIAL, FasL) ведущую роль в реали
зации цитотоксического эффекта играет молекула B7-H1, нейтрализация которой снижает апоптозиндуцирующую
активность М2-клеток. Блокирование других молекул не влияет на способность М2-клеток индуцировать апоптоз
Т-лимфоцитов. В то же время блокирование CD206 и TRAIL оказывает умеренный, но значимый подавляющий
эффект на цитостатическую активность М2-клеток.
Ключевые слова:
макрофаги; функциональная дихотомия; фенотип; проапоптогенная и цитостатическая
активность.
Для цитирования:
Сахно Л.В., Шевела Е.Я., Тихонова М.А., Останин А.А., Черных Е.Р. Молекулярные механизмы
иммуносупрессорной активности М2-макрофагов. Иммунология. 2016; 37(6): 311-315. DOI: 10.18821/0206-4952-
2016-37-6-311-315
Для корреспонденции:
Сахно Людмила Васильевна,
канд. биол. наук, E-mail: lsahno53Bmail.ru
Иммунология. 2016; 37(6)
DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-311-315
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
Sakhno L.V., Shevela E.Ya., Tikhonova M.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R.
MOLECULAR MECHANISMS OF M2 MACROPHAGE IMMUNOSUPPRESSIVE ACTIVITY
Macrophages are cells of innate immunity and play an important role in protecting the body from pathogenic exposure,
the maintenance of tissue homeostasis (elimination of ageing, neoplastic and damaged cells) and the healing process.
Analysis of literature data allows to isolate at least two functional type macrophages — the classic proin�ammatory and
anti-in�ammatory macrophages called M1 and M2 cells, respectively. M1 and M2 cells have phenotypic features and
characteristics for each type cytokine pro�le. M2-macrophages generated in the conditions of de�ciency of growth factors,
have high cytotoxic and cytostatic activity compared with M1 cells. And of the 4 analyzed coinhabiting and proapoptotic
molecules (B7-H1, CD206, TRIAL, FasL) leading role in the implementation of the cytotoxic effect plays a molecule B7-H1
neutralization which reduces apoptosisinducing activity of M2 cells. Blocking other molecules does not affect the ability
of M2 cells to induce apoptosis of T-lymphocytes. At the same time blocking CD206 and TRAIL has a mild but signi�cant
suppressive effect on cytotoxic activity of M2 cells.
macrophages; functional dichotomy; phenotype; proapoptotic and cytotoxic activity.
For citation:
Sakhno L.V., Shevela E.Ya., Tikhonova M.A., Ostanin A.A., Chernykh E.R.
olecular mechanisms of m2 macrophage
immunosuppressive activity. Immunologiya.2016; 37(6): 311-315. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-311-315
For correspondence:
Sakhno Luydmila Vasil’evna
on�ict of interest.
The authors declare no con�ict of interest.
This work was supported by RFBR grant No. 13-04-00113.
ведение
Макрофаги (Мф) являются пластичными клетками, кото
рые могут проявлять как провоспалительные (М1-фенотип),
так и противовоспалительные (М2-фенотип) свойства [1, 2].
Функциональный тип Мф во многом определяется условиями
активации. Так, при классической активации липополисахари
дом (LPS) в сочетании с IF
-γ Мф приобретают провоспали
тельные свойства М1-фенотип. В свою очередь при активации
IL-4/IL-13, а также в присутствии IL-10, иммунных комплек
сов, дексаметазона и витамина D
индуцируется М2-фенотип
[2—4]. У человека дифференцировка моноцитов в М2-клетки
индуцируется с помощью M-
SF (в отличие от GM-
SF, кото
рый индуцирует созревание М1-клеток) [5]. Кроме того, сиг
налом к переключению М1-фенотипа на М2 может являться
фагоцитоз макрофагами апоптотических клеток [6].
М1-макрофаги обладают выраженной цитотоксической,
антимикробной и антипролиферативной активностью, опосре
дованной продукцией активных метаболитов кислорода, нитро
оксида и провоспалительных цитокинов. Они играют важную
роль в защите от внутриклеточных патогенов и элиминации
опухолевых клеток, однако при патологии могут оказывать
тканедеструктивное действие. Макрофаги с М2-фенотипом,
напротив, ограничивают воспалительный/иммунный ответ и
стимулируют процессы тканевой репарации, участвуют в фор
мировании иммунологической толерантности при беремен
ности и опухолевом росте [4, 7, 8]. Несмотря на важную роль
М2 в норме и при патологии, механизмы супрессорной актив
ности М2-макрофагов остаются малоизученными. Традицион
но иммуносупрессорную активность М2-клеток связывают со
сниженной продукцией провоспалительных и повышенным
уровнем противовоспалительных цитокинов [5]. В то же вре
мя значение поверхностных молекул, способных опосредовать
прямое цитотоксическое и/или цитостатическое действие ма
крофагов, остается практически неисследованным.
Ранее нами было показано, что генерация Мф в условиях
дефицита ростовых/сывороточных факторов позволяет полу
чить популяцию М2-клеток, которые отличаются от М1 повы
шенной экспрессией не только М2-ассоциированных (
D206),
но и проапоптогенных молекул — B7-H1, FasL и TRAIL [9].
Генерируемые М2-клетки обладали более низкой способно
стью стимулировать пролиферацию аллогенных Т-клеток, при
этом аллостимуляторная активность обратно коррелировала с
экспрессией
D200R и TRAIL [9]. Эти данные позво
лили предположить, что низкая пролиферация Т-лимфоцитов
в присутствии М2-клеток в алло-СКЛ может быть обусловлена
прямым цитотоксическим и/или цитостатическим эффектом
М2-макрофагов, опосредованным повышенной экспрессией
коингибиторных и/или проапоптогенных молекул.
Целью настоящей работы являлась оценка пролифера
тивной активности и уровня апоптоза Т-лимфоцитов в СКЛ,
индуцированной М1- и М2-клетками, а также исследование
влияния нейтрализующих антител против TRAIL,
FasL, B7-H1 на цитотоксическую и цитостатическую актив
ность М2-макрофагов.
Материал и методы
В исследование были включены 50 здоровых доноров кро
ви в возрасте от 25 до 40 лет. Мононуклеарные клетки (МНК)
выделяли из гепаринизированной венозной крови центри
фугированием в градиенте плотности фиколла-верографина.
Для получения моноцитов МНК в концентрации 3—5 й 10
/мл
помещали в 6-луночные планшеты (TPP, Switzerland) в среде
RPMI-1640 (Sigma-Aldrich, Germany) с 5' F
S (Биолот, РФ)
на 18 ч в СО
-инкубаторе, после чего удаляли фракцию не
прилипших к пластику клеток. Относительное содержание
-моноцитов во фракции прилипающих МНК составляло
93—95'. Макрофаги М1-типа генерировали из прилипающей
фракции МНК в полной культуральной среде RPMI-1640, до
полненной 0,05 mM 2-меркапэтанола, 2 mM пирувата натрия,
0,3 мг/мл L-глютамина (все реактивы Sigma-Aldrich), 1' рас
твора незаменимых аминокислот, 100 мкг/мл гентамицина в
присутствии рекомбинантного GM-
SF человека (rhGM-
SF,
50 нг/мл, R&D Systems), 5' аутоплазмы и 2' F
S в течение
7 сут при 37 °
и 5'
. Макрофаги М2-типа генерировали
в аналогичных условиях в полной культуральной среде в при
сутствии GM-
SF (50 нг/мл) и 2' аутоплазмы, т. е. на фоне
депривации ростовых/сывороточных факторов.
Для оценки способности Мф стимулировать пролифера
цию Т-клеток оценивали интенсивность пролиферативного
ответа в алло-СКЛ. В качестве отвечающих клеток использо
вали МНК доноров (0,1 й 10
/лунку), стимуляторами служили
аллогенные М1- или М2-клетки в соотношении МНК:Мф
10:1. Пролиферативный ответ в СКЛ оценивали на 5-е сутки
радиометрически по включению
H-тимидина (1 мкК/лунку),
вносимого за 18 ч до окончания культивирования. Индекс
влияния МФ (ИВ
) в СКЛ рассчитывали как отношение
пролиферативного ответа МНК в присутствии Мф к уровню
спонтанной пролиферации МНК.
Immunology. 2016; 37(6)
DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-311-315
ARTICLE
Количество пролиферирующих Т-клеток (в S, G
клеточного цикла) оценивали в 2-суточной алло-СКЛ мето
дом двухцветной проточной цитометрии с использованием
йодистого пропидия (PI). Для оценки ранних стадий апопто
за клетки метили анти-
D3 антителами и далее инкубирова
ли с аннексином (An) и йодистым пропидием (Fitc Annexin
Apoptosis Detection Kit, BD) с последующим определением
относительного количества
клеток (ранний апоп
тоз). Общее количество апоптотических клеток оценивали по
суммарному количеству An
и An
Влияние нейтрализующих антител в СКЛ исследовали
путем добавления анти-B7-H1 (eBioscience, BD), анти-
(BioLegend, Germany), анти-TRAIL (Abcam, USA), анти-FasL
(BioLegend, Germany) антител в концентрации 3 мкг/мл.
Статистическую обработку полученных результатов про
водили с помощью пакета программ Statistica 6.0. Данные
представлены в виде средних значений (
) и стандартной
ошибки (S.E.), а также в виде медианных значений и квартиль
ного диапазона (LQ—UQ, 25—75' квартили). При сравнении
вариационных рядов использовали непараметрический крите
рий Вилкоксона для связанных (парных) выборок.
езультаты и обсуждение
Сравнительная оценка М1- и М2-клеток, генерируемых
из МНК одних и тех же доноров, показала, что полученные в
условиях дефицита ростовых факторов М2-клетки действи
тельно отличались более низкой аллостимуляторной актив
ностью (см. рисунок). Так, пролиферативный ответ аллоген
ных Т-лимфоцитов, индуцированный в СКЛ в присутствии
М2-макрофагов, был в 1,7 раза ниже, чем в присутствии
М1-клеток (5260 ± 980
8919 ± 1340 имп/мин;
0,0005).
Различия также выявлялись при сравнении индексов влия
ния М2- и М1-клеток: 15,1 ± 3,4 vs 25,7 ± 3,9 расч. ед. соот
ветственно (
Исследование уровня апоптоза Т-клеток в алло-СКЛ, инду
цированной М1- и М2-клетками, показало, что М2-макрофаги
обладали более высокой апоптоз-индуцирующей активно
стью (табл. 1). Количество Т-клеток в стадии раннего апоп
тоза и общее количество апоптотических клеток в алло-СКЛ
в присутствии М2-клеток было достоверно выше, чем в СКЛ,
индуцированной М-1 клетками. В СКЛ, индуцированной М2-
макрофагами, Т-лимфоциты также характеризовались мень
шим содержанием пролиферирующих клеток по сравнению с
культурами, СКЛ в присутствии М1-макрофагов, однако раз
личия были статистически недостоверны (табл. 1).
Чтобы выяснить, через какие сигнальные пути реализуется
повышенная цитотоксическая и/или цитостатическая актив
ность М2-макрофагов в культурах алло-СКЛ, были исполь
зованы нейтрализующие антитела против проапоптогенных
(FasL, TRAIL) и коингибиторных (B7-H1,
D206) молекул,
повышенная экспрессия которых была нами ранее выявлена
на М2-клетках. Из данных табл. 2 видно, что добавление в
культуры СКЛ анти-B7-H1 антител приводило к статисти
чески достоверному ослаблению проапоптогенной актив
ности М2-макрофагов. Это проявлялось снижением уровня
Т-клеток в стадии раннего апоптоза, а также общего количе
ства апоптотических Т-клеток. При этом эффект нейтрали
зующих анти-B7-H1 антител обнаруживался в 100' случаев.
Добавление анти-B7-H1 антител влияло также на цитоста
тическую активность М2-макрофагов, что проявлялось уве
личением числа пролиферирующих
Т-лимфоцитов —
с 20,9 ± 5,3 до 26,4 ± 4,5' (в S.G
/M фазе цикла). Несмотря
на то что данный эффект регистрировался в виде отчетливой
тенденции (
0,07), стимулирующее действие регистриро
валось в 87' случаев, т. е. в 7 из 8 тестированных культур.
D206, анти-TRAIL и анти-FasL антитела не ока
зывали значимого влияния на проапоптогенную актив
ность М2-макрофагов (табл. 3). Относительное содержание
Т-клеток в ранней стадии апоптоза (
) и общее
количество апоптотических клеток (
) в присутствии
нейтрализующих антител достоверно не изменялось. В то же
время добавление в культуры алло-СКЛ анти-
D206 и анти-
TRAIL антител (но не анти-FasL антител) сопровождалось
статистически значимым увеличением числа пролифери
рующих Т-лимфоцитов. При этом стимулирующий эффект
D206 антител проявлялся в 100' случаев, а количе
ство делящихся Т-клеток увеличивалось в среднем на 29 ±
8'. Эффект анти-TRAIL антител был менее выраженным,
поскольку отчетливо регистрировался только в 8 из 11 ис
следованных культур (в 73' случаев), а величина эффекта
составляла в среднем 14 ± 6'.
Суммируя полученные в настоящей работе данные, мож
но заключить, что М2-макрофаги, генерируемые в условиях
дефицита ростовых факторов, обладают повышенной цито
токсической и цитостатической активностью по сравнению
с М1-клетками. При этом из четырех анализируемых коин
гибиторных и проапоптогенных молекул (B7-H1,
TRAIL, FasL) ведущую роль в реализации цитотоксического
эффекта играет молекула B7-H1, нейтрализация которой сни
жает апоптоз-индуцирующую активность М2-клеток. Блоки
рование других молекул не влияет на способность М2-клеток
индуцировать апоптоз Т-лимфоцитов. В то же время блоки
рование
D206 и TRAIL оказывает умеренный, но значимый,
подавляющий эффект на цитостатическую активность М2-
клеток. Таким образом, снижение пролиферации Т-клеток в
культурах с М2-макрофагами по сравнению с уровнем отве
та в культурах с М1 сопряжено с повышенной экспрессией
М2-клетками коингибиторных и проапоптогенных молекул,
обусловливающих более высокий цитотоксический и цито
статический потенциал М2-макрофагов.
Супрессорную активность М2-клеток наиболее часто
связывают с повышенной продукцией противовоспалитель
ных/иммуносупрессивных цитокинов. При этом в зависимо
сти от получаемого сигнала М2-клетки могут различаться по
спектру продуцируемых цитокинов [10]. М2-клетки челове
ка, генерированные в присутствии M-
SF, характеризуются
высокой продукцией IL-10 на фоне низкой продукции IL-12,
IL-1β, IL-6, T
Fα в ответ на стимуляцию LPS, микобактери
альными антигенами, зимозаном A или IF
- в комбинации с
D40L [11]. В экспериментальных исследованиях на мышах
продемонстрировано, что макрофаги, генерированные в при
сутствии IL-10/TGFβ, отличаются высоким уровнем продук
ции IL-10 и TGFβ [12].
Проведенный нами ранее протеомный анализ цитокинов,
секретируемых М1- и М2-клетками, показал, что М2-клетки,
Аллостимуляторная активность М1 и М2 макрофагов. МНК до
норов (0,1 й 10
/лунку;
16) культивировали в течение 2 суток в
отсутствии (контроль) и в присутствии аллогенных М1 и М2 кле
ток в соотношении 10:1. Индекс влияния Мф в СКЛ рассчитывали
как отношение пролиферативного ответа МНК в присутствии Мф к
уровню спонтанной пролиферации МНК.
Данные представлены в виде
M ± S.E.
* — достоверность различий по
критерию Вилкоксона для связанных выборок (
Иммунология. 2016; 37(6)
DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-311-315
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
полученные в условиях дефицита ростовых факторов, отли
чаются от М1 более низкой продукцией иммунорегуляторных
и провоспалительных цитокинов/хемокинов (IF
-γ, IL-5, IL-6,
Fα, IL-17, M
P-1). При этом секреция иммуносупрессор
ных цитокинов была либо не изменена (IL-10), либо также
снижена (IL-13) [9]. Полученные данные позволяют заклю
чить, что одной из причин низкой пролиферативной активно
сти Т-клеток в СКЛ, индуцированной М2-макрофагами, явля
ется не столько гиперпродукция IL-10/IL-13, сколько дефицит
секреции иммунорегуляторных и провоспалительных цитоки
нов. В настоящей работе показано, что иммуносупрессорный
эффект М2-клеток связан также с их прямым цитотоксическим
и цитостатическим действием, опосредованным повышенной
экспрессией коингибиторных и проапоптогенных молекул.
В литературе имеются единичные сообщения о возмож
ной роли проапоптогенных молекул в реализации супрес
сорной активности макрофагов. Так, иммуносупрессорная
активность опухоль-инфильтрирующих макрофагов может
быть связана с проапоптогенной активностью этих клеток,
обусловленной повышенной экспрессией B7-H4 под действи
ем IL-6 и IL-10 [13]. Manrique с соавт. продемонстрировали
у мышей существование субпопуляции Foxp3
Мф, экспрес
сирующих проапоптогенные молекулы (TRAIL,
B7-H1, B7-H4) и способных ингибировать иммунный ответ
и индуцировать апоптоз клеток [14]. Существуют сведения о
цитостатической активности
миелоидных дендрит
ных клеток по отношению к клеткам опухоли, которая опо
средуется с помощью цитоплазматического TRAIL [15].
Заключение
Полученные нами результаты показали, что цитоток
сическая/цитостатическая активность лежит в основе им
муносупрессивной активности М2-клеток, генерируемых
в условиях дефицита ростовых факторов, при этом проа
поптогенная активность генерируемых в этом случае М2-
макрофагов обусловлена в первую очередь молекулой B7-
H1. Негативная регуляция Т-клеток через активацию PD-1/
PD-L1(B7-H1) пути обсуждается при многих иммунопато
логических заболеваниях — опухолевом росте, аутоиммун
ных заболеваниях, бактериальных, вирусных и паразитар
ных инфекциях [16—19]. Также показано, что повышенная
экспрессия B7-H1 регистрируется не только на опухолевых
клетках [16], но и на антигенпрезентирующих клетках, вклю
чая моноциты [20, 21], дендритные клетки [22] и макрофаги
[23]. При этом блокирование B7-H1-опосредуемого сигнала
на антигенпрезентирующих клетках приводит к снижению
продукции IL-10 и усилению их аллостимуляторной актив
ности и секреции IL-12. [24]. Запуск продукции противо
воспалительных цитокинов (IL-10) и подавление секреции
провоспалительных цитокинов в макрофагах может также
опосредоваться через активацию маннозных рецепторов
[25, 26]. Поэтому выявленное нами увеличение числа про
лиферирующих Т-клеток в СКЛ в присутствии анти-B7-H1
и анти-
D206 антител может быть связано с ингибирова
нием продукции IL-10 при блокировании B7-H1- и
ассоциированных сигнальных путей.
Относительно возможных механизмов индукции М2-
клеток в условиях дефицита ростовых факторов можно по
лагать, что в условиях депривации возрастает количество
апоптотических лимфоцитов, поглощение которых, соглас
но данным литературы, индуцирует переключение в сторо
ну М2-макрофагов. Однако данное предположение требует
дальнейших экспериментальных подтверждений.
В целом проведенные нами исследования расширяют
существующие представления о молекулярных механизмах
иммуномодулирующей активности М2-макрофагов и обо
сновывают необходимость дальнейших исследований роли
коингибиторных и проапоптогенных молекул в регуляции
Таблица 1
лияние макрофагов на апоптоз и клеточный цикл
Т-лимфоцитов в 2-суточной алло-
Показатель
«Ранний» апоптоз
Общее число апоп
тотических T-клеток
Пролиферирующие
Примечание. Данные представлены в виде средних значений
) и стандартной ошибки (
). В скобках указано число наблю
дений. p
– достоверность различий (по критерию Вилкоксона для
связанных выборок).
Таблица 2
лияние анти-B7-H1 антител на проапоптогенную и цитостати
ческую активность М2 макрофагов в 2-суточной алло-
Показатель
М2 (контроль)
«Ранний» апоптоз
Общее количество
апоптотических клеток
11,1 ± 0,8
Примечание. МНК-доноров (0,1й10
/лунку;
8) культивирова
ли 2 сут c аллогенными М2-клетками в соотношении 10:1 в отсут
ствие (контроль) и присутствии нейтрализующих антител против
B7-H1 (анти-B7-H1) в концентрации 3 мкг/мл. Данные представле
ны в виде
М ± S.E
. p
– достоверность различий (по критерию Вил
коксона для связанных выборок).
Таблица 3
L и анти-FasL-
нейтрализующих антител на проапоптогенную и цитостатиче
скую активность М2-макрофагов в 2-суточной алло-
Параметр
М2 (контроль)
11)
Т-клетки в
L
11)
Т-клетки в
Анти-FasL
Т-клетки в
Примечание. МНК доноров (0,1й10
/лунку) культивировали 2
сут c аллогенными М2-клетками в соотношении 10:1 в отсутствие
(контроль) и в присутствии нейтрализующих антител против
D206), TRAIL (анти-TRAIL), FasL (анти-FasL) в концентра
ции 3 мкг/мл. Данные представлены в виде
М ± S.E.
*, ** – досто
верность различий по критерию Вилкоксона для связанных выборок
<0,01 соответственно).
Immunology. 2016; 37(6)
DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-311-315
ARTICLE
взаимодействий между М2-макрофагами и активированны
ми Т-лимфоцитами.
Финансирование.
Работа поддержана грантом РФФИ
№ 13-04-00113-а.
Конфликт интересов.
Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
ЕРА
РА
Сахно Л.В., Тихонова М.А., Шевела Е.Я., Тыринова Т.В., Лепли
на О.Ю., Останин А.А. и др. Фенотипические и функциональ
ные особенности М2-подобных макрофагов человека.
Бюлле
тень СО РАМН
C
assetta L.,
assol E., Poli G. Macrophage polarization in health and
Sci. World J.
2011; 11: 2391—402.
Gordon S. Alternative activation of macrophages.
Nature Reviews
Martinez F.O., Sica A., Mantovani A., Locati M. Macrophage activa
Front. Biosci.
V
ega M.A.,
orbi A.L. Human macrophage activation: too many
functions and phenotypes for a single cell type.
. 2006;
V
erreck F.A., de Boer T., Langenberg D.M., Hoeve M.A., Kramer
aisberg E. et al. Human IL-23-producing type 1 macrophages
promote but IL-10-producing type 2 macrophages subvert immu
nity to (myco) bacteria.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA
. 2004; 101(13):
.A., Bratton D.L., Konowal A., Freed P.
estcott J.
Henson P.M. Macrophages that have ingested apoptotic cells in vitro
inhibit proin�ammatory cytokine production through autocrine/para
crine mechanisms involving TGF-beta, PGE2, and PAF.
J. Clin. In
N
agamatsu T., Schust D.J. The contribution of macrophages to nor
mal and pathological pregnancies.
Am. J. Reprod. Immunol
. 2010;
Sica A., Bronte
. Altered macrophage differentiation and immune
dysfunction in tumor development.
J. Clin. Invest
. 2007; 117(5):
1155—66.
Sakhno L.
., Tikhonova M.A., Shevela E.
a., Tyrinova T.
., Lep
lina O.
u., Ostanin A.A. et al. Phenotypic and functional features
of human M2-like macrophages.
Byulleten’ SO RAMN.
2014; 34(4):
Mantovani A., Biswas S.K., Galdiero M.R., Sica A., Locati M
rophage plasticity and polarization in tissue repair and remodeling.
11.
V
erreck F.A.
., de Boer T., Langenberg D.M.L., van der Zanden
L., Ottenhoff T.H.M. Phenotypic and functional pro�ling of human
proin�ammatiry type-1 and anti-in�ammatory type-2 macrophages
in response to microbial antigens and IF
- and
D40L-mediated co
C
ao Q.,
., Zheng D., Sun
., Lee
.S. et al. IL-10/
TGF-в-modi�ed macrophages induce regulatory T cells and protect
against Adriamycin nephrosis.
J. Am. Soc. Nephrol.
2010; 21(6):
Kryczek I., Zou L., Rodriguez P., Zhu G.,
ei S., Mottram P. et al. B7-
H4 expression identi�es a novel suppressive macrophage population
Manrique S.Z.,
orrea M.A.D., Hoelzinger D.B., Dominguez A.L.,
., Lin H.-H. et al. Foxp3-positive macrophages display im
munosuppressive properties and promote tumor growth.
J. Exp. Med.
2011; 208(7): 1485—99.
Shi J., Ikeda K., Maeda
., Shinagava K., Ohtsuka A.,
amamura H.
et al. Identi�cation of
myeloid dendritic cells as an early-
stage immature subset with strong tumoristatic potential.
Cancer Let
C
uriel T.J.,
ei S., Dong H., Alvarez
heng P., Mottram P. et al.
Blockade of B7-H1 improves myeloid dendritic cell-mediated anti
tumor immunity.
Sharpe A.H.,
herry E.J., Ahmed R., Freeman G.J. The function of
programmed cell death 1 and its ligands in regulating autoimmunity
18.
W
ilcox R.A., Feldman A.L.,
ada D.A.,
ang Z-Z.,
omfere
.I.,
Dong H. et al. B7-H1 (PD-L1,
D274) suppresses host immunity in T-
2009; 114(10): 2149—58.
Y
e P.,
eng Z.-H., Zhang S-L. Zhang J.-A., Zhao L., Dong J.-H.
et al
Programmed death-1 expression is associated with the disease
status in hepatitis B virus infection.
Word J. Gastroentero
l. 2008; 14:
Schreiner B., Mitsdoerffer M., Kieseier B.
hen L., Hartung H.P.,
eller M. et al.
Interferon-в enhances monocyte and dendritic cell
expression of B7-H1 (PD-L1), a strong inhibitor of autologous T-cell
activation: relevance for the immune modulatory effect in multiple
J. Neuroimmunol.
Trabattoni D., Saresella M., Biasin M., Boasso A., Piacentini L.,
Ferrante P. et al. B7-H1 is upregulated in HI
infection and is a
novel surrogate marker of disease progression.
2003; 101(7):
Sakhno L.
., Tikhonova M.A., Tyrinova T.
., Shevela E.
a., Leplina
ikonov S.D. et al.
ytotoxic activity of dendritic cells as a
possible mechanism of negative regulation of T lymphocytes in pul
monary tuberculosis.
Clin. Dev. Immunol.
2012; 2012: 628635. doi:
10.1155/2012/628635.
Smith P.,
.M., Mangan
.E., Fallon R.E., Sayers J.R., McK
enzie A.
.J. Schistosoma mansoni worms induce energy of T cells
via selective upregulation of programmed death ligand 1 on mac
C
hen L., Zhang Z.,
., Zhang Z., Li
., Shi M. et al. B7-H1 up-
regulation on myeloid dendritic cells signi�cantly suppresses T cell
immune function in patients with chronic hepatitis B.
J. Immunol.
Allavena P.,
hieppa M., Bianchi G., Solinas G., Fabbi M., Laska
rin G. et al. Engagement of the mannose receptor by tumoral mu
cins activates an immune suppressive phenotype in human tumor-
associated macrophages.
Clin. Dev. Immunol
. 2010; 2010: 547179.
doi:10.1155/2010/547179.
Guirado E., Schlesinger L.S., Kaplan G
Macrophages in tuberculo
Поступила 25.02.15
Принята к печати 16.08.16
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
ЦИТОКИНЫ
ВТ
ОРО
К 616-092:612.017.1:612.112.94.015.2:612.6.084
Круглов А.А.
, Свиряева Е.Н.
, Друцкая М.С.
Идальго Х.
, Недоспасов С.А.
АЯ ХАРАК
СТ
«Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта» РАН, 119991, г. Москва;
Научно-исследовательский институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского и кафедра
иммунологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, 119992, г. Москва;
Автономный университет Барселоны, Испания
Интерлейкин-6 (IL-6) представляет собой плейотропный иммунорегуляторный цитокин, который выполняет важные
функции в регуляции иммунной системы, но в некоторых случаях может способствовать развитию тяжелых забо
леваний, от аутоиммунных до раковых. Особый теоретический и практический интерес представляет соотнесение
конкретных функций IL-6, как полезных, так и вредных, с типом клеток, которые его продуцируют. В настоящей ра
боте сообщают о создании мышей с дефицитом продукции IL-6 только в дендритных клетках. Используя этих мы
шей, выяснили, что IL-6, производимый дендритными клетками, участвует в развитии IL-17A и TNF, производящих
СD4 Т-клеток при иммунизации. Таким образом, данная мышиная модель представляет собой удобную модель
для анализа вклада IL-6 из дендритных клеток на развитие различных иммунопатологий
Ключевые слова:
интерлейкин-6 (IL-6); обратная генетика; генетический нокаут; дендритные клетки.
Для цитирования:
Круглов А.А., Носенко М.А., Корнеев К.В., Свиряева Е.Н., Друцкая М.С., Идальго Х., Недоспасов
С.А. Получение и предварительная характеристика мышей с генетическим дефицитом IL-6 в дендритных клетках.
Иммунология. 2016; 37(6): 316-319. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-316-319
, Korneev K.V.
RECEIVING AND PRELIMINARY CHARACTERIZATION OF MICE WITH GENETIC DEFICIENCY OF IL-6
Engelhardt Institute of Molecular Biology, Russian Academy of Sciences, Moscow, 119991
hemical Biology and Department of Immunology, Biological Faculty, Lomonosov Moscow
State University, Moscow, 119992
Universitat Autònoma de Barcelona, Spain
Interleukin-6 (IL-6) is a pleiotropic immunomodulatory cytokine that exhibits crucial functions in the regulation of immune
system. However, in some cases, it may induce the development of severe disease manifestations, such as autoimmunity
and cancer. De�ning cell types that produce “bene�cial” and “deleterious” IL-6
in vivo
remains one of the main unresolved
questions in IL-6 biology. Here we describe generation of mice with selective IL-6 ablation in dendritic cells (DC). Using
these mice we found that IL-6 expressed by dendritic cells contributed to the development of IL-17A and TNF-producing
T cells upon immunization. Thus, these mice represent suitable model for further analysis of DC-derived IL-6 in
interleukin-6 (IL-6); reverse genetics; genetic knockout; dendritic cells.
For citation:
Kruglov А.А., Nosenko М.А., Korneev K.V., Sviriaeva E.N., Drutskaya M.S., Hidalgo J, Nedospasov
S.A. GENERATION AND PRELIMINARY CHARACTERIZATION OF MICE WITH GENETIC ABLATION OF IL-6 IN
For correspondence:
Nedospasov Sergei Arturovich,
Head of Laboratory of Molecular Mechanisms of Immunity, Engelhardt
Institute of Molecular Biology, E-mail:sergei.nedospasovBgooglemail.com
on�ict of interest. The authors declare no con�ict
Для корреспонденции:
Недоспасов Сергей Артурович,
зав.
лабораторией молекулярных механизмов иммунитета Института
молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН, заведующий
кафедры иммунологии биологического факультета Московского
государственного университета им. М.В. Ломоносова, E-mail:
sergei
ведение
Интерлейкин-6 (IL-6) — «отец-основатель» целого се
мейства цитокинов, которые передают сигнал через общую
рецепторную субъединицу gp130 [1, 2]. С эволюционной точ
ки зрения, очевидно, что наряду с общими,
вырожденными
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
физиологическими функциями каждый из цитокинов этого
семейства обладает и уникальными,
невырожденными,
свой
ствами. Традиционно такие уникальные функции в контексте
целого организма выявляют методами прямой или обратной
генетики. В первом случае находят мутации в гене
чело
века или животных, которые приводят к определенным фе
нотипическим изменениям, таким как иммунодефицит или
предрасположенность к каким-то заболеваниям. Во втором
случае с помощью технологий редактирования генома (гене
тический нокаут, или трансгенез) выявляют физиологические
последствия дефицита гена или его сверхэкспрессии. В этом
случае наиболее интересно создание модельных организмов
либо с дефицитом гена в конкретных видах клеток, либо с
рестриктированной сверхэкспрессией в тех же видах клеток.
Известно, что развитие эффекторного адаптивно
го Т-клеточного иммунного ответа 17-го типа (Тх17
Т-клеток), характеризуемого продукцией IL-17A, необходи
мо для эффективной борьбы с внеклеточными патогенами
[3]. Кроме того, Тх17 Т-клетки, распознающие собственные
антигены организма, могут индуцировать различные имму
нопатологии [3]. Регуляторные Т-лимфоциты представляют
собой Т-клетки, супрессирующие иммунный ответ [4]. Таким
образом, понимание механизмов дифференцировки Т-клеток
в норме и при патологиях представляет собой важную био
медицинскую проблему.
IL-6 и TGFβ — два важных цитокина, участвующих в
дифференцировке Т-клеток. Баланс между концентрациями
IL-6 и TGFβ определяет развитие как Т-регуляторных клеток,
так и Тх17-клеток [5, 6]. Однако конкретный субтип клеток,
производящий IL-6 на разных стадиях иммунного ответа,
остается не до конца определенным.
В настоящей работе нами создана линия мышей, у кото
рых IL-6 не продуцируется только
D11c-положительными
клетками. Оказалось, что IL-6, производимый дендритными
клетками, важен для генерации Тх17 Т-клеток, в то время как
другие популяции, такие как Тх1 и Т-регуляторные клетки,
не изменены.
Материал и методы
Лабораторные животные.
В работе использовали
мышей IL-6
[7] и
D11c
re [8] на генетической основе
Генотипирование.
Определение генотипа проводили
на ДНК из биопсии кончика хвоста, используя следующие
олигонуклеотидные праймеры: для типирования «флок
сированной» IL-6 аллели
gATAgT
A
и ggTAT
. Для типирования
D11-
re трансгена: A
AAg и
AT
Tg. Условия для полимеразной
цепной реакции: 95 °
3 мин — 35 циклов (95 °
1 мин — 63
1 мин — 72 °
1 мин) — 72 °
5 мин. Продукты реакции
подвергали электрофорезу на 2' агарозном геле. Генотип
определяли согласно ожидаемым продуктам реакции: для
D11c-
re — «трансгенная» полоса — 300 п. н; для IL-6 —
«флоксированной» аллели — 480 п. н., аллель дикого типа —
Мышей, достигших 8-недельного воз
раста, иммунизировали пептидом 35—55 а. о. из миелин-
олигодендритного белка, эмульсифированного в полном
адъюванте Фройнда, но с повышенной концентрацией уби
M. tuberculosis
до конечной концентрации 5 мг/мл. Им
мунизацию проводили подкожно в основание хвоста двумя
инъекциями по разные стороны хвоста суммарным объемом
100 мкл. В качестве контроля мышам дикого типа вводили
внутрибрюшинно анти-IL-6 антитела (клон: MP5—20F3;
Культуры дендритных клеток и лимфоцитов.
Ден
дритные клетки были дифференцированы из костного моз
га по следующей схеме: клетки костного мозга выделяли
из большой берцовой кости и ресуспендировали в концен
трации 1 млн/мл в среде RPMI-1640, содержащей 10' фе
тальной бычьей сыворотки, пенициллин и стрептомицин.
Клетки инкубировали в присутствии GM—
SF (20 нг/мл)
в течение 6 дней. Слабоадгезивные клетки были собраны и
окрашены на
D11c поверхностный маркер для подтверж
дения дифференцировки клеток костного мозга в дендрит
ные клетки. Анализ проводили с использованием FA
(BD Biosciences), причем доля дендритных клеток (
D11c-
положительных) превышала 80' в каждом образце. Клетки
помещали в 96 луночный планшет в количестве 100,000 на
лунку и стимулированы LPS (10 мкг/мл) в течение 24 ч. По
сле этого супернатант собирали и оценивали продукцию ци
токинов иммуноферментным анализом.
Цитометрия и сортировка клеток.
На 7-й день после
иммунизации были собраны паховые лимфоузлы. Клеточные
суспензии готовили путем продавливания органов через си
течки с размером пор 70 мкм. Затем эритроциты лизировали в
K буфере, а полученные клеточные суспензии либо сразу
брали на окрашивание, либо стимулировали для анализа про
дукции цитокинов. При стимуляции 1 млн клеток помеща
ли в 96-луночный планшет и затем стимулировали МОГ
пептидом (100 мкг/мл) в присутствии Брефельдина А (5 мкг/
мл) в течение 4 ч при 37 °
и 5'
. При окрашивании
клеток на первом этапе клетки инкубировали с антителами
против Fcγ рецепторов, а затем окрашивали на поверхност
ные маркеры с использованием следующих антител: T
D4, а также
iability Dye (Ebioscience). Для внутриклеточ
ного окрашивания клетки фиксировали и пермеабилизирова
ли с использованием Fix/Perm Kit (eBioscience). Внутрикле
точное окрашивание производили на FoxP3, IL-17A, IF
F (Ebioscience) с последующим анализом на цитометре
FA
anto (BD Bioscience), доли клеток оценивали с помо
щью программы FlowJo (TreeStar Inc).
Иммуноферментный анализ
Иммуноферментный
анализ продукции цитокинов проводили, используя киты
Mouse T
F alpha ELISA Ready-SET-Go! и Mouse IL-6 ELISA
Ready-SET-Go! (оба еBioscience) согласно рекомендациям
производителя.
Статистически значимые различия данных определяли в
программе Graphpad Prism с помощью
-критерия Манна—
Уитни, где
≤ 0,05 считали значимым.
езультаты
Создание мышей с рестриктированным дефицитом
в продукции IL-6
дендритными клетками.
Наиболее эф
фективная технология обратной генетики для анализа роли
генов в определенных типах клеток — система LoxP-
re [9].
Используя мышей с внесенными в интроны гена
мыши
сайтами рекомбинации LoxP [7] и мышей, продуцирующих
рекомбиназу
re в
D11c-положительных клетках [8], мы
создали мышей с рестриктированной делецией гена
в
дендритных клетках мыши (рис. 1,
Для получения таких мышей использовали трехэтапную
схему скрещивания: сначала мышей с генотипом IL-6
скрещивали с мышами
D11c-
re и получали потомство с
гетерозиготной конфигурацией локуса IL-6. Затем таких
мышей скрещивали между собой и отбирали мышей с гено
типом IL-6
D11c-
re, которых использовали для скре
щивания с мышами IL-6
. При такой схеме бридинга в
каждом потомстве получалось примерно одинаковое количе
ство экспериментальных мышей IL-6
D11c-
re с деле
цией гена
в дендритных клетках и контрольных мышей
T), имеющих фенотип дикого типа.
Для подтверждения эффективности удаления гена
именно в дендритных клетках их дифференцировали
in vitro
из костного мозга. Затем эти клетки стимулировали липопо
лисахаридом и определяли продукцию IL-6 в культуре (рис.
). Было показано, что дендритные клетки, выращенные
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
Рис. 1. Создание мышей с рестриктированным дефицитом в продукции IL-6 дендритными клетками.
— схема получения мышей с делецией IL-6 в дендритных клетках;
— определение генотипа мышей IL-6�ox/�ox
D11c-
re мышей с помощью ПЦР;
— продукция IL-6 и T
F дендритными клетками, дифференцированными
in vitro
из костного мозга, после стимуляции LPS (10 мкг/мл) в течение 24 ч.
Рис. 2. IL-6, производимый дендритными клетками, важен для генерации Тх17
T-клеток при иммунизации.
— доля T-регуляторных клеток (
) в паховых лимфоузлах на 7-й день после иммунизации;
— доля IF
— IL-17A;
— T
F, про
дуцирующий
D4 T-клеток в паховых лимфоузлах на 7-й день после иммунизации.
из костного мозга IL-6
D11c-
re мышей, практически
не производили IL-6, в то время как продукция T
F тех же
клеток была нормальной (рис. 1,
). Эти результаты подтвер
дили эффективную делецию гена
именно в дендритных
клетках и валидировали модельную систему для дальнейших
исследований.
Из литературных данных известно, что IL-6 — важный
фактор дифференцировки Тх17-клеток при иммунном от
вете [10]. Однако оставалось неясным, какой тип клеток,
производящих IL-6, ответственен за эту иммуномодуляцию.
Мы предположили, что IL-6, производимый дендритными
клетками, может играть роль в дифференцировке Тх17-типа
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
при иммунном ответе. Для того чтобы ответить на данный
вопрос, мы иммунизировали модельным пептидом мышей
дикого типа и мышей с делецией гена в дендритных клет
ках. В качестве контроля за день до иммунизации группе мы
шей внутрибрюшинно вводили антитела, блокирующие IL-6
Анализ Т-клеточного отдела иммунной системы в дрени
рующих паховых лимфоузлах показал, что удаление IL-6 в
дендритных клетках не влияет на долю ни Т-регуляторных
клеток, ни IF
-γ-продуцирующих эффекторных Т-клеток
(рис. 2,
). С другой стороны, IL-6, производимый ден
дритными клетками, оказался нужным для дифференцировки
Тх17 Т-клеток и T
F-продуцирующих клеток в лимфоузлах
(рис. 2,
). Таким образом, мы установили, что дендритные
клетки посредством продукции IL-6 контролируют развитие
эффекторных Т-клеток, производящих IL-17A и T
F.
Обсуждение
В настоящей работе впервые получены мыши с делеци
ей гена
в дендритных клетках. Для валидации модели
нами установлено, что
re-зависимая делеция гена
под
контролем
D11c промотора действительно приводит к
практически полной потере продукции IL-6 дендритными
клетками.
В литературе имеются сообщения, что как дендритые
клетки, так и В-лимфоциты могут предоставлять IL-6
для дифференцировки Тх-клеток [11—13]. Однако
выводы относительно дендритных клеток были сделаны в
достаточно искусственных экспериментах с адоптивным
переносом
in vitro
манипулированных клеток [12], что
допускает неоднозначную интерпретацию. В нашей работе
прямо доказано, что дендритные клетки посредством
иммуномодуляторного IL-6 регулируют продукцию
эффекторными Т-лимфоцитами цитокинов IL-17A и T
F, но
Известно, что Тх17-клетки участвуют в развитии
аутоиммунных заболеваний, таких как рассеянный склероз
[14], посредством продукции T
F [15] и GM-
SF [16].
Кроме этого, они участвуют в появлении неоплазий,
ассоциированных с воспалением [17]. В дальнейшем мы
планируем оценить вклад IL-6, производимого дендритными
клетками, в развитие аутоиммунных заболеваний, в частно
сти экспериментального аутоиммунного энцефалита, артри
та, аллергии и рака, ассоциированного с воспалением.
Благодарность:
Авторы благодарят Д.В. Купраша за
ценные советы.
Финансирование.
Работа поддержана грантом
Российского научного фонда № 14-25-00160.
Конфликт интересов.
Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
ЕРА
РА
1.
Schaper F., Rose-John S. Interleukin-6: Biology, signaling and strategies
Cytokine Growth Factor Rev.
Tanaka T.,
arazaki M., Kishimoto T. IL-6 in in�ammation,
immunity, and disease.
Cold Spring Harb. Perspect. Biol.
2014; 6:
Gaffen S.L., Jain R., Garg A.
ua D.J. The IL-23-IL-17 immune
axis: from mechanisms to therapeutic testing.
Nature Rev. Immunol.
C
haudhry A., Rudensky A.
ontrol of in�ammation by integration
of environmental cues by regulatory T cells.
J. Clin. Invest.
2013;
5.
Manel
., Unutmaz D., Littman D.R. The differentiation of human
T(H)-17 cells requires transforming growth factor-beta and induction of
Nature Immunol.
Zhou L., Lopes J.E.,
hong M.M. et al. TGF-beta-induced Foxp3
inhibits T(H)17 cell differentiation by antagonizing RORgammat
Nature.
Quintana A, Erta M, Ferrer B,
omes G, Giralt M, Hidalgo J.
Astrocyte-speci�c de�ciency of interleukin-6 and its receptor reveal
speci�c roles in survival, body weight and behavior.
Brain Behav.
C
aton M.L., Smith-Raska M.R., Reizis B.
otch-RBP-J signaling
controls the homeostasis of
D8-dendritic cells in the spleen.
J. Exp.
9. Rajewsky K., Gu H., Kuhn R. et al.
onditional gene targeting.
V
eldhoen M., Hocking R.J., Atkins
.J., Locksley R.M., Stockinger B.
TGFbeta in the context of an in�ammatory cytokine milieu supports
de novo differentiation of IL-17-producing T cells.
. 2006;
11.
Barr T.A., Shen P., Brown S. et al. B cell depletion therapy ameliorates
autoimmune disease through ablation of IL-6-producing B cells.
Leech M.D., Barr T.A., Turner D.G. et al.
utting edge: IL-6-
dependent autoimmune disease: dendritic cells as a suf�cient, but
., Schulze-Topphoff U.,
eber M.S. et al. MH
class
II-dependent B cell AP
function is required for induction of
autoimmunity independent of myelin-speci�c antibodies.
J. Exp.
., Blumenschein
.M. et al. IL-23 drives a
pathogenic T cell population that induces autoimmune in�ammation.
Kruglov A.A., Lampropoulou
., Fillatreau S.,
edospasov S.A.
Pathogenic and protective functions of T
F in neuroin�ammation
are de�ned by its expression in T lymphocytes and myeloid cells.
2011; 187(1): 5660—70.
C
odarri L., Gyulveszi G., Tosevski
. et al. RORgammat drives
production of the cytokine GM-
SF in helper T cells, which is
essential for the effector phase of autoimmune neuroin�ammation.
Nature Immunol.
2011; 12: 560—7.
Grivennikov S.I.,
ang K., Mucida D. et al. Adenoma-linked barrier
defects and microbial products drive IL-23/IL-17-mediated tumour
Nature.
Поступила 06.07.16
Принята в печать 16.08.16
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
ВТ
ОРО
Кравцов А.Л., Курылина А.Ф., Клюева С.Н., Щуковская Т.Н.
ИРУЮЩИЙ ЭФФ
СТь
СТЕ
МЫ ПРИ ФОРМИРО
ИИ ПРО
ОГО ИММУ
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Роспотребнадзора России,
410005, г. Саратов
Методом проточной цитометрии изучено влияние полиоксидония на реактивность клеток иммунной системы мы
шей BALB/c, иммунизированных различными дозами живых клеток вакцинного штамма
Yersinia pestis
EB НИИЭГ.
Применяли суправитальную окраску лейкоцитов крови и клеток брюшной полости красителем акридиновым оран
жевым для автоматического дифференцирования лимфоцитов и фагоцитов по содержанию цитоплазматических
гранул, а также для идентификации и подсчета лимфоцитов с активированным ядерным хроматином. Пролифера
тивную активность клеток определяли после окраски йодистым пропидием по их суммарному количеству на ста
диях S и G
- M клеточного цикла. Результаты учитывали в динамике иммуногенеза (на 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки).
Иммуномодулятор оказывал стимулирующий эффект на реактивность клеток иммунной системы, привитых против
чумы лабораторных животных, повышая протективную активность чумной вакцины как минимум в 2,7 раза. Это
позволяло существенно (в 5 раз) снизить антигенную нагрузку, способную защитить мышей от чумной инфекции.
Ключевые слова:
живая чумная вакцина EB; полиоксидоний; Yersinia pestis; активация хроматина и пролифе
ративная активность лимфоцитов; содержание гранул в фагоцитах; проточная цитоме
Для цитирования:
Кравцов А.Л., Курылина А.Ф., Клюева С.Н., Щуковская Т.Н. Модулирующий эффект полиокси
дония на реактивность клеток иммунной системы при формировании противочумного иммунитета. Иммунология.
Kravtsov A.L., Curylina A.F., Klyueva S.N., Shchukovskaya T.N.
THE MODULATING EFFECT OF POLYOXIDONIUM ON THE REACTIVITY OF IMMUNE CELLS IN THE
FORMATION OF ANTI-PLAGUE IMMUNITY
Federal state healthcare institution «Russian research anti-plague Institute «Microbe» of Rospotrebnadzor of Russia,
By �ow cytometry we studied the in�uence of polyoxidonium on the reactivity of the immune system cells of mice ВALB/c,
immunized with different doses of live cells of the vaccine strain Yersinia pestis EV, NIIEG. Used supravital coloration of
white blood cells and cells of the abdominal cavity dye acridine orange for the automatic differentiation of lymphocytes
and phagocytes in content of cytoplasmic granules, as well as for identi�cation and counting of lymphocytes with activated
nuclear chromatin. The proliferative activity of cells was determined after staining iodide propidium on their total number
of stages S and G2 - M cell cycle. The results were taken into account in the dynamics of immunogenesis (1st, 3rd, 7th
and 21th day). Immunomodulator have had a stimulating effect on the reactivity of cells of the immune system, vaccinated
against plague in laboratory animals, increasing protective activity plague vaccine at least in 2.7 times. This was signi�
live plague vaccine EV; polyoxidonium; Yersinia pestis; activation of chromatin and the proliferative activity
For citation:
Kravtsov A.L., Curylina A.F., Klyueva S.N., Shchukowskaya T.N. The modulating effect of polyoxidonium
on the reactivity of immune cells in the formation of anti-plague immunity.Immunologiya.2016; 37(6): 320-325. DOI:
For correspondence:
Kravtsov Alexander L.
on�ict of interest.
The authors declare no con�ict of interest.
Для корреспонденции:
Кравцов Александр Леонидович
При разработке вакцин нового поколения против бактери
альных и вирусных инфекций в последние годы все больше
внимания уделяют поиску и созданию эффективных, нетоксич
ных адъювантов, относящихся к структурам, стимулирующим
функции клеток врожденного иммунитета и повышающим
интенсивность антителообразования в ответ на различные
чужеродные антигены [1]. К таким иммуностимуляторам от
носится, в частности, синтетический полимер полиоксидоний
(ПО) [2], который рекомендован как для стимуляции механиз
мов клеточного иммунитета у вакцинированных людей [3],
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
так и для использования в качестве иммуномодулятора при
лечении пациентов с различной патологией [4].
Опубликованы экспериментальные данные, свидетель
ствующие в пользу перспективности применения ПО в ком
плексе с живой чумной вакциной. В модельных опытах по
иммунизации лабораторных животных препарат существен
но повышал иммуногенную и протективную активность дан
ной вакцины, ускоряя появление и исчезновение лимфоцитов
с рецепторами к F1
Yersinia pestis,
а также способствуя более
раннему развитию антительного ответа [5, 6]. При этом от
мечена недостаточная изученность иммуномодулирующего
эффекта ПО при противочумной вакцинации, необходимость
его дальнейшего, более детального исследования на клеточ
ном уровне.
Цель настоящей работы — оценить с помощью исполь
зования проточной цитометрии влияние ПО на реактивность
клеток иммунной системы привитых против чумы лабора
торных животных.
Материал и методы
В работе использовали иммуномодулятор ПО (НПО «Пе
троваксФарм», Россия), а также штаммы
Y. pestis
EB НИИЭГ
и 231, полученные из Государственной коллекции патоген
ных бактерий РосНИПЧИ «Микроб». Бактерии выращива
ли на агаре Хоттингера (pH 7,2) в течение 48 ч при 28
Исходную взвесь клеток вакцинного штамма EB НИИЭГ с
концентрацией 1 • 10
КОЕ готовили в забуференном физио
логическом растворе (ЗФР) и подкожно вводили инбредным
мышам линии BALB/c в двух дозах — 5 • 10
и 25 • 10
КОЕ
(в 0,2 мл ЗФР). ПО вводили подкожно в количестве 4 мкг на
мышь за 1 ч до вакцинации.
Реактивность клеток иммунной системы оценивали в ди
намике иммуногенеза (на 1-е, 3-и и 21-е сутки после вакци
нации) путем регистрации изменений относительного содер
жания лимфоцитов и фагоцитов в цельной крови и смывах
клеток брюшной полости, а также путем подсчета в неодно
родных клеточных популяциях активированных лимфоци
тов с измененным после вакцинации состоянием ядерного
хроматина. Для этого применяли цитохимический метод,
основанный на суправитальной окраске ядерного хроматина
и цитоплазматических гранул отдельных клеток красителем
акридиновым оранжевым (АО) [7], позволяющий дифферен
цировать фагоциты по повышенной интенсивности красной
флуоресценции их цитоплазмы [8, 9] и одновременно под
считывать стимулированные лимфоциты с активирован
ным ядерным хроматином, которые, появляясь в крови при
формировании у лабораторных животных приобретенного
противочумного иммунитета, обладают повышенной интен
сивностью свечения комплексов ДНК-АО в зеленой области
спектра [10, 11]. Из селезенки животных выделяли сплено
циты на 1-е, 3-и, 7-е и 21-е сутки иммуногенеза. После фик
сации спленоцитов 70' этанолом их окрашивали йодистым
пропидием для получения информации о характере распре
деления отдельных клеток суммарной неоднородной попу
ляции по клеточному циклу. Пролиферативную активность
рассчитывали из соответствующих ДНК гистограмм (рис. 1)
как суммарное относительное количество клеток, находя
щихся на стадиях синтеза ДНК, предмитоза и митоза [12].
Для цитометрии в потоке клеток, суправитально окрашен
ных красителем АО, применяли коммерческий проточный
цитофлуориметр I
Р22 PH
E (Германия) с ртутной лам
пой в качестве источника света и с 2048-канальным ампли
тудным анализатором ORTHO I
TS (
Mass, USA) модели 2102 [10, 11]. Оценку показателя проли
феративной активности спленоцитов, окрашенных йодистым
пропидием, проводили на лазерном проточном цитометре
ADP Dako
Протективную активность используемых доз живых кле
ток вакцинного штамма чумного микроба и влияние на нее
иммуномодуляции оценивали по относительному количеству
животных, выживших после летального заражения дозой 700
вирулентного штамма 231 чумного микроба, для кото
рого LD
в опытах на мышах BALB/c составляла 5 м.к.
Полученные экспериментальные данные статистически об
рабатывали по методу Стьюдента; достоверными считали отли
чия средних величин исследуемых показателей при
Рис. 1. Пример сравнительной цитофлуориметрической оценки про
лиферативной активности спленоцитов.
Представлены распределения отдельных клеток по клеточному циклу
(ДНК-гистограммы), характерные для интактных лабораторных живот
ных (
), а также полученные через сутки после иммунизации мышей до
зой 5 • 10
КОЕ
Y. pestis
EB без ПО (
) и с ПО (
). На каждой гистограмме
выделены области, соответствующие пролиферирующим (R3) и апопто
тическим (R6) спленоцитам. Цифры под гистограммами — общее число
зарегистрированных клеток в образцах (total), а также соответственно
абсолютное (count) и относительное (процент hist) число клеток в об
ластях R3 и R6.
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
езультаты
На рис. 2 представлены цитограммы, ил
люстрирующие характерные изменения по ис
следуемым клеточным показателям в крови
и брюшной полости привитых против чумы
мышей. Видно, что у мышей как у животных с
агранулоцитарным типом кроветворения в кро
ви очень мало в норме клеток врожденного им
мунитета, способных аккумулировать АО (табл.
3) в первичных (бактерицидных) гранулах (в
отличие от фагоцитов крови людей и морских
свинок [13]). Кроме того, в крови интактных
мышей фактически отсутствовали лимфоциты
с функционально активированным ядерным
хроматином, обладающие повышенной интен
сивностью зеленой флуоресценции (A1). Такие
клетки, однако, стабильно появлялись уже на
ранней стадии иммуногенеза в периферической
крови мышей после противочумной вакцинации
(B1). В смывах из брюшной полости интактных
животных имелись клетки с более высоким со
держанием бактерицидных гранул (резидент
ные макрофаги в количестве около 20'), а
также была выше доля клеток (лимфоцитов) с
функционально активированным генетическим
аппаратом (A2). После введения в организм
живых чумных микробов клеточный состав в
брюшной полости животных существенно из
менялся (B2): усиливались процессы метаболизма в клет
ках, связанные с активацией их генетического аппарата, а
также возрастала доля клеток врожденного иммунитета, ак
кумулирующих АО в гранулах, где локализованы ключевые
бактерицидные ферментные катионные белки: эластаза, ка
тепсин G, протеаза 3 и миелопероксидаза [13].
Интенсивность реакции клеток иммунофагоцитарной си
Таблица 1
лияние полиоксидония (ПО) на динамику реактивности
фагоцитов крови и брюшной полости привитых против чумы
животных
Группа животных,
Исследуемый
материал
Сутки после
вакцинации
Количество фагоцитов, аккуму
лирующих АО в гранулах, '
КОЕ
КОЕ
(вакцина - ПО),
Контрольная
(вакцина - ЗФР),
(вакцина - ПО),
Контрольная (вак
Примечание. * — достоверные различия с контролем; ЛК —
лейкоциты крови; КБП — клетки в смывах из брюшной полости;
Фагоциты учитывали на гистограммах как клетки с повышенной
красной флуоресценцией цитоплазмы — более 100 у. е. (каналов)
при 512 каналах для входного сигнала и напряжении 700 В на фото
умножителе.
Таблица 2
лияние полиоксидония на протективный эффект исследуемых доз клеток
живой чумной вакцины и динамику реактивности ядерного хроматина кле
ток иммунной системы в процессе иммуногенеза
Группа
животных
Доля заражен
ных животных,
выживших после
вакцинации, '
дуемый
материал
Сутки
после
вакци
Доля клеток с акти
вированным ядерным
хроматином, '
Доза (КОЕ):
(вакцина - ПО)
Контрольная
(вакцина - ЗФР)
Рис. 2. Реакция лейкоцитов крови и клеток брюшной полости мы
шей BALB/c на противочумную вакцинацию.
На каждой цитограмме по оси абсцисс — относительное содержание на
клетку цитоплазматических гранул в условных единицах интенсивности
красной флуоресценции молекул красителя АО (каналах от 0 до 32), а по
оси ординат — состояние ядерного хроматина клеток иммунной систе
мы в у. е. интенсивности зеленой флуоресценции комплексов АО-ДНК
(каналах от 0 до 32). Представлен результат сравнительного анализа в
норме лейкоцитов крови (A1) и клеток (лимфоцитов и резидентных ма
крофагов), присутствующих в смывах из брюшной полости лаборатор
ных животных (A2). Цитограммы B1 и B2 — соответственно результаты
анализа лейкоцитов крови и клеток перитонеального лаважа через сутки
после иммунизации животных дозой 5 • 10
КОЕ
. pestis EB. Видно,
что после вакцинации в крови и брюшной полости животных в боль
шом количестве появляются как активированные (пролиферирующие)
лимфоциты с активированным хроматином, так и клетки врожденного
иммунитета (фагоциты) с измененным (активированным) состоянием
лизосомального аппарата.
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
стемы зависела от дозы вакцины и от срока, прошедшего с
момента прививки.
Регистрируемая проточным цитометром клеточная реак
ция усиливалась на ранней стадии иммуногенеза, если перед
вакцинацией лабораторным животным вводили иммуномо
дулятор (табл. 1 и 2). Через сутки ПО вызывал снижение
доли фагоцитов с высоким содержанием бактерицидных гра
нул в брюшной полости при соответствующем увеличении
данного показателя в периферической крови (см. табл. 3). В
случае, когда иммуномодулятор вводили перед вакцинацией
мышей живыми клетками штамма EB чумного микроба, он
усиливал миграцию фагоцитов в кровяное русло на началь
ной стадии иммуногенеза (на 1-е и 3-и сутки) и, наоборот,
ограничивал ее через 3 нед после иммунизации. В крови
иммуномодулирующий эффект ПО был в большей степени
выражен при низкой дозе вакцины. В смывах из брюшной
полости через сутки после иммунизации доля фагоцитов по
вышалась вдвое, и ПО усиливал эту ответную реакцию. К
21-м суткам иммуногенеза стимулирующий эффект ПО на
клетки врожденного иммунитета сохранялся только при низ
кой дозе вакцины. Для повышенной дозы в этот срок был ха
рактерен обратный эффект (см. табл. 1).
При низкой дозе живой чумной вакцины ПО повышал ее
протективную активность в 4 раза. Это сочеталось со способ
ностью иммуномодулятора стимулировать функциональную
активацию ядерного хроматина клеток иммунной системы в
брюшной полости на 1-е и 3-и, а в крови на 3-и и 21-е сут
ки иммуногенеза. При повышенной иммунизирующей дозе
способность ПО усиливать протективный эффект противо
чумной вакцинации была в меньшей степени выражена (в 2,7
раза) и на клеточном уровне достоверные стимулирующие
сдвиги в состоянии ядерного хроматина лейкоцитов под вли
янием иммуномодулятора были зарегистрированы в данном
случае только в периферической крови (см. табл. 2).
В селезенке привитых против чумы мышей ПО при обе
их исследуемых дозах вакцины стимулировал в ранние сро
ки иммуногенеза пролиферативную активность спленоцитов
(табл. 4), в основном за счет клеток на стадии синтеза ДНК
(S), как свидетельствуют ДНК-гистограммы, представлен
Обсуждение
однократной
противочумной вакцинации
часто
мируется недостаточно напряженный и/или непродолжитель
ный приобретенный иммунитет, что объясняют неспособно
стью специфических антигенов возбудителя чумы адекватно
активировать на ранней стадии иммунологической пере
стройки клетки врожденного иммунитета организма хозяина
[14]. Оценивать функциональную активность фагоцитов при
бактериальных инфекциях можно различными методами, и
один из них основан на использовании проточной цитоф
луориметрии для регистрации уровня аккумуляции молекул
красителя АО в первичных (азурофильных) гранулах клеток
врожденного иммунитета [8, 9], где локализованы нейтраль
ные сериновые лейкоцитарные протеазы, осуществляющие
киллинг патогенных бактерий и расщепление их факторов
вирулентности [15—17], а также регулирующие активность
цитокинов, экспрессию рецепторов на поверхности клеток
иммунофагоцитарной системы и интенсивность антителоо
бразования в ответ на бактериальные антигены [18].
Ранее в опытах с системой изогенных штаммов, служа
щих производными вакцинного штамма EB чумного микро
ба и различающихся от исходного штамма по плазмидному
составу, антигенным свойствам и уровню протективности
для лабораторных животных, мы установили, что защиту от
подкожного заражения высоковирулентным штаммом чум
ного микроба обеспечивает вакцинация только теми штам
мами, включая исходный вакцинный штамм
Y. pestis
EB НИ
ИЭГ, которые имеют одновременно две плазмиды —
. При иммунизации живыми клетками таких штаммов
в их крови появлялись лимфоциты с активированным ядер
ным хроматином, обладающие повышенной интенсивно
стью зеленой флуоресценции комплексов АО—ДНК. При
чем реактивность ядерного хроматина лимфоцитов на 3-и
и 21-е сутки зависела от реактивности цитоплазматических
гранул фагоцитов на 1-е сутки иммуногенеза [19]. Резуль
таты, говорящие о существовании зависимости между про
тективной активностью чумной вакцины и ее способностью
активировать в процессе иммуногенеза ядерный хроматин
иммунокомпетентных клеток, мы также получили методом
проточной цитофлуориметрии в опытах на мышах, приви
тых различными препаратами капсульного антигена чумного
микроба [11].
Зарубежные исследователи, применив проточную цитоф
луориметрию для иммунофенотипирования иммунокомпе
тентных клеток у мышей, иммунизированных живой чумной
вакциной, установили факт резкого повышения в крови и
органах таких животных относительного количества активи
Таблица 3
лияние полиоксидония на динамику реактивности фагоцитов
и ядерного хроматина клеток иммунной системы в отсутствие
Группа
животных,
исследуемый
материал
Сутки
после
введения
Доля фагоцитов,
аккумулирующих в
цитоплазматических
гранулах АО, '
Доля клеток с
активированным
ядерным хромати
ном, '
Контроль
Контроль
11,5 ± 1,3
Таблица 4
Эффект, производимый полиоксидонием на динамику проли
феративной активности спленоцитов привитых против чумы
животных
Группа живот
Сутки
после
Доля спленоцитов (в ') на стадиях
S - G2 - M клеточного цикла в за
висимости от дозы вакцины
КОЕ
КОЕ
Опытная (вакци
Контрольная
(вакцина - ЗФР)
Контрольная без
вакцинации
Примечание. * — достоверные различия с показателем у ин
тактных животных; ** — достоверный эффект ПО при вакцинации.
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
рованных
Т-лимфоцитов хелперов и цитотоксических
Т-лимфоцитов, а также выявили зависимость протек
тивного эффекта вакцинации от степени выраженности та
кой клеточной реакции [20].
Важно, что информация, полученная с помощью дорого
стоящих препаратов меченых моноклональных антител (
маркеров), согласуется с результатами наших цитофлуориме
трических исследований, в которых относительно недорогой
краситель АО позволял оценивать в процессе формирования
противочумного иммунитета реактивность не только лимфо
цитов, но и фагоцитов. Более того, в наших исследованиях
использовали образцы цельной крови без предварительного
лизиса в них эритроцитов. Это полностью исключало какие-
либо клеточные потери и сдвиги в функциональном состоя
нии клеточных элементов, связанные с процедурами их вы
Изменение регистрируемых в данной работе цитофлуо
риметрических показателей в состоянии также объяснить
опубликованные в отечественной печати результаты свето
вой и люминесцентной микроскопии. Так, в работах Л.С.
Назаровой и соавт. [21, 22] сообщается о значительном по
вышении функциональной активности тимоцитов мышей
в начальные сроки иммуногенеза при чуме и о появлении
в периферической крови субпопуляций Т-клеток с иными,
чем у интактных животных, свойствами. Активированные
Т-клетки обладали повышенной пролиферативной активно
стью, аккумулировали в ядрах и цитоплазме большее количе
ство молекул красителя АО и оказывали прямое цитотокси
ческое воздействие на вирулентные чумные микробы. Кроме
того, после иммунизации мышей живой чумной вакциной в
брюшной полости этих животных в течение недели отмеча
ли резкое повышение относительного количества макрофа
гов. Функционально активированные клетки, относящиеся к
системе мононуклеарных фагоцитов, в большом количестве
появлялись на ранней стадии иммуногенеза и в перифери
ческой крови. По данным А.К. Киселевой и Г.И. Васильевой
[23], активированные перитонеальные макрофаги привитых
против чумы лабораторных животных имели функциональ
но измененное состояние лизосомального аппарата, которое
оценивалось в мазках визуально и с помощью люминесцент
ного микроскопа с фотометрической насадкой по уровню
аккумуляции в цитоплазматических гранулах отдельных кле
ток молекул красителя АО.
Заключение
Результаты настоящей работы свидетельствуют, что ПО
оказывает модулирующее воздействие на реактивность кле
ток иммунофагоцитарной системы привитых против чумы
лабораторных животных, повышая протективную актив
ность живой чумной вакцины как минимум в 2,7 раза. Они
подтверждают перспективность практического применения
ПО как средства повышения эффективности противочумной
вакцинации.
Основной вывод исследований заключается в том, что за
счет введения ПО можно в 5 раз снизить дозу чумной вак
цины без потери в уровне реактивности клеток иммунной
системы и эффективности защиты организма от чумной ин
Финансирование.
Исследование не имело спонсорской
поддержки.
Конфликт интересов.
Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
ЕРА
РА
Петров Р.В., Хаитов Р.М.
Иммуногены и вакцины нового поколе
. М.: ГЭОТАР-Медиа; 2011.
Хаитов Р.М., Пинегин Б.В. Полиоксидоний: новые аспекты при
Новые лекарства.
Костиков М.П., Ерофеева М.К., Харит С.М. Эффективность и
безопасность вакцинопрофилактики гриппа у разных контин
гентов.
Terra medica.
2011; (2): 7—12.
Пинегин Б.В., Некрасов А.В., Хаитов Р.М. Иммуномодулятор
полиоксидоний: механизмы действия и аспекты клинического
Цитокины и воспаление
Пономарева Т.С., Дерябин П.Н., Каральник Б.В., Тугамбаев Т.И.,
Атшабар Б.Б., Денисова Т.Г. и др. Влияние полиоксидония на
иммуногенную и протективную активность живой чумной вак
Иммунология.
Каральник Б.В., Пономарева Т.С., Дерябин П.Н., Денисова Т.Г.,
Мельникова Н.Н., Тугамбаев Т.И. и др. Влияние иммуномодуля
ции на иммуногенную и протективную активность живой чум
ной вакцины.
Журн. микробиол.
Кравцов А.Л., Наумов А.В., Коровкин С.А., Адамова Г.В., Шве
дун Г.П., Ледванов М.Ю. и др. Использование двухцветной
цитофлуориметрии в потоке для быстрого обнаружения и ко
личественной оценки изменений функциональной активности
лейкоцитов в процессе иммуногенеза при чуме. В кн.:
биология, биохимия и специфическая профилактика карантин
. Саратов; 1990: 66—74.
11.
Киреев М.Н., Кравцов А.Л., Тараненко Т.М., Храмченкова Т.А.,
Клюева С.Н., Гусева Н.П., Шмелькова Т.П. Сравнительная оценка
методом проточной цитофлуориметрии степени активации кле
ток иммунофагоцитарной системы у мышей, иммунизированных
различными препаратами капсульного антигена чумного микро
Проблемы особо опасных
Хайдуков С.В., Зурочка А.В. (ред.)
Вопросы современной про
точной цитометрии. Клиническое применение.
Челябинск;
Кравцов А.Л. Проточно-цитофлуориметрическое исследование
бактерицидных гранул в фагоцитах крови животных с различ
ной видовой чувствительностью к экспериментальному зараже
нию чумой.
Журн. микробиол.
19.
Кравцов А.Л., Шведун Г.П., Ледванов М.Ю. О действии продуктов
плазмид
Y. pestis
на лейкоциты крови морских свинок в процессе
иммуногенеза при чуме по данным цитофлуориметрического ана
Проблемы особо опасных инфекций
Назарова Л.С., Исупов И.В., Суриков Н.Н., Павлова Л.П., Та
раненко Т.М., Сероглазов В.В. и др. Исследование некоторых
функциональных характеристик тимоцитов мышей в процессе
иммуногенеза при чуме
В кн.:
Профилактика особо опасных
. Саратов; 1988: 13—22.
Назарова Л.С., Пионтковский С.А., Исупов И.В., Суриков Н.Н.,
Голубева И.И. Экспериментальное изучение некоторых видов
клеток с литическим потенциалом на начальных этапах про
тивочумного иммунитета. В кн.:
Микробиология, биохимия и
специфическая профилактика карантинных инфекций
. Саратов;
Киселева А.К., Васильева Г.И. Влияние иммунизации живой
чумной вакциной на количество лизосом в органоспецифиче
ских макрофагах.
Цитология
Petrov R.
., Khaitov R.M.
Immunogene and Vaccines of New
. Moscow: GEOTAR-Media; 2011. (in Russian)
Khaitov R.M., Pinegin B.
. Polioxidonium: new aspects of
Kostikov M.P., Erofeeva M.K., Kharit R.M. The ef�ciency and safety
of the in�uenza vaccine among different contingents.
Terra medica
2011; (2): 7—12. (in Russian)
Pinegin B.
ekrasov A.
., Khaitov R.M. Immunomodulator
polyoxidonium: mechanisms of action and aspects of clinical
Tsitokiny i vospalenie
Ponomareva T.S., Deryabin P.
., Karal
nik B.
., Tugambaev T.I.,
Atshabar B.B., Denisova T.G. et al. The impact of polioxidonium
on immunogenic and protective activity of alive plague vaccine.
Karal’nik B.
., Ponomareva T.S., Deryabin P.
., Denisova T.G.,
., Tugambaev T.I. The impact of immunomodulation
on immunogenic and protective activity of alive plague.
mikrobiol.
Melamed M.R., Adams L.R., Traganos F., Kamentsky L.A. Blood
granulocyte staining with acridine orange changes with infections.
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
Traganos F., Darzynkiewicz Z. Lysosomal proton pump activity:
supravital cell staining with acridine orange differentiates leukocyte
Rothe G., Kellermann
alet G. Flow cytometric parameters of
neutrophil function as early indicators of sepsis or trauma-related
pulmonary or cardiovascular organ failure.
J. Lab. Clin. Med.
115(1): 52—61.
Kravtsov A.L.,
aumov A.
., Korovkin S.A., Adamova G.
., Shve
dun G.P., Ledvanov M. et al. The use of two-color �ow cytometry for
the rapid detection and quanti�cation of functional leukocyte activ
ity changes during immunogenesis in plague. In: [
Mikrobiologiya,
biokhimiya i spetsi�cheskaya pro�laktika karantinnykh infektsiy].
11.
Kireev M.
., Kravtsov A.L., Taranenko T.M., Khramchenkova T.A.,
Klyueva S.
., Guseva
.P., Shmel
kova T.P.
omparative assess
ment by �ow cytometry of immunophagocytic system cell activation
degree in mice immunized with the different
Yersinia pestis
lar antigen preparations.
Problemy osobo opasnykh infektsiy.
Khaydukov S.
., Zurochka A.
. (ed.)
Questions of Modern Flow Cy
tometry. Clinical Application.
Kravtsov A.L. Flow cyto�uorometric assay of phagocyte bactericidal
granules in blood of animals with different species sensitivity to ex
Zhurn. mikrobiol.
Skowera A., de Jong E., Schuitemaker J., Allen J.S.,
esselly S.
Grif�ths G. et al. Analysis of anthrax and plague biowarfare vaccine
interactions with human monocyte-derived dendritic cells.
J. Immu
Houghton A.M., Hartrel
.O., Robbins
., Gomis-Rьth
.G., Sha
piro S.D. Macrophage elastase kills bacteria within murine mac
Nature
., Reichard U., Goosmann
., Fauler B., Uhltmann
eiss D.S. et al.
eutrophil extracellular traps kill bacteria.
W
., Drujan D., Shapiro S.D.,
eiss J., Zychlinsky A.
trophil elastase targets virulence factors of enterobacteria.
Nature
.T.
eutrophil serine proteases �ne-tune the in�ammatory
Kravtsov A.L., Shvedun G.P., Ledvanov M. About the effect of the
Y. pestis
plasmid products on the guinea pig blood leukocytes during
immunogenesis in plague according to �ow cytometric analysis.
Prob
lemy osobo opasnykh infektsiy.
Philipovskiy A., Smiley S.
accination with live
Yersinia pestis
D4 and
D8 T cells that synergistically protect against le
thal pulmonary
Y. pestis
infection.
. 2007; 75(2):
N
azarova L.S., Isupov I.
., Surikov
., Pavlova L.P., Taranenko
T.M., Seroglazov
. et al. A study of certain functional characteris
tics of mice thymocytes during plague immunogenesis. In:
[Pro�lak
osobo opasnykh infektsi]y.
Saratov, 1988: 13—22. (in Russian)
N
azarova L.S., Piontkovskiy S.A., Isupov I.
., Surikov
., Gol
ubeva I.I. Experimental study of certain types of cells with lytic po
tential in the initial stages anti-immunity. In:
[Mikrobiologiya, biokh
imiya i spetsi�cheskaya pro�laktika karantinnykh infektsiy].
Saratov,
Kiseleva A.K.,
eva G.I. Effect of immunization by live plague
vaccine on the number of lysosomes in organspeci�c macrophages.
Tsitologiya
Поступила 13.06.16
Принята в печать 16.08.16
ЭКСПЕРИМЕНТАЛьНАЯ И КЛИНИЧЕСКАЯ АЛЛЕРГОЛОГИЯ
ВТ
ОРО
Шершакова Н.Н., Барабошкина Е.Н., Андреев С.М., Шабанова Д.Д., Смирнов В.В.,
Камышников О.Ю., Хаитов М.Р.
ТСТВ
СТ
РОЙ
СТ
ОГО РА
СТВ
ОРА ФУ
ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, г. Москва
Фуллерен C
— один из самых мощных нейтрализаторов активных форм кислорода и свободных радикалов, что
связано с его высоким сродством к электрону. Именно это свойство делает его привлекательным веществом для
изготовления лекарственных препаратов с целью лечения острых и хронических заболеваний. Однако вопрос его
токсикологии требует детальных исследований. В частности, он связан с методами получения водных растворов
, которые непосредственно влияют на агрегатное состояние наночастиц, их размер и химию поверхности. Не
давно мы разработали новый диализный метод получения водного раствора фуллерена C
(dnC
) без использо
вания токсических компонентов, потенциально пригодный для биомедицинского применения. В настоящем иссле
довании изучены токсические эффекты dnC
в мышиной модели в зависимости от дозы и способов его введения
(внутрибрюшинный, интрагастральный и внутривенный). Показано, что dnC
токсическим эффектом не обладает
при любом способе введения. При использовании же небольших доз у мышей наблюдали более активный набор
веса по сравнению с контрольной группой. Гистологический анализ не выявил каких-либо патологических измене
ний внутренних органов, характерных для токсического поражения.
Ключевые слова:
фуллерен C
; острая токсичность; мыши.
Для цитирования:
Шершакова Н.Н., Барабошкина Е.Н., Андреев С.М., Шабанова Д.Д., Смирнов В.В., Камышников
О.Ю., Хаитов М.Р. Отсутствие острой токсичности у водного раствора фуллерена С
. Иммунология. 2016; 37(6):
N., Andreev S
V., Kamishnikov O. Yu., Khaitov M
FULLERENE C60 AQUEOUS SOLUTION DOES NOT SHOW ACUTE TOXICITY
Institute of Immunology FMBA, 115478, Moscow
Для корреспонденции:
Шершакова Надежда Николаевна
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
Fullerene C60 is one of the most potent neutralizers of reactive oxygen species and free radicals, due to the high electron
af�nity. This property makes it an attractive agent for medicines, for example, for the treatment of acute and chronic dis
eases. However, the question of its toxicology requires detailed research. In particular, it relates to methods for preparing
aqueous solutions of C
, which directly affect the aggregation state of nanoparticles, their size and surface chemistry. Re
cently, we have developed a new approach to obtain a water-soluble form of C
without the use of aggressive conditions
based on dialysis principle (dnC60), potentially useful for biomedical applications. In the present study, we explored the
toxic effects of dnC60 in mouse model depending on the dose and administration routes (intraperitoneal, intragastrical and
intravenous). It was shown that the dnC60 had no toxic effects by any route of administration. Furthermore, we observed
more active weight gain of mice when small doses of dnC60 were administrated compared with the control group. Histo
fullerene of C60; acute toxicity; mice.
For citation:
Шершакова Н.Н., Барабошкина Е.Н., Андреев С.М., Шабанова Д.Д., Смирнов В.В., Камышников О.Ю.,
Хаитов М.Р. Отсутствие острой токсичности у водного раствора фуллерена С
For correspondence:
on�ict of interest.
The authors declare no con�ict of interest.
«Research and development on priority directions of development of scienti�c-technological complex
of Russia for 2014—2020» (agreement No. 14.604.21.0059 of June 27, 2014,
a unique identi�er of applied research (project) RFMEFI60414X0059).
ведение
Стремительное развитие технологии наноструктуриро
ванных материалов и масштабирование их производства
приводит к тому, что человек, животные и другие биологи
ческие объекты оказываются с ними в тесном контакте. По
этому очень важна оценка потенциальных рисков при про
никновении данных веществ в организм. По классификации
наноматериалов к основным их типам относят углеродные
структуры: фуллерены, нанотрубки, графен, наноалмазы и
др. Их в настоящее время активно используют в научных и
технологических целях. Открытие в 1990 г. простого эффек
тивного способа препаративного синтеза фуллерена
[1]
послужило толчком к лавинообразному росту исследований
его биологической активности и синтеза многочисленных
производных, многие из которых показывали антивирус
ную, антибактериальную, нейропротекторную, противовос
палительную и противоопухолевую активность. Сам по себе
фуллерен нерастворим в водных средах, и основные пути
повышения его гидрофильности связаны с его функциона
лизацией путем присоединения гидрофильных аддендов
или формированием коллоидных растворов. В водных сре
дах всегда происходит агрегация (кластерообразование)
гидрофобных фуллереновых молекул, а стабилизация фор
мируемых кластеров осуществляется за счет приобретения
поверхностного отрицательного заряда. Ковалентно модифи
цированный фуллерен, по сути, уже не остается собственно
фуллереном, и данные по токсичности его производных не
корректно применять к немодифицированному фуллерену.
Последнее замечание связано с тем, что в литературе часто
обобщают понятия «фуллерен» и «функционализированный
фуллерен», хотя это разные вещества. Более того, введение
функциональных групп может нивелировать специфическую
электроноакцепторную активность фуллерена и таким обра
зом резко изменить его характерные свойства и взаимодей
ствие с биологической системой.
Несмотря на то что фуллерен
используют уже более 20
лет, ни в одной из стран мира он не был изучен на безопасность
в полном объеме. В то же время имеется масса публикаций, свя
занных с анализом отдельных биологических эффектов фулле
рена и его производных в экспериментах
in vitro
и
in vivo
, из
большинства которых следует, что серьезных токсических эф
фектов у немодифицированного фуллерена
обнаружено не
было. Первые работы по исследованию токсичности фуллерена
появились уже в 1995—1996 гг. [2, 3]. Было показано, что при
введении мышам фуллерена в дозе 2,5 г/кг он не вызывал гибе
ли мышей и побочных эффектов у животных при наблюдении
в течение 8 нед. Отмечали, что при внесении фуллерена в сре
ду с культурой человеческих кератиноцитов или фибробластов
наблюдают его довольно быстрое поглощение при отсутствии
влияния на пролиферацию. В то же время имеется достаточно
много противоречивых данных по токсикологии, которые слож
но унифицировать из-за разнообразия использованных препара
тов
и примененных методов анализа. В 2004 г. неожиданно
обнаружили токсическое воздействие водных наносуспензий
фуллерена
на дафний и на мальков большеротого окуня,
которое проявлялось в форме окислительного стресса [4]. Од
нако позже выяснилось, что саму суспензию готовили с приме
нением органического растворителя тетрагидрофурана (ТГФ),
который захватывал фуллерен, и токсичность препарата была
связана именно с ТГФ [5—7].
Введение внутрибрюшинно мышам суспензии фуллерена
в дозе 100 мг/кг не влияло на их поведенческие реакции (тест
Irwin) по сравнению с контролем [8]. При изучении острой
пероральной токсичности на крысах для смеси фуллеренов
и
(фуллерит) в дозе 2000 мг/кг за весь период наблю
дения также не выявлено никаких отрицательных эффектов
[9]. Воздействие фуллерена на кожу изучали на мышах, вводя
образец внутрикожно в дозе 200 мг/кг. Через 72 ч не было вы
явлено никакого влияния ни на синтез ДНК, ни на индукцию
орнитиндекарбоксилазы в эпидермисе. После подкожного
введения образца фуллерена в дозе 100 мг/кг в течение 24 нед
развитие опухолей (в отличие от группы мышей, которым
вводили тетрадеканоилфорболацетат) не наблюдалось [10].
Цель данной работы — изучение острой токсичности во
дного раствора (дисперсии) фуллерена
(dn
), изготов
ленного недавно разработанным диализным методом, по
зволяющим получать с высоким выходом водные растворы
фуллерена в очень мягких условиях, без использования ток
сичных ароматических растворителей и ультразвука [11].
Материал и методы
Экспериментальные животные
В работе использова
ли самок мышей линии BALB/c весом 18—20 г., в возрас
те 8—10 нед, из питомника ГУНЦБМТ РАМН. Токсические
свойства dn
изучали путем введения препарата внутри
венно (в/в), внутрибрюшинно (в/б) и интрагастрально (и/г).
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
Получение dnC
Водный раствор фуллерена, dn
, был
получен диализным методом, как описано ранее [28]. Этот
метод обеспечивает почти количественный выход фуллерена
из кристаллического состояния в раствор, при этом гидро
динамический размер частиц, определенный методом динами
ческого светорассеяния, составляет 80—100 нм. Его УФ-Вид
спектр поглощения показывает характерные максимумы при
220, 265, 344 и слабую полосу с центром 450 нм. Полученный
можно стерилизовать, что становится важным пунктом
при проведении биомедицинских исследований. В настоящей
работе максимальная концентрация
составляла 320 мкг/мл.
Дозы рассчитывали с учетом весового содержания
, опреде
ленного по оптической плотности при 340 нм (коэффициент
молярной экстинкции ε
Изучение острой токсичности dnC
. Острую токсич
ность изучали путем в/в, в/б и и/г введений препарата в раз
Изучали токсические свойства dn
при в/в введении по
следующей схеме. Мышей разделили на 5 групп по 6 особей в
каждой. Первой — четвертой группам фуллерен
вводили
в дозах 2, 8, 40 и 200 мкг соответственно, в объеме 200 мкл.
Пятая группа служила контрольной, в ней мыши получали
фосфатно-солевой буфер (ФСБ) в том же объеме. Наблюде
ние за поведением животных и оценку их веса проводили в
течение 7 дней после введения препарата.
В эксперименте по изучению токсичности dn
при в/б
введении мышей разделили на 9 групп по 6 особей в каждой.
Мышам вводили препарат в расчете на фуллерен в дозах 40,
80, 160, 200, 320, 500, 1000 и 2700 мкг (1—8-я группы со
ответственно) в объеме 500 мкл. Раствор, содержащий 500
мкг фуллерена и более, представлял собой суспензию с види
мыми частицами препарата. Животные 9-й группы получали
ФСБ. Наблюдение за поведением животных и оценку их веса
проводили в течение 7 дней после введения фуллерена
Для изучения токсического эффекта при и/г введении
препарат был взят в дозе 1 мг в объеме 300 мкл, содержащей
как растворимую форму
, так и нерастворимые частицы
. Контрольным животным вводили воду в том же объеме.
После введения в течение 16 сут проводили наблюдение за
животными, которое включало в себя ежедневный клиниче
ский осмотр, динамическое измерение массы тела. Проце
дура клинического осмотра состояла из внешнего осмотра и
оценки состояния кожного покрова, полости носа и наружно
го слухового прохода, состояния перианальной, периораль
ной и периорбитальной областей. Оценивали также наличие
и характер дефекации и мочеиспускания. Через 16 сут от
момента введения суспензии фуллерена проводили наркоти
зирование мышей в
-камере с последующим обескровли
ванием через вскрытие грудной полости и рассечение аорты.
Процедура некропсии была проведена с каждым животным,
при этом отмечали состояние внутренних полостей тела и
органов, а также забирали кусочки органов и тканей на ги
стологическое исследование. Для контроля наличия фулле
в крови через час после и/г введения у мышей брали
кровь на анализ. Затем для гистологического исследования
извлекали желудочно-кишечный тракт, печень, поджелудоч
ную железу, почки, матку, яичники.
Некропсия и гистологическое исследование.
Через 14
сут от момента введения суспензии фуллеренов проводили
наркотизирование мышей в
-камере с последующим обе
скровливанием через вскрытие грудной полости и рассечение
аорты. Процедура некропсии была проведена с каждым жи
вотным, при этом отмечали состояние внутренних полостей
тела и органов, а также забирали кусочки органов и тканей на
гистологическое исследование.
Образцы органов фиксировали в 10' буферным раствором
формалина (pH 6,8—7,2). Обезвоживание, проводку образцов
и пропитывание парафином производили в гистопроцессо
ре автоматического типа SLEE MAI
Z (Германия), заливку
в парафин — с использованием заливочной станции SLEE
MAI
Z (Германия). Микротомирование парафиновых блоков
для получения срезов толщиной 4 мкм осуществляли с помо
щью автоматизированного ротационного микротома Finesse
E- (Финляндия), окрашенные по общепринятой методике ге
матоксилином и эозином гистологические срезы заключали
в монтирующую среду под покровные стекла для получения
постоянных микропрепаратов. Микроскопический анализ ги
стологических препаратов кожи мышей разных групп прово
дили на микроскопе Leica DM2000 (Германия).
Статистический анализ.
При сравнении групп резуль
таты статистически обрабатывали с использованием про
граммы Statistica 8.0 (Stat Soft Inc., США), причем статисти
ческую значимость устанавливали с помощью
Стьюдента. Значения
≤ 0,05 принимали как статистически
значимые.
езультаты и обсуждение
Оценка изменения массы тела и поведения мышей
Токсическое действие препарата
изучено при однократ
ном в/в, в/б и и/г введении. В течение 7 дней после его вве
дения проводили мониторинг массы тела и поведенческих
реакций мышей.
После однократного в/в введения различных доз препара
та падежа мышей зафиксировано не было. Кроме того, за все
время наблюдения никаких изменений в поведении мышей
не выявлено.
Потери массы тела у мышей после введения фуллерена
в целом не наблюдается. Однако при дозе 200 мкг проис
ходит недостоверная потеря массы примерно на 1,5', что со
ставляет около 0,3 г. Такое изменение массы, на наш взгляд,
находится в допустимом диапазоне неспецифических коле
баний. Например, на 4—6-й дни наблюдений у животных
контрольной группы отмечено подобное неспецифическое
колебание массы тела. При введении небольших доз фулле
рена (2 и 40 мкг) наблюдают тенденцию к лучшему набору
массы тела у мышей.
Таким образом, при в/в введении фуллерена токсических
проявлений и изменения поведения животных выявлено не
было. Потери массы тела у мышей тоже не наблюдали.
Затем было изучено токсическое действие различных доз
при введении в/б. Показано, что однократное в/б вве
дение не приводит к падежу животных, а также не влияет на
поведенческие реакции мышей в течение 7 дней наблюдения.
Введение больших доз фуллерена
(500; 1000 и 2700 мкг)
приводит к достоверному снижению массы тела животных.
Важно, что уже на 6-й день наблюдений разница в весе опыт
ных и контрольных животных перестает быть достоверной.
На 7-й день мониторинга масса животных, получавших 500
мкг фуллерена
и не получавших препарат, выравнивается.
При введении небольших доз фуллерена
(до 500 мкг) до
стоверной разницы между массой тела опытных и контроль
ных животных выявлено не было. Однако после 5-го дня
наблюдений отмечено достоверное увеличение массы тела
животных, получивших 80 мкг фуллерена
Для изучения токсического эффекта dn
при и/г введе
нии препарат вводили в дозе 1000 мкг. Показано, что при од
нократном введении и/г фуллерена
гибели животных не
происходило. Поведенческие реакции у животных контроль
ной и опытной групп не отличались. В процессе внешнего
клинического осмотра не обнаружено никаких патологиче
ских изменений шерсти и кожи мышей, не наблюдали про
цессы экссудации, кровоизлияний, пролиферативные про
цессы; дефекация и мочеиспускание были регулярными и без
патологических особенностей, кал и моча обычного цвета.
Через час после введения фуллерена
у мышей была взя
та кровь на анализ содержания в ней введенного препарата.
Анализ показал, что содержание фуллерена
в крови со
ставляло более 100 нг/мл.
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
Средняя масса тела мышей в опытной группе статисти
чески не отличалась от средней массы в контрольной груп
пе. Ни у одного животного не выявили снижения массы тела
относительно исходных значений. Кроме того, набор тела у
животных, получивших фуллерен
происходил несколь
ко лучше, чем в контрольной группе. На 9-й и 12-й дни на
блюдений разница становилась даже достоверной. Однако в
целом введение фуллерена
не повлияло на набор живот
ными массы тела.
Таким образом, по совокупности полученных данных по
изменению массы тела мышей и их поведения при однократ
ном введении фуллерена
можно сделать вывод о том, что
независимо от пути введения препарат не обладает токсиче
ским эффектом.
Гистологический анализ
Проведение некропсии показа
ло отсутствие у животных опытной и контрольной групп пато
логических признаков воспаления, некроза, геморрагии, отека
внутренних органов; внутренние полости тела не содержали
свободной или осумкованной жидкости. Не отмечали раздра
жающего действия исследуемого вещества и растворителя на
слизистую оболочку желудочно-кишечного тракта. Процедура
некропсии и результаты исследования показали следующее.
Ротовая полость свободна, зубы сохранены, язык свободно вы
таскивается из ротовой полости, подвижен. Просвет пищево
да свободен, кардиальный сфинктер сжат, слизистая пищевода
гладкая, серовато-розового цвета. Полость желудка заполнена
измельченной непереваренной пищей, желудочным соком
и небольшим количеством слизи, пилорический сфинктер
сжат, тело желудка достаточно четко подразделяется на кар
диальную и фундальную части, слизистая оболочка желудка
умеренно складчатая, сероватого цвета. Просвет двенадцати
перстной и тощей кишки заполнен химусом и желчью, сли
зистая оболочка тонкого отдела кишечника серовато-розового
цвета, илеоцекальный клапан состоятелен. Просвет толсто
го отдела кишечника заполнен каловыми массами, слизи
стая оболочка серовато-розового цвета. На всем протяжении
желудочно-кишечного тракта не обнаружено явлений непро
ходимости, стенка его была нормальной толщины, слизистая
оболочка была обычного вида. Исследовали также и пищева
рительные железы: печень и поджелудочную железу, в кото
рых внешних патологических изменений не было обнаруже
но. Печень красно-коричневого цвета, мягкой консистенции,
умеренно кровенаполнена, желчный пузырь обычной формы,
немного наполнен желчью. Поджелудочная железа располо
жена диффузно в брыжейке тонкой кишки. Брыжейка тонкой
и подвздошной кишки обычного вида, содержит небольшое
количество жира, сосуды и комплекс брыжеечных лимфа
тических узлов. Почки расположены в брюшной полости,
темно-коричневого цвета, на разрезе корково-медуллярная
дифференцировка сохранена, лоханка почки не расширена,
конкрементов не обнаружено. Матка обычного вида
состоит
из шейки, тела и двух рогов, миометрий не утолщен, в полости
матки не содержится макроскопически видимой жидкости.
Яичники обычного вида, бугристые, кист и выраженных об
разований не обнаружено.
Проведено гистологическое исследование перечислен
ных органов и их фрагментов. При этом не выявлено ни
каких патологических изменений, свидетельствующих за
воспалительные, некробиотические, гипопластические или
гиперпластические процессы, дистрофии и атрофии, крово
излияния и новообразования в органах и тканях мышей как
в опытной, так и в контрольной группе. Пищевод в гисто
логических препаратах представлен полой гладкомышечной
трубкой, выстланной изнутри многослойным плоским эпите
лием, снаружи пищевод покрыт адвентицией.
Стенка желудка состоит из эпителиального, мышечного
и серозного слоев. Эпителиальный слой представлен одно
слойным железистым эпителием. Его клетки характеризу
ются ярко выраженной полярной дифференциацией. Железы
желудка не атрофированы. Собственная пластинка построе
на из рыхлой соединительной ткани. Мышечная оболочка
состоит из гладкомышечных клеток. Серозная оболочка по
строена из рыхлой соединительной ткани и снаружи покры
та мезотелием. Тонкий кишечник представлен трубчатым
мышечным органом, который состоит из эпителиального,
мышечного и серозного слоя. Эпителиальный внутренний
слой образует множество выпячиваний — кишечных ворси
нок. Мышечный слой состоит из гладкой мышечной ткани.
Серозный слой — из соединительной ткани, которая пере
ходит на него с брыжейки. Толстый кишечник также пред
ставлен трубчатым мышечным органом, который состоит из
эпителиального, мышечного и серозного слоя. Но в отличие
от тонкого отдела кишечника в толстом кишечные ворсин
ки отсутствуют. В слизистой оболочке тонкого и толстого
отдела кишечника расположены кишечные железы. При
микроскопическом исследовании печени отмечено сохране
ние балочно-радиарного расположения гепатоцитов, пери
портальные и центролобулярные зоны без патологических
особенностей. Микроскопическое строение поджелудочной
железы характеризует ее нормальное развитие и функцио
нирование: ацинусы и протоки железы сохранены, островки
Лангерганса обычного вида. Матка состоит из трех слоев:
серозного, мышечного и эпителиального. Эпителий матки
и маточные железы в неактивном состоянии. Яичники име
ют фолликулы всех стадий созревания и единичные желтые
тела. В почках клубочки, канальцы и собирательные тру
бочки без видимой патологии.
Таким образом, макроскопическое и микроскопическое
исследование внутренних органов и тканей у подопытных
животных показало отсутствие токсического и раздражаю
щего действия водного раствора фуллерена.
Заключение
Основная цель настоящего исследования — интеграль
ная оценка возможного токсического эффекта водной дис
персии фуллерена
, полученной новым диализным мето
дом [11, 12]. Тонкая структура наночастиц в такой дисперсии,
по-видимому, отличается от дисперсий
, получаемых наи
более распространенным методом, включающим ультразву
ковую обработку и применение толуола [13, 14]. Ранее мы
показали, что dn
обладает противоаллергической актив
ностью, а также способен снижать воспалительную реак
цию в модели ГЗТ [15]. Анализ острой токсичности dn

один из этапов оценки его биологической безопасности и пер
спективности применения как действующего начала терапев
тического средства. В настоящей работе мы установили, что
независимо от способа введения токсическим эффектом dn
не обладает. Более того, при введении его небольших доз у мы
шей наблюдали более активный набор массы тела по сравне
нию с контрольной группой. Гистологический анализ также не
выявил каких-либо патологических изменений внутренних ор
ганов, характерных для токсического поражения. Полученные
данные хорошо согласуются с ранними результатами других
авторов. Так, длительный эксперимент по анализу токсичности
фуллерена
, проведенный на крысах, показал, что фуллерен
почти в два раза увеличивал продолжительность жизни крыс, а
динамика изменения массы тела животных говорила об отсут
ствии явных токсических эффектов. Анализ механизмов дей
ствия с использованием экспериментальной модели интоксика
ции крыс четыреххлористым углеродом показал, что влияние
фуллерена на продолжительность жизни связано, по-видимому,
с подавлением окислительного стресса [16]. В другой недавней
публикации [17] установлено, что водная дисперсия
, стаби
лизованная крахмалом, не проявляла хронической токсичности
при и/г введении крысам, гематологические и биохимические
показатели не отличались от контроля (нормы). Таким образом,
все больше данных свидетельствует о биологической безопас
ности немодифицированной формы фуллерена.
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
Финансирование.
Работа выполнена при финансовой
поддержке Министерства образования и науки РФ, в рам
ках ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным
направлениям развития научно-технологического комплекса
России на 2014—2020 годы» (соглашение № 14.604.21.0059
от 27 июня 2014 г., уникальный идентификатор прикладных
научных исследований (проекта) RFMEFI60414X0059).
Конфликт интересов.
Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
ЕРА
РА
15. Башкатова Е.Н., Андреев С.М., Шершакова Н.Н., Бабахин А.А.,
Шиловский И.П., Хаитов М.Р. Изучение модулирующей актив
ности производных фуллерена
60 на реакцию гиперчувстви
тельности замедленного типа. Физиология и патология иммун
., Lamb L.D., Fostiropoulos K., Hoffman D.R. Solid
Nature.
Moussa F.,
hretien P., Dubois P.,
huniaud L., Dessante M., Trivin F.,
Sizaret P.
., Agafonov
eolin R., Szwarc H., Greugny
., Fabre
.,
Rassat A. The In�uence of
-60 Powders on
ultured HumanLeuko
Fullerene Science and Technology
Moussa F., Trivin F.,
eolin R., Hadchouel M., Sizaret P.
., Greugny
., Fabre
., Rassat A., Szwarc H. Early effects of
60 administra
tion in Swiss mice: A preliminary account for in vivo
60 toxicity.
Full. Sci. Technol
Oberdörster E., Zhu S., Blickley T.M., Mc
lellan-Green P., Haasch
M.L. Ecotoxicology of carbon-based engineered nanoparticles: Effects
) on aquatic organisms.
2006; 44: 1112—20.
Oberdörster E., Stone S., Donaldson K. Toxicology of nanoparticles:
A historical perspective.
Nanotoxicology.
Joner E.J., Hartnik T., Amundsen
Environmental fate and eco
toxicity of engineered nanoparticles. Norwegian Pollution Control
. 2008. Report no. TA 2304/2007.
., Pressac M., Hadchouel M., Szwarc H.,
ilson, S.R. and
Moussa F. [60] Fullerene is a powerful antioxidant in vivo with no
acute or subacute toxicity.
Satoh M., Takayanagi I. Pharmacological studies on fullerene (
), a
novel carbon allotrope, and its derivatives.
J. Pharmacol. Sci.
2006;
9.
Mori T., Takada H., Ito S., Matsubayashi K., Miwa
., Sawaguchi T.
Preclinical studies on safety of fullerene upon acute oral administration
Toxicology
N
elson M.A., Domann F.E., Bowden G.T., Hooser S.B., Fernando
arter D.E. Effects of acute and subchronic exposure of topically
applied fullerene extracts on the mouse skin.
Toxicol Ind Health.
11.
Andreev S.M., Purgina D.D., Bashkatova E.
., Garshev A.
., Maerle
., Khaitov M.R. Facile preparation of aqueous fullerene
nano
Andreev S., Purgina D., Bashkatova E., Garshev A., Maerle A., An
dreev A. et al. Study of fullerene aqueous dispersion prepared by
novel dialysis method. Simple way to fullerene aqueous solution.
Fullerenes Nanotubes and Carbon Nanostructures.
2015; 23(9):
Mchedlov-Petrossyan
.O. Fullerenes in liquid media: an unset
tling intrusion into the solution chemistry.
Chem. Rev.
2013; 113(7):
Andrievsky G.
., Kosevich M.
ovk O.M., Shelkovsky
ashcenko L.A. On the production of an aqueous colloidal solution
Bashkatova E.
., Andreev S.M., Shershakova
., Babakhin A.A.,
Shilovsky I.P., Khaitov M.R. Study of modulating the activity of
fullerene derivatives on delayed type hypersensitivity reaction.
Baati T., Bourasset F., Gharbi
jim L., Abderrabba M., Kerke
ni A. et al. The prolongation of the lifespan of rats by repeated
oral administration of [60] fullerene.
. 2012; 33:
Hendrickson O., Fedyunina
., Zherdev A., Solopova O., Svesh
nikov P., Dzantiev B. Production of monoclonal antibodies against
60 and development of a fullerene enzyme immunoassay.
Поступила 01.08.16
Принята в печать 16.08.16
ВТ
ОРО
Шершакова Н.Н., Андреев С.М., Барабошкина Е.Н., Шабанова Д.Д., Макарова Э.А.,
Хаитов М.Р.
ПРО
ОА
СТВ
ОРА
СТВ
ОРИМОЙ ФОРМЫ
ФУ
ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, Москва
Водорастворимая форма фуллерена C
(ВРФ), получаемая путем исчерпывающего диализа водно-органического
раствора, — перспективное средство для противоаллергической терапии. Противовоспалительные эффекты ВРФ
оценивали на мышах BALBc с генерированной патологией атопического дерматита, индуцированной овальбуми
ном. Значительное подавление IgE и цитокинов Th2-профиля и, наоборот, увеличение продукции цитокинов Th1-
профиля наблюдали у мышей после эпидермальной аппликации ВРФ. Наблюдали также значительное увеличение
уровней FOXP3- регуляторных клеток и экспрессии мРНК филаггрина. Гистологическое исследование образцов
кожи показало выраженное снижение эозинофильной и лейкоцитарной инфильтрации во взятых образцах. Ис
пользуемый подход — хорошая альтернатива для лечения аллергических заболеваний.
Ключевые слова:
водорастворимый фуллерен C
; аллергия; цитокины; атопический дерматит.
Для цитирования:
Шершакова Н.Н., Андреев С.М., Барабошкина Е.Н., Шабанова Д.Д., Макарова Э.А., Хаитов
М.Р. Противоаллергические свойства водорастворимой формы фуллерена С
. Иммунология. 2016; 37(6): DOI:
Для корреспонденции:
Андреев Сергей Михайлович
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
N., Andreev S
D., Makarova E
ANTI-ALLERGIC ACTIVITY OF WATER-SOLUBLE FULLERENE C
Institute of Immunology FMBA, 115478, Moscow
The water-soluble form of the C
fullerene (WSF) obtained by exhaustive dialysis aqueous organic solution is a promising
agent for the treatment of allergy. Anti-in�ammatory effects of WSF was assessed in mice BALBc with a skin in�ammation
(AD model) induced by ovalbumin. Signi�cant inhibition of IgE and Th2 cytokine pro�le and, on the contrary, increased
Th1 cytokine production pro�le was observed in mice after WSF epidermal application. A signi�cant increase in levels
of FOXP3- regulatory cells and the expression of �laggrin mRNA was observed. The approach is a good alternative
water-soluble fullerene C
; allergy; cytokines; atopic dermatitis.
For citation
Shershakova N.N., Andreev S.M., Baraboshkina E.N., Shabanova D.D., Makarova E.A., Khaitov M.R. Anti-allergic
activity of water-soluble fullerene C
For correspondence
Andreev Sergey Mihailovich
on�ict of interest.
The authors declare no con�ict of interest.
of the Russian Federation, within the Federal program "Research and development on priority directions
of June 27, 2014, a unique identi�er of applied research (project) RFMEFI60414X0059).
Одна из движущих сил воспалительной реакции, в том чис
ле и аллергии, — окислительный стресс, сопровождающийся
генерацией активных форм кислорода, свободных радикалов
и оксида азота. Фуллерен и его соединения как мощные анти
оксиданты способны
in vivo
in vitro
эффективно инактиви
ровать активные формы кислорода и свободные радикалы [1].
Это свойство делает фуллерен перспективным терапевтиче
ским средством лечения аллергии и других воспалительных
заболеваний, связанных с окислительным стрессом. Важны
ми параметрами служат его низкая токсичность, мембрано
тропные свойства, возможность использовать разные пути
его введения в организм. Поведение и свойства водных рас
творов фуллерена
(ВРФ), пригодные для биологических
исследований, изучали довольно интенсивно; разработаны
различные способы их получения. Однако, несмотря на это,
практическое их применение в качестве фармакологических
препаратов пока не описано. Многие известные методы
получения ВРФ нетехнологичны, имеют проблемы с
воспроизводимостью, включают применение токсичного
толуола, характеризуются низкой степенью трансформации
фуллерена из твердого состояния в раствор, что делает их
крайне дорогими. Ранее мы описали принципиально новый
метод получения ВРФ, основанный на переносе фуллерена из
раствора
-метилпирролидона (МП) в водную фазу, используя
принцип диализа через полупроницаемую мембрану [1].
Фуллерен в водной среде собирается в наноразмерные
кластеры, непроходимые через поры мембраны в отличие от
молекул МП. Противовоспалительная активность водного
раствора
показана ранее в опытах на мышах [2].
Здесь мы кратко описываем результаты использования
ВРФ для терапии экспериментального атопического дер
матита, индуцированного у мышей с помощью аллергена
овальбумина (ОА) при эпидермальной аппликации. В ходе
исследования мы проанализировали изменения основных
гуморальных и клеточных индикаторов, характерных для па
тогенеза атопического дерматита.
Показано, что уровень анти-ОА для IgE антител (важный
показатель атопической экземы) в группе мышей, получав
шей ВРФ, был заметно ниже относительно модельной (АД-
индуцированной) группы. Для характеристики изменения
иммунного ответа при введении ВРФ мы проанализировали
важные в аллергии показатели цитокинового профиля: IL-4,
IL-5, IL-12, IL-10, IL-13, IL-17, ИФН-γ, Foxp3. Показано, что
уровень IL-4 в супернатантах ОА-стимулированных сплено
цитов мышей, получавших фуллерен, был заметно ниже, чем
у мышей в модельной группе. Похожую картину наблюдали
при определении уровня IL-5 и IL-13 в той же группе. Эти
данные свидетельствуют о том, что введение ВРФ снижа
ет продукцию цитокинов Th2-профиля (IL-4, IL-5, IL-13).
С другой стороны, IL-12 — представитель цитокинов Th1-
профиля, и в этом случае ВРФ, наоборот, стимулировал его
продукцию по сравнению с животными модельной группы.
Кроме того, установлено, что при введении ВРФ также по
вышался уровень ИФН-γ.
Регуляторные Т-лимфоциты отвечают за дифференци
ровку Т-клеток, экспрессию цитокинов и других факторов,
в том числе участвуют в экспрессии транскрипционного
фактора Foxp3, задействованного в супрессии иммунного
ответа. При этом также характерна повышенная продукция
IL-10 как противовоспалительного цитокина (угнетается
клеточный ответ и усиливается гуморальный ответ — стиму
ляция Т-хелперов 2-го типа). В данном случае мы показали,
что при нанесении ВРФ степень продукции IL-10 не меняет
ся относительно модельной группы животных. Однако у жи
вотных увеличивался уровень экспрессии Foxp3 по сравне
нию с модельной группой, что свидетельствует о повышении
продукции регуляторных клеток; это может снижать уровень
аллергического воспаления. Не исключено, что способность
ВРФ влиять на экспрессию Foxp3 можно рассматривать как
ключевой момент в понимании механизма его терапевтиче
ского действия.
В рамках этой работы мы также проанализировали про
дукцию IL-17, цитокина, который, как считают, ассоцииро
ван с аллергическими реакциями, связанными с атопическим
дерматитом. При обработке мышей ВРФ происходит замет
ное повышение концентрации IL-17. В литературе имеются
противоречивые данные о роли IL-17 в патогенезе атопиче
ского дерматита, однако в большинстве работ наблюдают
снижение уровня данного цитокина. Наши данные полно
стью согласуются именно с этим фактом, т. е. введение фул
лерена приводило к повышению продукции IL-17.
Таким образом, по совокупности иммунологических
параметров оценки можно сделать вывод о наличии у фул
противоаллергической активности, поскольку он
обеспечивает достоверное снижение уровня специфического
IgE, Th2-цитокинов, а также повышение Th1-цитокинов [4].
Мы предполагаем, что эпидермальный слой кожи, содержа
щий клетки Лангерганса, лимфоциты, макрофаги, тучные
и другие клетки, служит первичной мишенью воздействия
ВРФ при эпидермальной аппликации, поскольку он не спо
собен при накожной аппликации проникать в системный кро
воток.
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
Финансирование.
Работа выполнена при финансовой
поддержке Министерства образования и науки РФ, в рамках
ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным
направлениям развития научно-технологического комплекса
России на 2014-2020 годы» (соглашение № 14.604.21.0059
от 27 июня 2014, уникальный идентификатор прикладных
научных исследований (проекта) RFMEFI60414X0059).
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
ЕРА
РА
Пиотровский Л.Б., Киселев О.И.
Фуллерены в биологии.
Издательство «Росток»: СПб; 2006.
Babakhin A.A., Andrievsky G., DuBuske L.M. Inhibition of system
ic and passive cutaneous anaphylaxis by water-soluble fullerene
Allerg. Clin
2009; 123(2): 118.
Андреев С.М., Пургина Д.Д., Башкатова Е.Н., Гаршев
А.В., Маерле А.В., Хаитов М.Р. Эффективный способ
получения водных нанодисперсий фуллерена
Российские
нанотехнологии
2014; 7-8: 11—7.
., Baraboshkina E., Andreev S., Purgina D., Struch
kova I., Kamyshnikov O., et al.
Anti-in�ammatory effect of fullerene
in a mice model of atopic dermatitis
Nanobiotechnol
2016;
14:8 DOI: 10.1186/s12951-016-0159-z.
Piotrovskiy L.B., Kiselev O.I.
Fullerenes in biology.
[Fullereny v bi
Publishing «Rostov»: St. Petersburg; 2006. (in Russian)
Babakhin A.A., Andrievsky G., DuBuske L.M. Inhibition of system
ic and passive cutaneous anaphylaxis by water-soluble fullerene
J. Allerg.
lin. Immunol. 2009; 123 (2): 118.
S.M., Purgina D.D., Bashkatova E.
., Garshev A.
., Maerle
., Khaitov M.R. An effective way to obtain water
60 nanodisper
. 2014; 7-8: 11—7. (in Russian)
., Baraboshkina E., Andreev S., Purgina D., Struch
kova I., Kamyshnikov O. et al. Anti-in�ammatory effect of fullerene
in a mice model of atopic dermatitis.
J. Nanobiotechnol.
2016;
14: 8 DOI: 10.1186 / s12951-016-0159-z.
Поступила 01.08.16
Принята в печать 16.08.16
КЛИНИЧЕСКАЯ ИММУНОЛОГИЯ И ИММУНОПАТОЛОГИЯ
ВТ
ОРО
Саидов М.З., Далгатова А.А., Израилова Г.Р., Курбанов К.З.
АЧ
АП
ОГО ИММУ
РОМ
ОГО
СД
ВЛЕН
Дагестанская государственная медицинская академия, 367000, г. Махачкала
Изучение корреляционных связей между показателями адаптивного иммунитета, уровнем сывороточного кортизо
ла и количеством лимфоцитов в крови и органах иммунной системы позволяет полнее представить иммунопатоге
нез синдрома длительного сдавления (СДС).
Цель исследования — оценить патогенетическое значение корреляционных связей показателей адаптивного им
мунитета, кортизолом и количество лимфоцитов в крови и в органах иммунной системы на экспериментальной
модели СДС различной степени тяжести.
Модель СДС воспроизводили у крыс путем наложения металлических тисков с площадью сдавливающей поверх
ности 5—6 см
. Тиски накладывали на 2; 4 и 6 ч на задние лапки под тиопенталовым наркозом и тем самым вос
производили I, II и III степени тяжести СДС.
Иммунопатогенетическая интерпретация достоверных корреляционных связей между показателями адаптивного им
мунитета при СДС I, II и III степени тяжести позволила обосновать положения, согласно которым процесс рабдомиоли
за сопровождается существенной активацией Т-лимфоцитов с сопутствующей гиперпродукцией провоспалительных
цитокинов ТНФα, IL-6 и ИФ-
этими клетками и признаками системного воспаления. В-клетки не принимают прямого
участия в этом звене. Гиперкортизолемия, достигающая своего пика при III степени тяжести СДС, прямо связана с
увеличением сывороточного уровня ТНФα и ИФ-
. На фоне максимального эндотоксикоза при рабдомиолизе опре
деляется реактивное перераспределение клеток иммунной системы, выражающееся: в абсолютной и относительной
лимфоцитопении; накоплении В-лимфоцитов в селезенке; увеличении активированных Т-лимфоцитов, продуцентов
, в региональных лимфатических узлах при сдавливании нижних лапок крыс; резком увеличении плотности лим
фоцитов в пейеровых бляшках при всех степенях тяжести СДС. Но абсолютная и относительная лимфоцитопения при
СДС сопровождается увеличением количества циркулирующих активированных лимфоцитов, а увеличение плотности
лимфоцитов в пейеровых бляшках происходит также за счет клеток, активно продуцирующих ТНФα, ИФ-
Ключевые слова:
синдром длительного сдавления; корреляционные связи; лимфоциты; кортизол; растворимые
CD3G и CD19; провоспалительные цитокины; ТНФα; IL-6, ИФ-γ.
Для цитирования:
Саидов М.З., Далгатова А.А., Израилова Г.Р., Курбанов К.З. Патогенетическое значение корре
ляционных связей показателей адаптивного иммунитета при синдроме длительного сдавления. Иммунология. 2016;
Для корреспонденции:
Саидов Марат Зиявдинович
, д-р мед. наук, проф., зав. кафедрой патофизиологии Даггосмедакадемии,
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
Saidov M.Z., Dalgatova A.A., Izrailova G.R., Kurbanov K.Z.
PATHOGENETIC SIGNIFICANCE OF CORRELATION BETWEEN FIGURE OF ADAPTIVE IMMUNE SYSTEM
Dagestan State Medical Academy, 367000, Makhachkala
The study of correlations between indicators of adaptive immunity, the level of serum cortisol and the number of lympho
cytes in the blood and organs of the immune system and allows you to better represent the immunopathogenesis of crush
The purpose of the study is to assess the pathogenetic signi�cance of correlations of indicators of adaptive immunity,
cortisol and the number of lymphocytes in the blood and in the organs of the immune system in an experimental model of
SDS of varying severity.
The SDS model was reproduced in rats by applying the metal vise with the area of compressive surface 5—6 cm
. The
grip imposed on 2, 4 and 6 hours for hind legs under anesthesia tiopentalom and thereby reproduced I, II and III degree
Immunopathogenetic reliable interpretation of correlation between indices of adaptive immunity in SDS I, II and III degree of
severity made it possible to prove the conditions under which the process of rhabdomyolysis accompanied by a signi�cant acti
vation of T-lymphocytes with its hyperproduction of proin�ammatory cytokines TNF-α, IL-6 and IF-γ by these cells and signs of
systemic in�ammation. B cells do not participate directly in this link. Hypercortisolemia, reaching its peak at III severity of SDS, is
directly related to the increase in serum level of TNF-α and IF-γ. Amid maximum of endotoxemia with rhabdomyolysis jet is de
phocytes in the spleen; increase in activated T-lymphocytes, producers of IF-γ in regional lymph nodes by squeezing the lower
legs of the rats; a sharp increase in the density of lymphocytes in Peyer’s patches in all degrees of severity of SDS. But absolute
and relative lymphocytopenia when SDS is accompanied by an increase in the number of circulating activated lymphocytes and
an increase in the density of lymphocytes in Peyer’s patches occurs also due to cells actively producing TNF-α, IF-γ and IL-6.
crush syndrome; correlation; lymphocytes; cortisol; soluble CD3G and CD19; proin�ammatory cytokines;
For citation:
Saidov M.Z., Dalgatova A.A., Izrailova G.R., Kurbanov K.Z. Pathogenetic signi�cance of correlation between
�gure of adaptive immune system in crush syndrome. Immunologiya. 2016; 37(6): 331-336. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-
For correspondence:
, Dr med. Sci., prof., head of the Department of physiology, Dagestan state
medical Academy, E-mail: marat2002Bpochta.ru.
on�ict of interest.
The authors declare no con�ict of interest.
Синдром длительного сдавления (СДС, краш-синдром
травматический рабдомиолиз) занимает важное место в
общей структуре травматизма, поскольку техногенные и
геологические катастрофы сопряжены с увеличением слу
чаев сдавливания мягких тканей, прежде всего поперечно-
полосатых мышц [1]. В основе СДС лежит сильное дли
тельное сдавливание конечностей, ведущее к прекращению
кровотока и ишемии тканей. Формирование патофизиологи
ческой картины СДС происходит после реперфузии тканей
на этапе извлечения пострадавших из-под завалов и харак
теризуется крайним разнообразием и выраженной тяжестью
патологических процессов и состояний. Среди них ведущее
место занимают тяжелый генерализованный эндотоксикоз
вследствие массивного попадания в кровоток продуктов раб
домиолиза и прежде всего миоглобина, плазмопотеря, боле
вой шок и полиорганная недостаточность с ведущей ролью
острой почечной недостаточности [1, 2]. Патогенетическим
базисом СДС служит эндогенная интоксикация продуктами
ишемии и реперфузии тканей. Реперфузионная токсемия
представлена гипермиоглобулинемией, гиперкалиемией, ме
таболическим ацидозом, попаданием в кровоток продуктов
распада белков, жиров и углеводов, превращением миогло
бина в солянокислый гематин. Последний служит основной
причиной развития острой почечной недостаточной при СДС
[3]. Кроме этого, хорошо документировано развитие у по
страдавших при тяжелых формах СДС синдрома диссемини
рованного внутрисосудистого свертывания, респираторного
дистресс-синдрома, воспаления, острой гиповолемии с гемо
концентрацией и с угрозой формирования гиповолемичесого
шока, постишемического отека тканей [1, 4].
Безусловно, столь разнообразные тяжелые патологиче
ские процессы при СДС оказывают непосредственное воз
действие на иммунную систему, что оказывается причиной
выделения важного патогенетического звена СДС, а именно
иммунопатогенеза. Показано, что продукты распада тканей,
травматическая токсемия, а также микробные антигены ак
тивируют клетки иммунной системы, что сопровождается
существенным увеличением уровня сывороточных про
воспалительных цитокинов (IL-1, IL-6, ТНФα), активацией
клеток макрофагально-моноцитарного ряда, сопряженной с
увеличением продукции микробицидной миелопероксидазы
(МПО), активацией
и
-клеток [5—7]. Ги
пермиоглобулинемия на этапе реваскуляризации сдавленных
тканей сопровождается индукцией патогенетически значи
мого ответа системы адаптивного иммунитета на этот анти
ген [2]. Крайне важны результаты исследований экспрессии
TLR-рецепторов на клетках врожденного иммунитета (ден
дритных клетках, макрофагах, естественных киллерах) при
СДС. Показано, что при СДС происходит селективная экс
прессия TLR2-, TLR4- и TLR9-рецепторов. Эта экспрессия
сопряжена с достоверным увеличением пролиферативной
активности спленоцитов и продукцией провоспалительных
цитокинов (IL-1, ТНФα), Th1
субпопуляцией лимфоци
тов [8—10]. Эти и другие данные важны с той точки зрения,
что индукция антиген-специфического иммунного ответа и
продукции провоспалительных цитокинов при СДС возмож
на при условии активации клеток врожденного иммунитета
через упомянутые TLR-рецепторы. Очевидно, что система
адаптивного и врожденного иммунитета — важный компо
нент патогенеза СДС.
Однако интерпретация имеющихся данных об изменени
ях параметров иммунной системы позволяет оценить колеба
ния показателей в зависимости от степени тяжести и периода
развития СДС. Безусловно, иммунопатогенетическая оценка
этого тяжелого состояния будет намного полнее при одно
временном анализе достоверных корреляционных связей
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
изученных показателей. Известно, что патофизиологический
анализ не может быть достаточно полноценным без учета
взаимосвязей и патогенетической интерпретации показате
лей всех органов и систем организма, в том числе и системы
иммунитета. В медицине наиболее удобный метод оценки
взаимосвязей — это корреляционный анализ. И хотя извест
но, что наличие достоверных корреляционных связей еще не
доказательство причинно-следственных взаимоотношений,
тем не менее их наличие позволяет сделать предварительные
выводы о некоторых патофизиологических закономерностях
изучаемых явлений [11].
В предыдущей работе на экспериментальной модели
СДС мы показали патогенетически важные изменения систе
мы адаптивного иммунитета, выражающиеся в относитель
ной и абсолютной лимфоцитопении, реактивном перерас
пределении мононуклеаров периферической крови в органах
иммунной системы, гиперпродукции провоспалительных
цитокинов — ТНФα, ИФ-γ, IL-6 и кортизола, увеличении
сывороточных уровней растворимых
D3G и
D19. Эти из
менения претерпевали этапность в соответствии со степенью
тяжести СДС и происходили на фоне несомненных признаков
системного воспаления как ответа на эндотоксикоз продукта
ми рабдомиолиза, достигающего своего максимума на этапе
реваскуляризации мышечной ткани. Очевидно, что изучение
корреляций между изученными показателями существенно
дополнит картину иммунопатогенеза СДС и позволит обо
сновать рекомендации по применению иммунотропной тера
пии пострадавших от СДС.
Цель настоящей работы — оценка патогенетического зна
чения корреляционных связей показателей адаптивного им
мунитета с кортизолом и количеством лимфоцитов в крови и
в органах иммунной системы на экспериментальной модели
СДС различной степени тяжести.
Материал и методы
Эксперименты проведены на крысах-самцах линии Вистар
в возрасте 8—12 мес массой 150—180 г. Животных содержали
в стандартных условиях и диете в виварии кафедры патофи
зиологии ДГМА. Работу с животными проводили в соответ
ствии с «Правилами проведения работ с использованием экс
периментальных животных. Приложения № 1, 2, 3, 4».
Модель СДС воспроизводили у крыс путем наложения
металлических тисков с площадью сдавливающей поверх
ности 5—6 см
. Тиски накладывали на 2, 4 и 6 ч на задние
лапки под тиопенталовым наркозом (0,2—0,3 мл 10' рас
твора тиопентала на одну особь). При этом сила сдавливания
была максимальной, но не нарушающей целостность костей
нижних конечностей. Такая модель общепринята и позволя
ет точно воспроизводить степень компрессионной травмы.
Животных выводили из эксперимента путем декапитации
под наркозом с последующим забором крови в пробирку с
антикоагулянтом и органов системы иммунитета — тимуса,
селезенки, пейеровых бляшек и региональных лимфатиче
Экспериментальные животные были разделены на 3 груп
пы: 1-я группа крыс (
15) с СДС легкой степени (I степень
тяжести), время сдавливания — 2 ч; 2-я группа крыс (
15)
с СДС средней степени (II степень тяжести), время сдавлива
ния — 4 ч; 3 группа крыс (
15) с СДС тяжелой степени (III
степень тяжести), время сдавливания — 6 ч, и контрольная
группа крыс (
После сепарации органов системы иммунитета матери
ал фиксировали в 10' нейтральном формалине в течение
24 ч. Затем кусочки ткани подвергали спиртовой дегидрата
ции, пропитывали в горячем парафине и заливали в блоки.
С блоков готовили 4 мкм гистологические срезы и после
депарафинизации окрашивали гематоксилин-эозином. Все
полученные препараты были подвергнуты морфометрии.
Морфометрические показатели определяли путем подсчета
количества нейтрофилов, лимфоцитов и эозинофилов в не
скольких полях зрения при ув. 400 с выведением средней
арифметической. Для подсчета выбирались наиболее типич
ные для данного препарата поля зрения.
Подсчет общего количества лейкоцитов проводили с
применением стандартной методики, согласно которой по
сле лизиса эритроцитов 3' раствором уксусной кислоты и
разведения полученной клеточной взвеси 1:20 подсчитывали
абсолютное число клеток в камере Горяева. Относительный
уровень нейтрофилов, лимфоцитов, моноцитов и эозинофи
лов в периферической крови крыс подсчитывали на мазках
крови после их окрашивания по Романовскому—Гимза при
Уровень
D3G в сыворотке крови определяли методом
твердофазного ИФА на наборах Rat T-cell surface glycoprotein
D3 gamma chain ELISA Kit компании
USABIO, кат.
Сывороточный уровень
D19 определяли на наборах
твердофазного ИФА Rat cluster of differentiation 19 (
ELISA Kit компании
USABIO, кат. №
SB-E14095г.
Уровень кортизола в сыворотке крови определяли на на
борах твердофазного ИФА Rat cortisol ELISA Kit компании
USABIO, кат. №
SB-E05112г. Результаты анализов
D19 и кортизола замеряли на многоканальном спектрофо
тометре Stat Fax 2600, A
ESS, Technology Inc. USA в
двухволновом режиме, основной фильтр — 450 нм, референс-
фильтр — 540 или 570 нм, они выражались в нг/мл.
Сывороточный уровень ТНФα определяли на набо
рах твердофазного ИФА Rat T
F-α ELISA Kit компании
USABIO, кат. №
SB-E11987г.
Сывороточный уровень ИФ-γ определяли на наборах
твердофазного ИФА Rat Interferon г (IF
-γ) ELISA Kit компа
USABIO, кат. №
SB-E04579г.
Сывороточный уровень IL-6 определяли на наборах твер
дофазного ИФА Rat Interleukin 6 (IL-6) ELISA Kit компании
USABIO, кат. №
SB-E04640г. Результаты анализов ТНФα,
ИФ-γ и IL-6 замеряли на многоканальном спектрофотометре
Stat Fax 2600, A
ESS, Technology Inc. USA в двухволно
вом режиме, основной фильтр — 450 нм, референс-фильтр —
540 или 570 нм, они выражались в пг/мл.
Обработку данных проводили с помощью статистиче
ского пакета Statistica (версия 6.0), а также Biostat 4.03. Базу
данных создавали с использованием редактора электронных
таблиц Microsoft Excel 2007. Непрерывные переменные в ис
следуемых выборках представлены в виде медианы (Ме) с
25-м, 75-м процентилями. Для определения достоверности
различий между двумя сравниваемыми выборками исполь
зовали критерий Манна—Уитни. Корреляционную взаи
мосвязь между изученными параметрами определяли с по
мощью коэффициента ранговой корреляции Спирмена (
). В
случаях, когда
равнялся от ± 0,7 до ± 1, связь определяли
как сильную, когда
равнялся от ± 0,3 до ± 0,7 как среднюю
и при значении
от 0 до ± 0,3 как слабую,
с положитель
ным знаком — прямая связь,
с отрицательным — обратная.
Различия считали статистически достоверными при уровне
значимости
езультаты и обсуждение
Как было сказано выше, в предыдущей работе мы пока
зали статистически достоверное увеличение растворимых
D19 и сывороточного ТНФα при всех степенях тяже
сти СДС, а ИФ-γ и IL-6 при I степени тяжести СДС. Эти изме
нения происходили на фоне выраженной гиперкортизолемии
и абсолютной лимфоцитопении. Степень инфильтрации лим
фоцитами органов иммунной системы при СДС варьировала,
обнаруживая тенденцию к снижению клеточной плотности по
мере увеличения степени тяжести СДС, но плотность лимфо
цитов при всех степенях тяжести СДС достоверно превышала
аналогичный показатель в контрольной группе.
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
Корреляционный анализ проведен между следующими
блоками данных: связь между показателями клеточного адап
тивного иммунитета с провоспалительными цитокинами;
связь между количеством лимфоцитов в крови с показателя
ми клеточного адаптивного иммунитета и провоспалитель
ными цитокинами; связь между плотностью лимфоцитов в
органах системы иммунитета с показателями клеточного
адаптивного иммунитета и провоспалительными цитокина
ми, и все это в зависимости от степени тяжести СДС.
Патогенетическая интерпретация проведена с учетом, во-
первых, статистической достоверности коэффициента кор
реляции, во-вторых, силы и знака коэффициента корреляции
и, в-третьих, появления новых по сравнению с контрольной
группой достоверных корреляционных связей.
В табл. 1 представлены результаты оценки корреляци
онных связей между уровнями растворимых
D19 и
ТНФα при СДС I, II и III степени тяжести. Для наглядности
помимо коэффициентов корреляции в этой и следующих та
блицах указаны количественные уровни изученных показа
Видно, что достоверные положительные сильные кор
реляционные связи прослеживаются между
D3G и ТНФα
при СДС I, II и III степени тяжести. В контрольной группе
эта связь не определяется. Очевидно, что при СДС актива
ция Т-лимфоцитов, продуцентов ТНФα, тесно сопряжена с
сывороточным уровнем этого цитокина. Напротив, отсут
ствие достоверных связей между
D19 и ТНФα не позволя
ет предположить патогенетическое участие активированных
В-лимфоцитов в гиперпродукции ТНФα при СДС. Таким об
разом, достоверное увеличение сывороточного уровня ТНФ
при СДС можно отнести на счет гиперпродукции этого цито
кина активированными Т-лимфоцитами, но не B-клетками.
В табл. 2 представлены результаты аналогичного корре
ляционного анализа, но по отношению к IL-6.
И в этом случае видно, что достоверные положительные
средней силы коэффициенты корреляции определяются меж
ду растворимыми
D3G и сывороточными уровнями IL-6 (в
контроле этой зависимости нет). Одновременно между уров
D19 и IL-6 прослеживается достоверная корреляцион
ная связь на фоне достоверного увеличения количественных
показателей
D19 и IL-6 при I степени СДС. Однако наличие
аналогичной связи в контрольной группе крыс не позволя
ет сделать вывод о патогенетической роли активированных
В-лимфоцитов в гиперпродукции IL-6 при СДС. Очевидно,
что основной источник IL-6 при СДС — это активированные
В табл. 3 представлены результаты оценки корреляцион
ных связей между растворимыми
Картина совершенно иная. Видно, что достоверная по
ложительная средней силы корреляционная связь опреде
ляется между
D3G и ИФ-γ в единственном случае — при
III степени СДС. Вероятно, подобная связь может просле
живаться только на фоне максимального эндотоксикоза при
рабдомиолизе, который достигается при III степени тяжести
СДС.
D19 и в этом случае не имеют достоверных корреля
ционных связей с сывороточным уровнем ИФ-γ, поэтому нет
оснований для предположения о патогенетическом участии
активированных В-лимфоцитов в гиперпродукции ИФ-γ при
СДС.
Как известно, компрессионная травма сопровождается
развитием всех признаков стресс-реакции. Один из важ
нейших признаков — резкое увеличение гормонов коры
Таблица 1
Корреляционные связи и уровни растворимых
степени тяжести
Показатель
I степень СДС,
II степень СДС,
III степень СДС,
Контроль,
— коэффициент ранговой корреляции Спирмена (здесь и далее); показатели
D3 G,
D19 и ТНФ-β представлены в виде Me (25-й;75-й про
< 0,01 по сравнению с контрольной группой (
-критерий Манна—Уитни).
Таблица 2
Корреляционные связи и уровни растворимых
степени тяжести
Показатель
I степень СДС,
II степень СДС,
III степень СДС,
Контроль,
Примечание. Показатели
D19 и ТНФα представлены в виде Me (25-й; 75-й процентили).
Таблица 3
Корреляционные связи и уровни растворимых
степени тяжести
Показатель
I степень СДС,
II степень СДС,
0,115,
III степень СДС,
Контроль,
Примечание. Показатели
D19 и ИФ-г представлены в виде Me (25; 75 процентили); *
< 0,05, **
< 0,01 по сравнению с кон
трольной группой (T-критерий Манна—Уитни).
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
надпочечников, в частности кортизола. С учетом непосред
ственных эффектов кортикостероидов на функциональную
активность клеток иммунной системы (индукция апоптоза,
лимфоцитопения, вторичный иммунодефицит) весьма инте
ресно было оценить корреляционные связи между уровнем
сывороточного кортизола и растворимыми
D3G и
D19, а
также ТНФα, IL-6 и ИФ-γ при СДС I, II и III степени тяжести.
Результаты представлены в табл. 4.
Из данных таблицы видно, что достоверных корреля
ций между сывороточным уровнем кортизола и уровнем
растворимых
D3G и
D19 не наблюдается. Ничего уди
вительного в этом факте нет, поскольку уровень раство
D3G и
D19 отражает степень активированности
Т- и В-лимфоцитов, а кортизол подавляет пролиферативную
активность и функциональную деятельность лимфоцитов.
Совместить указанные противоположные процессы затруд
нительно, но объяснить отсутствие корреляционных связей
вполне возможно. Помимо этого необходимо учитывать из
вестное явление стероид-опосредованного апоптоза лим
фоцитов. В наших исследованиях лимфоцитопению, сопут
ствующую всем степеням тяжести СДС, можно объяснить
именно этим процессом. Что же касается провоспалитель
ных цитокинов, то достоверные положительные средней
силы связи определяются между уровнем сывороточных
кортизола и ТНФ-α при I и III степени тяжести СДС, а также
с уровнем ИФ-γ при II степени тяжести СДС. Наличие по
ложительного знака
свидетельствует об однонаправленной
связи между этими показателями, т. е. увеличению концен
трации кортизола сопутствует увеличение уровня ТНФ-α и
ИФ-γ в сыворотке крови. Наличие подобных связей позволя
ет констатировать патофизиологический парадокс, а именно:
при компрессионной травме одновременно сосуществуют
экстремально повышенный сывороточный уровень кортизо
ла как результата стресс-реакции и достоверное повышение
провоспалительных цитокинов в циркуляции, причем по
следний факт сочетается с несомненными признаками си
стемного воспаления, присутствующими при всех степенях
тяжести и периодах развития СДС [7].
Не менее интересно было изучить состояние корреляций
между количеством лимфоцитов периферической крови и
изученными показателями адаптивного иммунитета. Резуль
таты представлены в табл. 5.
И в этом случае достоверные связи оказались немного
численными. С точки зрения иммунопатогенеза СДС вполне
объяснимо наличие достоверных положительных средней
силы корреляционных связей между абсолютным количе
ством лимфоцитов в периферической крови и растворимы
D19 и ИФ-γ. Очевидно, что количественный уровень и
D19, и ИФ-γ в сыворотке крови зависит соответственно от
количества активированных лимфоцитов. Несмотря на лим
фоцитопению при СДС, оставшиеся клетки, активируясь,
продуцируют те уровни растворимых факторов, которые и
определены в наших исследованиях. Парадоксально выгля
дит корреляционная связь между количеством лимфоцитов
и ТНФ-α,
–0,453,
0,05. Согласно знаку коэффициента
корреляции, уменьшение количества лимфоцитов в перифе
рической крови должно сочетаться с увеличением сывороточ
ного уровня ТНФ-α. С точки зрения причинно-следственных
отношений объяснить этот факт только активностью лимфо
цитов затруднительно. Вероятно, в нашем случае ответствен
ность за гиперпродукцию ТНФ-α при СДС несут и клетки
макрофагально-моноцитарного ряда, которые также служат
источником провоспалительных цитокинов.
Логическим продолжением этого этапа работы была оценка
корреляций между плотностью лимфоцитов в органах иммун
ной системы с растворимыми
D19, уровнем провос
палительных цитокинов и количеством лимфоцитов в крови.
Достоверных корреляционных связей оказалось немного, и все
они отражены в табл. 6.
Наибольшее количество достоверных связей отмеча
ют между плотностью лимфоцитов в пейеровых бляшках с
ТНФ-α, ИФ-γ, IL-6 и количеством лимфоцитов перифериче
Таблица 4
Корреляционные связи между уровнем сывороточного кортизола и растворимыми
D19, а также Т
степени тяжести
Показатель
I степень СДС,
Кортизол, нг/мл
II степень СДС,
Кортизол, нг/мл
–0,112
III степень СДС,
Кортизол, нг/мл
Контроль,
Кортизол, нг/мл
Таблица 5
Корреляционные связи между количеством лимфоцитов периферической крови и растворимыми
степени тяжести
Показатель
I степень СДС,
II степень СДС,
III степень СДС,
Контроль,
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
ской крови. Однако характер этих связей разнородный. По
ложительная связь средней силы определяется между плот
ностью лимфоцитов в пейеровых бляшках с уровнем ТНФ-α
и ИФ-α, что вполне логично, поскольку лимфоциты служат
в том числе продуцентами этих цитокинов. С IL-6 связь об
ратная. Парадоксально выглядит достоверная отрицательная
связь средней силы между плотностью лимфоцитов в пейе
ровых бляшках и количеством циркулирующих лимфоцитов.
Вероятно, увеличение плотности лимфоцитов в пейеровых
бляшках при СДС III степени тяжести — следствие перерас
пределения этих клеток из циркуляции в пользу тканевого
местоположения.
Положительная достоверная связь средней силы обнару
живается между плотностью лимфоцитов в селезенке и уров
нем растворимых
D19 при СДС II степени тяжести, иными
словами, увеличение клеточной плотности в селезенке про
исходит в том числе и за счет активированных В-клеток. Об
ращает на себя внимание наличие сильной положительной
связи между плотностью лимфоцитов в региональных лим
фатических узлах и уровнем ИФ-γ в сыворотке крови (
0,004) при СДС I степени тяжести. Очевидно, ак
тивированные лимфоциты, продуценты ИФ-γ, скапливаются
в региональных лимфоузлах при сдавливании нижних лапок
крыс. Подобное реактивное перераспределение лимфоцитов
служит одним из признаков реакции системы иммунитета на
сывороточные продукты начальных этапов рабдомиолиза.
Нельзя не обратить внимание на интересный факт — нали
чие отрицательной достоверной корреляционной связи (

0,049) между клеточной плотностью лимфоцитов
в тимусе и уровнем сывороточных
D19 в контроле, что под
тверждает известное явление — территория тимуса служит
местом созревания и дифференцировки Т-лимфоцитов.
Таким образом, патогенетическая интерпретация досто
верных корреляционных связей между показателями адап
тивного иммунитета при СДС I, II и III степени тяжести по
зволила обосновать положения, согласно которым процесс
рабдомиолиза сопровождается существенной активацией
Т-лимфоцитов с сопутствующей гиперпродукцией провоспа
лительных цитокинов ТНФ-α, IL-6 и ИФ-γ этими клетками и
признаками системного воспаления. В-клетки не принимают
прямого участия в этом звене патогенеза. Гиперкортизоле
мия, достигающая своего пика при III степени тяжести СДС,
прямо связана с увеличением сывороточного уровня ТНФ-α и
ИФ-γ. На фоне максимального эндотоксикоза при рабдомио
лизе определяется реактивное перераспределение клеток им
мунной системы, выражающееся в абсолютной
и относительной лимфоцитопении накоплении
В-лимфоцитов в селезенке, увеличении активи
рованных Т-лимфоцитов, продуцентов ИФ-γ, в
региональных лимфатических узлах при сдав
ливании нижних лапок крыс; резком увеличении
плотности лимфоцитов в пейеровых бляшках
при всех степенях тяжести СДС. Но абсолют
ная и относительная лимфоцитопения при СДС
сопровождается увеличением количества цир
кулирующих активированных лимфоцитов, а
увеличение плотности лимфоцитов в пейеровых
бляшках происходит также за счет клеток, актив
но продуцирующих ТНФ-α, ИФ-γ и IL-6.
Очевидно, что изучение иммунопатогенеза
СДС — перспективное направление, поскольку
знание этих механизмов позволит обосновать
применение средств селективной иммунокор
рекции и тем самым повысить клиническую
эффективность комплексного лечения постра
давших на всех этапах развития СДС.
Финансирование.
Исследование не имело
спонсорской поддержки.
Конфликт интересов.
Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
ЕРА
РА
Гуманенко Е.К.
Военно-полевая хирургия.
Мизиев И.А., Махов М.Х., Жигунов А.К. и др. Индивидуальный
прогноз острого повреждения почек у больных с сочетанной
травмой
. Медицина катастроф.
11.
Эпидемиология.
М.: ГЭОТАР-Медиа; 2006: 272—6.
Gumanenko E.K.
Military Surgery. [Voenno-polevaya khirurgiya].
Zimmerman J.L., Shen M.
. Rhabdomyolysis.
2013; 144(3):
Miziev I.A., Makhov M.Kh., Zhigunov A.K. et al. Personal progno
sis of acute kidney injury in patients with concomitant trauma.
itsina katastrof
Manson J., Thiemermann
., Brohi K. Trauma alarmins as activators of
damage-induced in�ammation.
Br. J. Surg.
2012; 99(Suppl. 1): 12—20.
FlohР S.B., FlohР S., Schade F.U. Invited review: deterioration of
the immune system after trauma: signals and cellular mechanisms.
.M., Osuka A., Lederer J.A. Trauma equals danger —
damage control by the immune system.
J. Leukoc. Biol.
2012; 92(3):
Menzel
.L., Pfeifer R., Darwiche S.S. et al. Models of lower ex
tremity damage in mice: time course of organ damage (
J. Surg. Res.
2011; 166(2): 149—56.
Darwiche S., Ruan
., Hoffman M.K. Selective roles for Toll-like re
ceptors 2, 4 and 9 in the systemic in�ammation and immune dysfunc
tion following peripheral tissue injury.
J. Trauma Acute Care Surg.
Y
ang H., Hreggvidsdottir H.S., Palmblad K. et al. A critical cysteine
is required for HMGB1 binding to Toll-like receptor 4 and activation
of macrophage cytokine release.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2010;
107(26): 11942—7.
Levy R.M., Prince J.M.,
ang R. et al. Systemic in�ammation and
remote organ damage following bilateral femur fracture requires
Toll-like receptor 4.
Am. J. Physiol. Regul. Integr. Comp. Physiol.
11.
V
Epidemiology. [Epidemiologiya].
Moscow: GEOTAR-
Поступила 13.05.16
Принята в печать 16.08.16
Таблица 6
Корреляционные связи между плотностью лимфоцитов в органах иммунной
системы с растворимыми
D19, уровнем провоспалительных цитоки
нов и количеством лимфоцитов в крови при
степени тяжести
СДС,
Л. у. — ИФ-γ
СДС,
Л. у. — ИФ-γ
СДС,
Контроль,
Л. у. —
Т. —
Примечание. Л. у. — лимфатические узлы; П. б. — пейеровы бляшки; С — се
лезенка; Т — тимус.
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
МЕТОДЫ
ВТ
ОРО
Бунятян Н.Д.
, Корнилова О.Г.
, Олефир Ю.В.
РА
РАБО
СТ
КАЧ
ЕСТВ
СТ
ФУ
ПАРА
ОБУ
РАМКАХ ГАРМО
АРО
ФГБОУ ВО «Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова» Минздрава
России, 119991, г. Москва;
ФГБУ «Научный центр экспертизы средств медицинского применения» Минздрава России, 127051, г. Москва
Обоснована необходимость разработки национальных стандартов качества определения антикомплементарной
активности препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения, обусловленная отсутствием
стандартизованной фармакопейной методики ее определения и отечественного стандартного образца. Прове
дена гармонизация методики определения антикомплементарной активности, используемой при производстве и
контроле качества отечественных препаратов иммуноглобулинов человека, с международными требованиями,
по результатам которой разработана общая фармакопейная статья «Определение антикомплементарной актив
ности лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения» (ОФС.1.8.2.0007.15).
Проведены исследования по аттестации отечественного стандартного образца иммуноглобулина человека для
определения антикомплементарной активности, по результатам которых аттестованные значения (со степенью
достоверности 95') антикомплементарной активности отрицательного контроля находятся в интервале от 37,9
до 45,1'; положительного контроля — в интервале от 73,6 до 82,8'; стандартный образец дополнительно оха
рактеризован по содержанию белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом, полученные значения
находятся в интервале от 100,2 до 103,8 мг/мл, на основании материалов по изучению стабильности обоснован
срок годности 1,5 года. Использование разработанного национального стандартного образца в гармонизированной
методике определения антикомплементарной активности позволяет обеспечить выпуск отечественных инфузион
ных препаратов иммуноглобулинов человека надлежащего качества.
Внедрение разработанной стандартизованной методики определения антикомплементарной активности в Госу
дарственную фармакопею Российской Федерации XIII издания послужило важным шагом к достижению высокого
качества отечественных препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного введения и гармонизации с
международными стандартами, а также ключевым условием повышения их конкурентоспособности и выхода на
зарубежные фармацевтические рынки.
Ключевые слова:
антикомплементарная активность; иммуноглобулин человека, стандартный образец; ат
тестация.
Для цитирования:
Бунятян Н.Д., Кривых М.А., Корнилова О.Г., Олефир Ю.В., Борисевич И.В. Разработка нацио
нальных стандартов качества для определения антикомплементарной активности инфузионных препаратов имму
ноглобулина человека в рамках гармонизации с международными требованиями. Иммунология. 2016; 37(6): 337-343.
, Ole�r Yu.V.
, Borisevich I.V.
THE DEVELOPMENT OF NATIONAL QUALITY STANDARDS TO DETERMINE ANTICOMPLEMENTARY
ACTIVITY OF INFUSION OF DRUGS IMMUNOGLOBULIN RIGHTS IN THE CONTEXT OF HARMONIZATION
WITH INTERNATIONAL REQUIREMENTS
The necessity of developing national quality standards determine the anticomplementary activity of human immunoglobulin
preparations for intravenous administration due to the lack of a standardized method for determining the pharmacopeia
and the national standard sample. Spend the harmonization of methods for determining the anticomplementary activity,
used in the manufacture and quality control of drugs of domestic human immunoglobulin’s with international requirements,
the results of which developed a general chapter «Determination of anticomplementary activity of human immunoglobulin
preparations for intravenous administration» (GC.1.8.2.0007.15). Investigations by the national certi�cation standard
sample of human immunoglobulin to determine the anticomplementary activity, the results of which certi�ed values (with
the degree of reliability of 95') anticomplementary activity of the negative control are in the range of 37.9 to 45.1';
positive control — in the range of 73.6 to 82.8'; Standard sample was further characterized by protein content by the
colorimetric method with biuret reagent obtained values are in the range of 100.2 to 103.8 mg/ml, based on materials to
Для корреспонденции:
Кривых Максим Андреевич
, эксперт I категории лаборатории иммуноглобулинов и препаратов крови Испы
тательного центра экспертизы качества МИБП ФГБУ НЦЭСМП, E-mail: KrivykhBexpmed.ru
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
study the shelf life stability grounded 1.5 years. Using the developed national standard sample in a harmonized method
of determining the anticomplementary activity allows for the release of domestic human immunoglobulin infusion drugs of
good quality.
Implementation of the developed standardized methodology for determining the anticomplementary activity in the State
Pharmacopoeia of the Russian Federation XIII edition served as an important step towards the achievement of high-
quality domestic products of human immunoglobulin for intravenous administration and harmonization with international
anticomplementary activity; human immunoglobulin; reference standard; validation.
For citation:
Bunyatyan N.D., Curves M.A., Kornilov O.G., Ole�r Yu.V., Borisevich I.V. The development of national quality
standards to determine anticomplementary activity of infusion of drugs immunoglobulin rights in the context of harmonization
with international requirements. Immunologiya. 2016; 37(6): 337-343. DOI: 10.18821/0206-4952-2016-37-6-337-343
For correspondence:
Krivykh Maxim Andreevich
, expert of Testing center for Evaluation of medical immunobiological
products quality, «Scienti�c
on�ict of interest. T
he authors declare no con�ict of interest.
Лекарственные препараты (ЛП) иммуноглобулинов че
ловека для внутривенного введения (ИГВВ) — неотъемле
мая часть фармакотерапии иммунодефицитных состояний,
аутоиммунных и онкологических заболеваний. Они широ
ко используются для профилактики и лечения вирусных и
бактериальных инфекций [1]. За последние 20 лет спрос на
ЛП ИГВВ значительно возрос в связи с расширением пока
заний к их применению, а также увеличением потребности
в указанных препаратах в развивающихся странах [2]. В то
же время проведение иммуноглобулинотерапии зачастую
сопровождается рядом нежелательных реакций, таких как
спонтанная активация системы комплемента с образованием
анафилатоксинов, активация калликреин-кининовой, плаз
миновой систем и системы свертывания крови, изменение
реологических свойств крови, инициация внутрисосудистого
гемолиза и др. [3, 4].
Спонтанная активация системы комплемента с соответ
ствующими клиническими проявлениями (одышка, дрожь,
в редких случаях реакции анафилактического и анафилак
тоидного типа), по мнению ряда исследователей, вероятно,
обусловлена присутствием в ЛП агрегированных и/или по
врежденных при фракционировании молекул иммуноглобу
лина, на Fc-участке которых происходит спонтанная актива
ция комплемента, что приводит в свою очередь к активации
макрофагов и высвобождению вазоактивных субстанций [1,
3, 5]. Показателем качества ЛП ИГВВ, характеризующим
указанные нежелательные реакции, служит антикомплемен
тарная активность (АКА).
АКА, не превышающая 50', что соответствует не более
1 СН
/мг белка, позволяет предотвратить возникновение
возможных нежелательных реакций при внутривенных ин
фузиях ЛП иммуноглобулинов и обеспечить их терапевтиче
скую эффективность.
Согласно рекомендациям экспертов Всемирной организа
ции здравоохранения (ВОЗ), все серии ЛП ИГВВ подлежат
обязательному испытанию на антикомплементарную актив
ность [6], поскольку ее уровень
in vitro
имеет значение для
прогноза возможных нежелательных реакций ЛП
Методика определения АКА сопряжена с рядом крити
ческих параметров, связанных с использованием биологи
ческих реагентов, таких как комплемент морских свинок,
эритроциты барана и гемолитическая сыворотка [3], вариа
бельность которых обусловливает необходимость использо
вания стандартного образца (СО), гарантирующего досто
верность получаемых результатов в различных диапазонах
значений АКА.
В производстве большинства зарубежных ЛП ИГВВ для
стандартизации методик контроля готового ЛП применяют
международные СО. В настоящее время в мировой практи
ке для определении АКА используют СО иммуноглобулина
человека (Human immunoglobulin (A
A and molecular size),
BRP batch 1) с аттестованными значениями АКА отрицатель
ного контроля в диапазоне от 10 до 40' и положительного
контроля в диапазоне от 60 до 100' [7]. ВОЗ настоятельно
рекомендует использование национальных (отечественных)
Российские производители ЛП ИГВВ до настоящего вре
мени использовали методики определения АКА, описанные
в методических рекомендациях [1] 1988 г. и методических
указаниях [2] 2001 г., которые не предусматривают примене
ние СО. Методика [1], введенная в действие в 1988 г., не по
зволяет оценить соответствие ЛП иммуноглобулинов чело
века современным международным требованиям, поскольку
предусматривает определение АКА как «сохранение актив
ности 2 гемолитических единиц в присутствии 10 мг белка
иммуноглобулина». Методика [2] стала первым шагом на
пути к гармонизации российских стандартов качества на ЛП
ИГВВ с международными. В то же время в отличие от мето
дики зарубежных фармакопей данная методика предполага
ет использование барбитала и его натриевой соли в составе
буферного раствора, сухого (коммерческого) комплемента
морских свинок, рассчитана на больший объем реакционной
смеси (общий объем после добавления сенсибилизирован
ных эритроцитов составляет 7,5 вместо 1,5 мл, используе
мых в методике зарубежных фармакопей [9, 10]), а также не
предусматривает расчет АКА в процентах. Получение досто
верных значений АКА достигается проведением исследова
ний в стандартизованных условиях. Использование произво
дителями указанных методик
определения АКА значительно
снижает конкурентные преимущества российских ЛП ИГВВ
относительно их зарубежных аналогов по критерию оценки
«эффективность/безопасность».
Общемировой тенденцией стала гармонизация нормати
вов и форм контроля в сфере обеспечения эффективности,
безопасности и качества фармацевтической продукции. Го
сударственное регулирование фармацевтического рынка на
правлено на обеспечение обращения только тех ЛП, которые
соответствуют национальным и международным стандартам
качества, эффективности и безопасности [11].
Одно из приоритетных направлений по развитию госу
дарственной системы контроля качества, эффективности и
безопасности — создание системы государственной стандар
тизации в области контроля качества лекарственных средств,
включая систему аттестации государственных СО и перио
дического издания российской государственной фармакопеи.
Результаты стандартизации лекарственных средств находят
свое отражение в специальных нормативных документах —
фармакопейных статьях [11].
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
Цель настоящих исследований — гармонизация россий
ских стандартов качества определения АКА с международ
ными требованиями и разработка национального СО имму
ноглобулина человека для определения АКА.
Материал и методы
Коммерческие серии ЛП иммуноглобулина человека в
различных формах выпуска с содержанием белка более 45
мг/мл, произведенные российскими фармацевтическими
предприятиями. Образцы ЛП иммуноглобулинов человека,
подвергшиеся термической обработке на водяной бане (тем
пература воды 56 ± 1 °
), длительность которой зависит от
формы выпуска [12, 13]. СО иммуноглобулина человека (ан
тикомплементарная активность и молекулярные параметры)
BRP, серия 1 (Human immunoglobulin (A
A and molecular
size)) BRP batch 1 (Кат. №
0001504), утвержденный Евро
пейским директоратом по качеству лекарственных средств
и здравоохранения, Франция (European Directorate for the
Quality of Medicines, EDQM) в 2011 г.
Определение антикомплементарных свойств иммуно
глобулинов.
Изучение антикомплементарных свойств пре
паратов иммуноглобулина человека проводили в реакции
связывания комплемента [9], метод определения основан на
способности иммуноглобулинов человека связывать компле
мент, препятствуя лизису сенсибилизированных эритроци
тов барана.
В настоящем исследовании использовали коммерческие
наборы реагентов «Сыворотка диагностическая гемолитиче
ская жидкая» (НПО «Микроген», Россия); «Антисыворотка
кролика к эритроцитам барана Амбоцептор 6000» (Siemens,
Германия); «Сыворотка диагностическая гемолитическая
кроличья жидкая для РСК» (ЗАО «ЭКОлаб», Россия); кровь
баранью дефибринированную с цитратом натрия (ЗАО «ЭКО
лаб», Россия), пулированный (
in house
) комплемент морских
свинок собственного изготовления [9].
езультаты
Проведенный научный анализ современного состояния
проблемы стандартизации ЛП иммуноглобулинов человека по
АКА выявил отсутствие указаний об использовании СО в оте
чественном фармацевтическом анализе качества. При исполь
зовании методики [2] для определения АКА отрицательного
и положительного контролей СО иммуноглобулина человека
BRP получены значения, не соответствующие аттестованным,
что показало целесообразность оптимизации данной методи
ки с учетом требований Европейской фармакопеи.
Методика определения АКА предусматривает приготов
ление гемолитической системы, состоящей из гемолитиче
ской сыворотки в соответствующем разведении и 5' суспен
зии эритроцитов барана в соотношении 1:1. Исследования
нескольких серий гемолитической сыворотки различного
производства позволили определить их одинаковую актив
ность. Одна минимальная гемолитическая единица в 1 мл
(МГЕ/мл) содержалась в разведении 1:500, соответственно
при определении АКА необходимо использовать 2 МГЕ/мл,
содержащиеся в разведении 1/250 (рис. 1).
Для получения 5' суспензии эритроцитов барана воз
можно использование крови бараньей дефибринированной
или дефибринированной с цитратом натрия. Из-за неста
бильности крови бараньей дефибринированной ее примене
ние ограничено 14 днями, после чего начинается спонтанный
гемолиз, поэтому в настоящем исследовании предпочтение
отдано использованию крови бараньей дефибринированной
с цитратом натрия.
Различные серии комплемента морских свинок оказыва
ют значительное влияние на конечный результат определе
ния АКА, и подходящие серии комплемента должны быть
определены в процедуре скрининга [3]. Проведенные иссле
дования по изучению влияния комплемента морских свинок
различных производителей (два коммерческих комплемента
и пулированный комплемент (
in house
) собственного изго
товления) позволили установить, что только при использо
вании пулированного комплемента (
in house
) значения АКА
СО иммуноглобулина человека BRP серии 1 соответствуют
аттестованным (табл. 1). В настоящем исследовании обосно
вали возможность применения в стандартизованной методи
ке желатин-солевого раствора (ЖСР), поскольку применение
барбитала и его натриевой соли в составе буферного раство
ра ограничено необходимостью соответствующего лицензи
рования. Возможность использования ЖСР подтверждена
соответствием значений АКА отрицательного и положитель
ного контролей СО иммуноглобулина человека BRP аттесто
ванным (рис. 2).
Рис. 1. Результаты определения активности (МГЕ/мл) гемолитиче
ских сывороток производства.
— Siemens, Германия;
— ЗАО «ЭКОлаб», Россия;
— НПО «Микро
ген», Россия.
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
Таким образом, проведенные исследования позволили
обосновать оптимальные условия определения АКА ЛП
ИГВВ, предусматривающие использование эритроцитов из
крови бараньей дефибринированной с цитратом натрия, ге
молитической сыворотки в соответствующем разведении,
пулированного комплемента морских свинок (
in house
) и
ЖСР как альтернативу ЖББР [14]. Оптимизированная мето
дика послужила основой для разработки общей фармакопей
ной статьи «Определение антикомплементарной активности
лекарственных препаратов иммуноглобулинов человека для
внутривенного введения», вошедшей в состав Государствен
ной фармакопеи Российской Федерации
III издания.
С целью разработки отечественного СО иммуно
глобулина человека для определения АКА изучена воз
можность использования ЛП ИГВВ российского про
изводства в качестве кандидата в СО. Нами отобраны
по три серии различных лекарственных форм ИГВВ,
результаты исследования (табл. 2) свидетельствуют о
возможности использования изученных ЛП ИГВВ в ка
честве отрицательного контроля и их непригодности в
качестве положительного контроля в составе одноком
понентного СО для определения АКА.
По мнению ряда исследователей [3, 5, 15], одним из
факторов, обусловливающих спонтанную активацию
комплемента, служит присутствие в ЛП агрегированных
и поврежденных при фракционировании молекул имму
ноглобулина. Нормативными требованиями к ЛП ИГВМ
регламентировано повышенное содержание агрегиро
ванных молекул иммуноглобулина (до 10'). С целью из
учения возможности использования в качестве кандида
тов в положительный/отрицательный контроли СО были
исследованы образцы 17 серий ЛП ИГВМ (табл. 3), по
лученные результаты свидетельствует о непригодности
изученных ЛП в качестве кандидата в положительный
контроль и в то же время возможности их использования
в качестве отрицательного контроля СО.
Проведенный ретроспективный анализ результатов
молекулярно-массового распределения молекул имму
ноглобулина, полученных методом высокоэффективной
жидкостной хроматографии с УФ-спектрофотометрическим
детектированием в 330 сериях ЛП ИГВМ, позволил сделать
вывод о том, что содержание полимеров и агрегатов во всех
изученных сериях не превысило 1,32' и соответствует тре
бованиям, предъявляемым к содержанию полимеров и агре
гатов в инфузионных ЛП иммуноглобулинов человека — не
более 3', что, возможно, объясняет полученные значения
Проведенный анализ научной литературы позволил сде
лать вывод о том, что прогревание иммуноглобулинов чело
века приводит к увеличению их АКА [3]. С целью разработки
положительного контроля СО выбор температуры термиче
ской обработки образцов ЛП ИГВВ/ИГВМ основывался на
том, что температура более 50 °С обуслов
ливает конформационные изменения мо
лекул иммуноглобулина [16].
Для выбора оптимального времени про
гревания на водяной бане при температуре
56 ± 1 °
образцов ЛП ИГВВ/ИГВМ для по
лучения значений АКА, удовлетворяющих
требованиям к положительному контролю
СО, ампулы с раствором иммуноглобулина
по 1 и 1,5 мл прогревали в течение 3, 5 и 7
мин с последующим охлаждением при ком
натной температуре в течение 15 мин; ам
пулы по 3 и 3,4 мл прогревали в течение 5, 7
и 10 мин с последующим охлаждением при
комнатной температуре в течение 15 мин;
флаконы по 25 мл прогревали в течение 10,
15 и 20 мин, затем охлаждали 20 мин.
Результаты исследований позволяют
сделать вывод, что оптимальная продол
жительность термической обработки об
разцов ЛП ИГВВ/ИГВМ в ампулах с рас
твором иммуноглобулина по 1 и 1,5 мл
составляет 5 мин; в ампулах по 3 и 3,4 мл
— 7 мин; во флаконах по 25 мл — 15 мин
(табл. 4).
Таким образом, проведенные исследо
вания позволили обосновать двухкомпо
нентный состав СО и выбрать кандидатов
в отрицательный и положительный кон
Рис. 2. Антикомплементарная активность положительного (АКА «-») и от
рицательного (АКА «–») контроля стандартного образца иммуноглобули
на человека BRP при использовании желатин-солевого раствора (ЖСР) и
желатин-барбиталового буферного раствора (ЖББР).
Таблица 1
нтикомплементарная активность стандартного образца иммуноглобулина человека
BRP при использовании комплемента морских свинок различных производителей
Наименование
реагента/Произ
водитель
Серия реагента
(количество ис
следований)
Антикомплементарная
активность СО иммуно
глобулина человека BRP,
процент,
Соответствие атте
стованным значениям
антикомплементарной
активности СО иммуно
глобулина человека BRP
отрица
контроль
положи
контроль
отрица
контроль*
положи
контроль**
Комплемент
сухой/НПО
«Микроген»,
Россия
Определить
невозможно
811 (
11,6 ± 2,5
11,5 ± 3,1
Пулированный
комплемент/
Примечание. * — аттестованные значения составляют от 10 до 40'; ** — аттестован
ные значения составляют от 60 до 100'.
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
троли. Отрицательный контроль — образец иммуноглобули
на человека для внутривенного/внутримышечного введения,
положительный контроль — образец ИГВВ/ИГВМ, подверг
шийся термической обработке на водяной бане при темпера
туре 56 ± 1 °
в течение определенного времени.
Аттестация стандартного образца.
Установление зна
чений аттестуемой характеристики СО для определения АКА
проводили в одной лаборатории с использованием СО имму
ноглобулина человека BRP серии 1 и методики измерений,
метрологические характеристики которой были определены
в рамках внутрилабораторной валидации. Исследования про
вели три аналитика, получили 27 независимых результатов в
условиях промежуточной прецизионности (табл. 5).
Средние значения АКА для отрицательного контроля СО
составили 41,5'; для положительного контроля СО — 78,2'.
Стандартное отклонение значений отрицательного контроля
составило 1,8', положительного контроля — 2,3'.
Коэффициент вариации результатов определения АКА,
характеризующий стандартную неопределенность от способа
установления аттестованного значения, составил 4,34 и 2,94'
для отрицательного и положительного контроля соответствен
но. Расширенная неопределенность аттестованного значения
АКА (степень достоверности 95') составила 3,6 и 4,6' для
отрицательного и положительного контроля соответственно. В
качестве дополнительной характеристики изучено содержание
белка колориметрическим методом с биуретовым реактивом
составившее 102 ± 1,8 мг/мл (степень достоверности 95').
Обсуждение
Развитие системы контроля качества над реактивами и
реагентами, являющимися критическими параметрами и
источником вариабельности определения АКА, разработ
ка стандартизованной методики определения АКА должны
быть главными требованиями для испытания выпускаемых
серий ЛП ИГВВ.
Качество используемого комплемента морских свинок имеет
четко выраженное влияние на результат определения АКА и не
может быть стандартизировано в настоящее время [3]. Это вы
звано биологической изменчивостью от серии к серии, которая
не может быть определена известными критериями качества.
Полученные нами результаты подтверждают выводы Buchacher
A. и соавт. о том, что каждая коммерческая серия комплемента
должна быть проверена на пригодность, несоответствующие
серии комплемента необходимо исключать путем скрининга
перед использованием в рутинных исследованиях.
Таким образом, проведенные исследования позволили
обосновать оптимальные условия определения АКА ЛП
ИГВВ, предусматривающие использование эритроцитов
из крови бараньей дефибринированной с цитратом натрия,
гемолитической сыворотки в соответствующем разведе
нии, пулированного комплемента морских свинок (
in house
и желатин-солевого раствора как альтернативу желатин-
барбиталовому буферному раствору. Оптимизированная
методика послужила основой для разработки общей фар
макопейной статьи «Определение антикомплементарной
активности лекарственных препаратов иммуноглобулинов
человека для внутривенного введения», вошедшей в состав
Государственной фармакопеи РФ
III издания.
Проведенные исследования позволили обосновать выбор
кандидата в СО и способ получения его положительного кон
троля. Получена серия СО для определения АКА, представ
ляющая собой два компонента: отрицательный контроль —
образец иммуноглобулина человека для внутримышечного
введения, положительный контроль — образец иммуногло
Таблица 2
нтикомплементарная активность лекарственных препаратов
иммуноглобулинов человека для внутривенного введения
Иммуноглобулин
человека нормаль
ный в лекарствен
ной форме
Количество
исследова
Антикомплементарная актив
ность, процент,
Отрицательный
контроль
Положитель
ный контроль
Лиофилизат для
приготовления рас
твора для внутри
венного введения
Определить
невозможно
Раствор для внутри
венного введения
То же
Раствор для
инфузий
Таблица 3
нтикомплементарная активность лекарственных препаратов
иммуноглобулинов человека для внутримышечного введения
Группировочное наименование
№ серии
Значения антикомпле
ментарной активности,
процент,
Иммуноглобулин человека
противостафилококковый
Иммуноглобулин человека
противостолбнячный
Иммуноглобулин человека
нормальный
Иммуноглобулин человека
против гепатита B
Иммуноглобулин человека
противоаллергический
Иммуноглобулин против
клещевого энцефалита
Таблица 4
нтикомплементарная активность образцов иммуноглобулина
человека до и после термической обработки
Образец, подвергшийся
термической обработке
Антикомплементарная активность,
процент,
мической
обработки
после термической обра
ботки (продолжительность
обработки)
Иммуноглобулин
человека (раствор для
внутримышечного
введения), ампулы по 1
Определить невозможно
Иммуноглобулин челове
ка (раствор для внутри
мышечного введения),
ампулы по 3 и 3,4 мл
Определить невозможно
Иммуноглобулин чело
века (раствор для вну
тривенного введения),
флаконы по 25 мл
Определить невозможно
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
булина человека для внутримышечного введения, подверг
шийся термической обработке на водяной бане (температура
воды 56 ± 1°
) в течение 5 мин.
Проведена аттестация СО для определения АКА (со
степенью достоверности 95') получены значения АКА
отрицательного контроля в интервале от 37,9 до 45,1';
положительного контроля в интервале от 73,6 до 82,8';
по содержанию белка в интервале от 100,2 до 103,8 мг/мл.
Исследования по изучению стабильности позволили уста
новить срок годности для СО для определения АКА —
1,5 года.
Заключение
Таким образом, внедрение разработанной стандартизо
ванной методики общей фармакопейной статьи «Опреде
ление антикомплементарной активности лекарственных
препаратов иммуноглобулинов человека для внутривенного
введения» в состав Государственной фармакопеи Российской
Федерации
III издания послужило важным шагом к до
стижению высокого качества отечественных инфузионных
препаратов иммуноглобулинов человека и гармонизации
с международными стандартами, а также стало ключевым
условием повышения конкурентоспособности ЛП и выхода
на зарубежные фармацевтические рынки.
Финансирование.
Исследование не имело спонсорской
поддержки.
Конфликт интересов.
Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
ЕРА
РА
Корнилова О.Г., Кривых М.А., Кудашева Э.Ю., Бунятян Н.Д., Лебе
динская Е.В., Нечаев А.В. и др. Гармонизация требований к специ
фической безопасности препаратов иммуноглобулинов человека с
мировыми стандартами качества.
Фармация
Plasma Economics:
oncept of Plasma Market Driver. Available at:
Buchacher A., Schluga P., Mullner J., Schreiner M., Kannicht
einberger J. Anticomplementary activity of I
IG concentrates —
important assay parameters and impact of IgG polymers.
Vox Sang
Корнилова О.Г. Современные аспекты изучения специфической
безопасности препаратов иммуноглобулинов человека для вну
тривенного введения.
Международный журнал прикладных и
фундаментальных исследований
Miekka S.I., Gozze I. Anticomplementary activity of human Immu
noglobulin G: I. Mechanism of the artifactual increase in anticomple
mentary activity of IgG during assay.
Vox Sang.
World Health Organization Expert Committee on Biological Stan
dardization: Forty-third Report. WHO Technical Report Series 840.
Geneva, 1992;
Available at: http://whqlibdoc.who.int/trs/
Sandberg E.,
ostanzo A., Daas A., Buchheit K.-H.
alibration of the
human immunoglobulin BRPs for A
A and molecular size (batch 1)
and for Fc function and molecular size (batchs 1&2). In:
ropa Bio & SN
W
orld Health Organization Expert
ommittee on biological standard
ization. Recommendations for the preparation, characterization and es
Таблица 5
езультаты определения антикомплементарной активности стандартного образца
Аналитик
Дата про
ведения
исследова
Антикомплементарная активность стандартного
образца иммуноглобулина человека BRP, '
Антикомплементарная активность стандартного образца, '
отрицательный контроль
положительный контроль
отрицательный контроль
положительный контроль
Аналитик 1
Аналитик 2
Аналитик 3
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
tablishment of international and other biological reference standards. In:
WHO Technical Report Series 932, annex 2.
European Pharmacopoeia 8.1, 01/2010:20617 corrected 7.6 «Test for
anticomplementary activity of immunoglobulin». Available at: http://
Indian Pharmacopoeia. Human Normal Immunoglobulin for Intra
11.
Стратегии лекарственного обеспечения населения Россий
ской Федерации на период до 2025 года и плана ее реали
зации. Available at: http://www.garant.ru/products/ ipo/prime/
Кривых М.А., Корнилова О.Г., Кудашева Э.Ю.
Способ получения
положительного контроля стандартного образца иммуногло
булина человека для определения антикомплементарной актив
ности препаратов иммуноглобулинов человека, и стандартный
образец иммуноглобулина человека для определения антиком
плементарной активности препаратов иммуноглобулинов че
ловека.
Патент РФ № 2577703; 2015
Кривых М.А., Корнилова О.Г., Бунятян Н.Д., Кудашева Э.Ю., Ру
нова О.Б., Малкова В.И. и др. Разработка стандартного образца для
определения антикомплементарной активности препаратов имму
ноглобулинов человека.
Хим.-фарм. журн
Кривых М.А., Корнилова О.Г., Бунятян Н.Д., Кудашева Э.Ю.
Оптимизация условий определения антикомплементарной ак
тивности препаратов иммуноглобулинов человека для внутри
венного введения.
Хим.-фарм. журн
Ramasamy I., Tran E., Farrugia A. Measurement of anticomplemen
tary activity in therapeutic intravenous immunoglobulin preparations.
Biologicals: J. Int. Assoc. Biol. Standard
Северин Е.С. (ред.)
Биохимия: Учебник
. 2-е изд. М.: ГЭОТАР-
1.
Kornilova O.G., Krivykh M.A., Kudasheva E.
u., Bunyatyan
.D.,
Lebedinskaya E.
.,
echaev A.
. et al. Harmonization of requirements
for the speci�c safety of human immunoglobulin preparations with the
Plasma Economics:
oncept of Plasma Market Driver. Available at:
Buchacher A, Schluga P., Mullner J., Schreiner M., Kannicht
einberger J. Anticomplementary activity of I
IG concentrates —
important assay parameters and impact of IgG polymers.
Vox Sang
Kornilova O.G. Modern aspects of studying speci�c security prepara
tions of human immunoglobulins.
Mezhdunarodnyy zhurnal prikladnykh
i fundamental’nykh issledovaniy.
Miekka S.I., Gozze I. Anticomplementary activity of human Immu
noglobulin G: I. Mechanism of the artifactual increase in anticomple
mentary activity of IgG during assay.
Vox Sang.
World Health Organization Expert Committee on Biological Stan
dardization: Forty-third Report. WHO Technical Report Series 840.
Geneva, 1992;
Available at: http://whqlibdoc.who.int/trs/
Sandberg E.,
ostanzo A., Daas A., Buchheit K.-H.
alibration of the
human immunoglobulin BRPs for A
A and molecular size (batch 1)
and for Fc function and molecular size (batchs 1&2). In:
ropa Bio & SN
W
orld Health Organization Expert
ommittee on Biological Standard
ization. Recommendations for the preparation, characterization and es
tablishment of international and other biological reference standards. In:
WHO Technical Report Series 932, annex 2
European Pharmacopoeia 8.1, 01/2010:20617 corrected 7.6 «Test for
anticomplementary activity of immunoglobulin». Available at: http://
Indian Pharmacopoeia. Human Normal Immunoglobulin for Intra
11.
Strategy of drug provision of the population of the Russian
Federation for the period up to 2025 and its implementation
plan. Available at: http://www.garant.ru/products/ ipo/prime/
Krivykh M.A., Kornilova O.G., Kudasheva E.
Method for Produc
ingPpositive Control Standard Sample of Human Immunoglobulin to
Determine Anticomplementary Activity of Preparations of Human
Immunoglobulin, and Standard Sample of Human Immunoglobulin
to Determine Anticomplementary Activity of Preparations of Human
13.
Krivykh M.A., Kornilova O.G., Bunyatyan
.D., Kudasheva E.
u.,
Runova O.B., Malkova
.I. et al. Development of a reference standard
for the determination of anticomplementary activity of human immu
Krivykh M.A., Kornilova O.G., Bunyatyan
.D., Kudasheva E.
Optimization of the conditions for determining anticomplementary
activity of human immunoglobulin preparations for intravenous in
Ramasamy I., Tran E., Farrugia A. Measurement of anticomplemen
tary activity in therapeutic intravenous immunoglobulin preparations.
Biologicals: J. Int. Assoc.Biol. Standard
Severin E.S. (ed.)
Biochemistry: A Textbook. [Biokhimiya: Ucheb
Moscow: GEOTAR-MED; 2004.
Поступила 06.06.16
Принята в печать 16.08.16
Для корреспонденции:
Смирнов Валерий Валерьевич
ВТ
ОРО
, Петухов А.Е.
, Шабанова Д.Д.
, Егоренков Е.А.
Шершакова Н.Н.
, Хаитов М.Р.
ЕСТВЕНН
ФУ
ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, 115478, г. Москва, Россия;
ГБОУ ВПО «Первый МГМУ им. И.М. Сеченова», 199911, г. Москва
Разработан метод количественного определения перспективного вещества, обладающего иммунологической ак
тивностью, — фуллерена C
в водных средах, пригодный для анализа его содержания в фармацевтических суб
станциях, лекарственных средствах, а также в биологических образцах при фармакокинетических исследованиях.
Извлечение фуллерена из исследуемых образцов осуществляется жидкостной или твердофазной экстракцией с
последующим анализом методом ВЭЖХ с использованием УФ-, МС- и МС/МС-детекторов.
Ключевые слова:
фуллерен C
; ВЭЖХ; УФ-, МС-, МС/МС-детекторы.
Для цитирования:
Смирнов В.В., Петухов А.Е., Андреев С.М., Шабанова Д.Д., Егоренков Е.А., Шершакова Н.Н.,
Хаитов М.Р. Количественное определение фуллерена С
в водных средах. Иммунология. 2016; 37(6): 343-347. DOI:
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
, Petukhov A
, Andreev S
, Egorenkov E
QUANTITATIVE DETERMINATION OF FULLERENE C
IN AQUEOUS MEDIA
Institute of Immunology FMBA, 115478, Moscow
A method of quantitative determination of substance with immunological activity — fullerene C
in aqueous media
suitable for the calculation of its concentrations in the pharmaceutical products, as well as for pharmacokinetic studies
was developed. A fullerene extraction from samples can be carried out using either liquid-liquid extraction or solid-phase
extraction followed by analysis by HPLC using UV, and MC-MS/MS detection.
fullerene C
; HPLC-UV; HPLC-MS; HPLC-MS/MS.
For citation:
Smirnov V.V., Petukhov A.E., Andreev S.M., Shabanova D.D., Egorenkov E.A., Shershakova N.N., Khaitov M.R.
Quantitative determination of fullerene C
For correspondence:
Smirnov Valeriy Valer’evich,
on�ict of interest.
The authors declare no con�ict of interest.
and science of the Russian Federation, within the Federal program «Research and development
on priority directions of development of scienti�c-technological complex of Russia for 2014—2020» (agreement
esearch (project) RFMEFI60414X0059).
ведение
Фуллерен
— углеродная молекула сферической формы
диаметром около 0,7 нм, характеризуется высокой липофиль
ностью, сильным сродством к электронам и способностью к
формированию кластеров в растворах, что обусловливает его
многие биологические эффекты [1, 2]. Фуллерен как в сво
бодном виде, так и в форме функциональных производных
в настоящее время интенсивно используют в электронике,
оптике, косметике в качестве добавок к конструкционным
материалам. Однако наибольшие его перспективы связаны с
дизайном лекарственных средств [2, 3].
Отметим перспективность использования данной молекулы
в создании лекарственных препаратов, влияющих на иммун
ную систему [2, 3]. Изучение свойств этого вещества показало
оправданность использования его в качестве иммунотропного
препарата [3]. В этой связи очень важна задача разработки чув
ствительных и специфичных методов анализа фуллерена в раз
личных средах, например для изучения фармакокинетических
параметров фуллеренсодержащих препаратов.
Фуллерен
хорошо растворим только в ароматических
растворителях (толуол, хлорбензолы, нафталины) и некото
рых маслах, и он практически нерастворим в воде (<0,1 нг/мл)
[2, 4]. Но даже в растворенном состоянии молекулы фулле
рена имеют высокую склонность к агрегации с формирова
нием кластеров [5]. Поэтому количественное определение
фуллерена, особенно в биологических системах, — довольно
трудная задача, причем не только из-за склонности к класте
рообразованию, но и из-за его взаимодействия с окружающи
ми молекулами белков, липидов, а также воды. В настоящее
время широко развиты методы получения водных растворов
(дисперсий) фуллерена (ВРФ), где молекулы
организо
ваны в наноразмерные кластеры (50—100 нм), окруженные
плотной оболочкой из молекул воды [6].
Дисперсии ВРФ могут рассматриваться как потенциаль
ная основа иммуноактивных препаратов [3]. Важная задача
при проведении биологических испытаний наноматериалов,
в том числе при фармакокинетических исследованиях, —
обеспечить стандартизацию, контроль качества препарата и
количественный анализ ВРФ в биологических пробах. В слу
чае ВРФ это осложняется тем, что его в биологической среде
невозможно спектрофотометрировать прямым путем, осо
бенно при низких концентрациях. Его максимум поглощения
лежит в области 330 нм, а флуоресценция настолько слабая,
что собственная флуоресценция биомолекул заглушит све
чение ВРФ. Поэтому из доступного аналитического арсена
ла остается только метод высокоэффективной жидкостной
хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с чувствительными и
селективными детекторами. Ранее для анализа
уже при
меняли ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометром (МС) [7].
Преимущество такого подхода в том, что он позволяет легко
дифференцировать продукты модификации фуллерена, ко
торый в водной среде может подвергаться окислению и ги
дроксилированию. Современные методы ВЭЖХ в сочетании
с МС-детекцией в зависимости от модификации позволяют
обеспечить чувствительность от 1 пг до 10 нг/мл. Используя
некоторые приемы, можно анализировать содержание фулле
рена в различных средах, обеспечивая одновременно анализ
подлинности, чистоты и количественного содержания.
Недавно мы разработали эффективный и биосовместимый
способ получения ВРФ [8], который демонстрировал хоро
шую противоаллергическую активность в случае эксперимен
тального атопического дерматита. [3]. В этой связи разработка
надежного метода количественного определения фуллерена
как в разрабатываемых препаратах на его основе, так и в
биологических образцах имеет решающее значение при про
ведении биологических испытаний. Данная работа описывает
методику, которая может быть использована с различными ти
пами хроматографов, оборудованных современными детекто
рами. Предлагаемый метод — фармакопейный, пригодный для
анализа фармацевтических препаратов, содержащих ВРФ.
Материал и методы
В работе использовали следующие материалы-
растворители: ВРФ [8], метанол, ацетонитрил (R
I, Super
Gradient, Super Gradient), воду очищенную (Milli-Q), толу
ол, диэтиловый эфир, этилацетат, хлороформ (все ЭКОС,
«хч»). Оборудование: жидкостной хроматограф Agilent
1200 с масс-спектрометрическим детектором MS 6120
(Agilent Technologies), жидкостной хроматограф Shimadzu-
MS8040 с тандемным масс-селективным детектором
(Shimadzu), диодноматричный детектор Agilent DAD 1260
(Agilent), весы аналитические ES 225 SMDR (Швейцария),
pH-метр Seven Multi (Mettler Toledo), центрифуга Eppendorf
5415D (Eppendorf), вортекс ELMI (Латвия), концентратор Ep
oncentrator plus (Eppendorf), дозаторы переменного
объема 10—100 и 100—1000 мкл (Eppendorf), система водо
подготовки Millipore, Milli-Q (Advantage A10), микропробир
ки Eppendorf 2 мл, колбы мерные класса «А» вместимостью
50 и 100 мл, картриджи для твердофазной экстракции
Immunology. 2016; 37(6)
ARTICLE
езультаты и обсуждение
Пробоподготовка. Жидкость-жидкостная экстракция
В основу предлагаемого метода положен процесс
перераспределения концентрации экстрагируемого вещества
между двумя взаимно несмешивающимися жидкостями. В
качестве экстрагентов выбрали полярные и неполярные рас
творители: ацетонитрил, толуол, диэтиловый эфир, этилаце
тат, хлороформ. Экстракцию проводили двукратным и трех
кратным объемом экстрагентов, объем пробы, из которой
проводили экстракцию, составлял 1000 мкл. Для калибров
ки к 1000 мкл ВРФ с известной концентрацией (1 мкг/мл)
прибавляли 2000 или 3000 мкл экстрагента. Смесь встряхи
вали на вортексе в течение 10 мин, затем центрифугировали
при скорости 13 000 об./мин для разделения слоев. Органи
ческий слой отделяли и упаривали досуха. Сухой остаток
растворяли в 100 мкл экстрагента, используя ультразвуковую
баню. Аликвоту полученного раствора вводили в колонку
хроматографа через инжектор, методические детали количе
ственного определения фуллерена описаны ниже.
Экстрагируемость фуллерена из образца сильно зависела
от соотношения объемов экстрагента к объему образца и
характера растворителя. Результаты представлены в табл. 1
в виде процента экстракции, рассчитаны как соотношение
площадей пиков, один из которых соответствует фуллерену
из образца, а другой — фуллерену из стандартного раствора
(номинальное количество, 1 мкг/мл).
Очевидно, что толуол давал наилучшие результаты при
трехкратном соотношении объема экстрагента к объему ана
лизируемого образца. Поэтому для дальнейших эксперимен
тов применяли следующую методику. К 1 мл ВРФ с различ
ными концентрациями добавляли 3 мл толуола, встряхивали
на вортексе в течение 10 мин, затем слои разделяли центри
фугированием при 13 000 об./мин, толуольный слой отделя
ли и упаривали досуха. Сухой остаток растворяли в 100 мкл
толуола в ультразвуковой бане. Полученный раствор вводили
в хроматограф для анализа.
Пробоподготовка. Твердофазная экстракция (ТФЭ).
В
данном методе анализируемое вещество селективно поглоща
ется твердым сорбентом (в виде картриджа/микроколонки) с
последующим элюированием подходящим растворителем.
Для активации картриджа и для элюирования из него целево
го вещества используют различные растворители. Учитывая
гидрофобные свойства фуллерена, мы выбрали картриджи
объемом 1 мл с 100 мг сорбента с размером
45 мкм и пор 60 Г. Для элюирования в качестве экстрагента
тестировали ацетонитрил, толуол, диэтиловый эфир, этилаце
тат и хлороформ. Вначале картридж активировали 1 мл экс
трагента, 2 мл метанола и 1 мл деионизированной воды, затем
наполняли деионизированной водой. Затем через картридж
пропускали 10 мл ВРФ в концентрации 1 мкг/мл, используя
вакуум (около 1 ч). Картридж промывали 1 мл деионизирован
ной воды, проводили элюирование 5 мл экстрагента и полу
ченный органический экстракт упаривали досуха. Сухой оста
ток растворяли в 100 мкл экстрагента, используя ультразвук,
и раствор вводили в аналитический хроматограф (параметры
хроматографии и детектирования обсуждаются ниже). Резуль
таты анализа ТФЭ приведены в табл. 2.
Из таблицы следует, что использование толуола как
экстрагента дает наилучшие результаты, это хорошо
коррелирует с данными, полученными при использовании
ЖЖЭ (см. табл. 1), эффективность последнего метода лишь
немного уступает ТФЭ-методу (83 против 92'). Метод ЖЖЭ
менее трудозатратный и более экономичный по сравнению
с ТФЭ, поэтому именно его выбрали для дальнейших
исследований. Однако ТФЭ целесообразно применять для
случаев, когда концентрация фуллерена слишком низкая.
Хроматографический анализ.
После оптимизации про
боподготовки проводили подбор режимов хроматографиче
ского разделения и масс-спектрометрического детектирования
экстрагируемой пробы
. Для хроматографии использовали
колонку с обращенной фазой Agilent ZORBA
Eclipse
DB
18 (150 × 4,6 мм, 5 мкг). В качестве подвижных фаз прове
рили различные соотношения метанол/вода, ацетонитрил/вода,
толуол/вода, ацетонитрил/толуол и метанол/толуол. Наиболее
качественное разделение компонентов смеси показали подвиж
ные фазы толуол/метанол и толуол/ацетонитрил в соотношении
60:40. Для оценки пригодности хроматографической системы
использовали значения: число теоретических тарелок, фактор
асимметрии, коэффициент разделения. Поскольку ацетонитрил
более дешевый и менее опасный растворитель, в качестве под
вижной фазы выбрали систему толуол/ацетонитрил (60:40). Ре
жим элюирования — изократический, скорость элюирования
1 мл/мин. При этих условиях время выхода пика, соответствую
щего фуллерену, было равно 1,6 мин.
Выбор типа ионизации молекулы и параметры масс-
спектрометрии.
Для детектирования фуллерена проверили
три типа ионизации: ESI (ионизация электроспреем), AP
I (хи
мическая ионизация при атмосферном давлении) и смешанный
тип ионизации. В результате исследований показано, что тип
ESI имеет относительно более низкую (но при этом достаточ
ную для наших исследований) чувствительность и селектив
ность, чем AP
I или смешанный тип, поэтому мы выбрали
тип AP
I. Однако в случае отсутствия такого типа детектора
может быть применен тип ионизации ESI. Дальнейшие экспе
рименты позволили установить оптимальные параметры для
масс-спектрометра: тип ионизации — AP
I, негативная поляр
ность, напряжение на капилляре 1300—1700 В, давление рас
пылительного газа 2—5,5 атм., скорость высушивающего газа
10 л/мин, температура распыления 350 °
, температура высу
шивания 350 °
, m/z (для
) 720. Разработаны дополнитель
ные методики определения фуллерена методом ВЭЖХ в соче
тании с УФ- и MS/MS-детектированием. Хроматографические
параметры оставались такими же, разница заключалась лишь
в параметрах детектирования. Так, для УФ-детектирования
использовали диодноматричный детектор, работающий при
длине волны 333 нм, а для MS/MS-детектирования — тройной
квадруполь, причем трансмиссия ионов осуществлялась между
материнским ионом с m/z 720 и таким же дочерним ионом с
m/z 720. Энергия перехода была равна 35В. Разработанные
параметры представлены в табл. 3.
Для количественного определения использовали метод аб
солютной калибровки. Для этого по указанной выше методи
Таблица 1
ыход
после экстракции проб различными растворителями
Растворитель
При двукратном
объеме экстрагента, '
При трехкратном
объеме экстрагента, '
Ацетонитрил
Хлороформ
Этилацетат
Диэтиловый эфир
Толуол
Таблица 2
тепень экстракции фуллерена
при использовании твердо
фазной экстракции
Растворитель
Степень экстракции, '
Ацетонитрил
Хлороформ
Этилацетат
Диэтиловый эфир
Толуол
Иммунология. 2016; 37(6)
ОРИГИНАЛьНЫЕ СТАТьИ
ке анализировали содержание фуллерена в 6 образцах ВРФ с
различными концентрациями, выводя линейную зависимость.
Расчеты по данным анализа показали, что метод, включаю
щий ЖЖЭ и масс-спектрометрическое детектирование, дает
предел количественного обнаружения около 1 нг/мл, при этом
диапазон линейности составил 50—10 000 нг/мл.
Результат работы демонстрирует, что содержание
фуллерена
в водной среде можно с высокой чувстви
тельностью и воспроизводимостью количественно опре
делять стандартными методами ВЭЖХ в сочетании с масс-
спектрометрическими детекторами. Мы предполагаем, что
эта методика может быть использована и для определения
данного вещества в различных субстанциях, в том числе и
в биопробах. Результаты диапазона количественного опреде
ления при использовании различных сочетаний разработан
ный методик, а также рекомендации по возможности их ис
пользования приведены в табл. 4.
Заключение
Разработаны чувствительные и селективные методики
количественного определения перспективного вещества
с иммунотропными свойствами — фуллерена
— для
различных областей применения.
Финансирование
Работа выполнена при финансовой
поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках
ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным
направлениям развития научно-технологического комплекса
России на 2014—2020 годы» (соглашение № 14.604.21.0059
от 27 июня 2014, уникальный идентификатор прикладных
научных исследований (проекта) RFMEFI60414X0059).
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
ЕРА
РА
., Lamb L.D., Fostiropoulos K., Hoffman D.R. Solid
Nature
Пиотровский Л.Б., Киселёв О.И.
Фуллерены в биологии
. СПб:
Издательство «Росток»; 2006.
., Baraboshkina E., Andreev S., Purgina D., Struch
kova I. et al. Anti-in�ammatory effect of fullerene
60 in a mice
C
ataldo F. Solubility of fullerenes in fatty acids esters: a new way to
deliver in vivo fullerenes. Theoretical calculations and experimental
Carbon Mater. Chem. Physics
Y
izhak M., Smith A.L., Korobov M.
. et al. Solubility of
60 Fuller
.O. Fullerenes in liquid media: an unset
tling intrusion into the solution chemistry.
Chem. Rev
. 2013; 113(7):
Pycke B.F., Benn T.M., Herckes P. et al. Strategies for quantifying
(60) fullerenes in environmental and biological samples and
implications for studies in environmental health and ecotoxicology.
Trends Analyt. Chem
. 2011; 30(1): 44—57.
Andreev S., Purgina D., Bashkatova E., Garshev A., Maerle A.,
Andreev I. et al. Study of fullerene aqueous dispersion prepared by
novel dialysis method. Simple way to fullerene aqueous solution.
Fullerenes Nanotubes and Carbon Nanostructures.
2015; 23(9):
., Lamb L.D., Fostiropoulos K., Hoffman D.R. Solid
Nature.
Piotrovsky L.B., Kiselev O.I.
Fullerenes in biology
. St. Petersburg:
3.
Shershakova
., Baraboshkina E.., Andreev S., Purgina D.,
Struchkova I. et al. Anti-in�ammatory effect of fullerene
60
Таблица 3
Параметры хроматографирования образца и детектирования
Подвижная фаза
Толуол/ацетонитрил (60:40), предваритель
но профильтрованная и дегазированная
Режим элюирования
Изократический, скорость потока
Неподвижная фаза
Хроматографическая колонка Zorbax
температура 30 °
Объем вводимой пробы
Время хроматографи
рования
Режим детектирования:
Масс-спектрометрический детектор:
Тип ионизации: AP
Режим детектирования: SIM
Полярность: негативная
Напряжение на капилляре: 1300—1700 В
Давления распылительного
газа: 2—5,5 атм.
Скорость высушивающего газа: 10 л/мин
Температура распыления: 350 °
Температура высушивания: 350 °
Тандемный масс-спектрометрический
детектор:
Тип ионизации: ESI
Режим детектирования: MRM
Напряжение на капилляре: 1300—1700 В
Давления распылительного газа:
2—5,5 атм
Температура распыления: 350 °
Энергия перехода: 35 В
M/z материнского иона: 720
M/z дочернего иона: 720
Диодноматричный детектор:
Длина волны: 333 нм
Таблица 4
екомендуемые параметры анализа
60 в различных средах
Метод
экстрак
Метод
тирова
Предел
количе
ственного
обнаруже
Диапазон
Область
возможного
Водные раство
ры фуллерен-
содержащих мате
риалов, косметика
Сточные воды, кос
метика, биологиче
Следовые количе
ства в биопробах,
анализ загрязнений
ТФЭ
Водные растворы,
косметика
ТФЭ
Водные растворы,
косметика, биоло
гические образцы
ТФЭ
Следовые количе
ства в биопробах,
анализ загрязнений
Immunology. 2016; 37(6)
in a mice model of atopic dermatitis.
J. Nanobiotech
. 2016; 14:
4.
C
ataldo F. Solubility of fullerenes in fatty acids esters: a new way
to deliver in vivo fullerenes. Theoretical calculations and experi
mental results.
Carbon Mater. Chemistry and Physics.
2008; 1:
Y
izhak M., Smith A.L., Korobov M.
. et al. Solubility of
60 Fuller
.O. Fullerenes in liquid media: an unset
tling intrusion into the solution chemistry.
Chem. Rev
. 2013; 113 (7):
Pycke B.F., Benn T.M., Herckes P. et al. Strategies for quantifying
(60) fullerenes in environmental and biological samples and implica
tions for studies in environmental health and ecotoxicology.
Trends
. 2011; 30 (1): 44—57.
Andreev S., Purgina D., Bashkatova E., Garshev A., Maerle A.,
Andreev I. et al. Study of fullerene aqueous dispersion prepared by
novel dialysis method. Simple way to fullerene aqueous solution.
Fullerenes Nanotubes and Carbon Nanostructures
. 2015; 23 (9):
Поступила 01.08.16
Принята в печать 16.08.16
ОБЗОРЫ
ВТ
ОРО
К 612.112.94.017.1.08
Израельсон М.
, Погорелый М.
, Киргизова В.
, Путинцева Е.
Егоров Е.С.
, Британова О.В.
УА
УАРО
ОРО
«Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И. Пирогова», 117997,
г. Москва;
«Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН», 117997,
г. Москва
Все должно быть настолько простым, насколько возможно, но не проще.
Альберт Эйнштейн
Каждый Т-лимфоцит несет на своей поверхности молекулы Т-клеточного рецептора (T-cell receptor, TCR), способ
ные распознать чужеродный антиген и защитить организм от инфекции или онкологического заболевания. Раз
нообразие репертуара TCR во многом определяет эффективность иммунной защиты и диапазон распознаваемых
антигенов. Более того, индивидуальный репертуар TCR содержит в себе потенциально читаемую информацию об
эффективности прошедшей вакцинации, о последствиях проведенной иммунотерапии, а также о наличии и дина
мике заболеваний. Мы расскажем о том, чем современные технологии массированного секвенирования репертуа
ров TCR могут быть полезны сегодня — для фундаментальной иммунологии и биомедицинских исследований, и
завтра — для клинической практики.
Ключевые слова:
адаптивный иммунитет; репертуар Т-клеточных рецепторов; высокопроизводительное сек
венирование; анализ данных.
Для цитирования.
Израельсон М., Касацкая С., Погорелый М., Киргизова В., Путинцева, Е., Егоров Е.С., Британова
О.В., Чудаков Д.М. Анализ индивидуальных репертуаров Т-клеточных рецепторов. Иммунология. 2016; 37(6): 347-
Izrael’son M.
*, Pogorelyy M
*, Kirgizova V.
, Egorov E.S.
, Britanova O.V.
ANALYSIS OF INDIVIDUAL REPERTOIRES OF T CELL RECEPTORS
. And. Pirogov, 117997, Moscow;
Institute of Bioorganic chemistry. M.M. Shemyakin and
u.A. Ovchinnikov RAS, 117997, Moscow
Each of the T-lymphocyte carries on its surface molecules of T-cell receptor (T cell receptor, TCR) that can recognize
foreign antigens and protect the body from infection or cancer. The diversity of the TCR repertoire largely determines the
effectiveness of immune protection and the range of recognized antigens. Moreover, individual TCR repertoire contains a
potentially human-readable information about the effectiveness of previous vaccination, the implications of immunotherapy,
as well as the presence and dynamics of diseases. We will talk about how modern technologies of massive sequencing of
TCR repertoires may be useful today — for fundamental immunology and biomedical research, and tomorrow — for the
adaptive immunity; the repertoire of T-cell receptors; high-throughput sequencing; data analysis.
For citation:
Izrael’son M., Kasatskaya S., Pogorelyy M., Kirgizova V., Putintseva, E., Egorov E.S., Britanova O.V.,
Chudakov D.M. Analysis of individual repertoires of t cell receptors. Immunologiya.2016; 37(6): 347-352. DOI:
Для корреспонденции:
Чудаков Дмитрий Михайлович
, д-р мед. наук, проф., E-mail: chudakovdmBgmail.com
Иммунология. 2016; 37(6)
ОБЗОРЫ
For correspondence:
Dr. med. Sci., Professor, E-mail: chudakovdmBgmail.com
on�ict of interest.
The authors declare no con�ict of interest.
grant No. 14-14-00533. Catherine V. Putintseva supported by an individual
ведение
В организме взрослого человека насчитывается до трил
лиона Т-лимфоцитов, задача которых — защитить нас от ин
фекционных и онкологических заболеваний. Разнообразие
потенциальных антигенов чрезвычайно велико, и заложить в
организм защитную реакцию к каждому из них было бы не
возможно с учетом высокой гетерогенности и быстрой эво
люции многих вирусных и бактериальных инфекций.
Адаптивный иммунитет решает эту задачу наиболее
изящным способом — генерирует разнообразие случайных
последовательностей, кодирующих антитела и Т-клеточные
рецепторы (T-cell receptors, T
R), уникальные (точнее, почти
уникальные, см. ниже) для каждого клона B- и Т-клеток соот
ветственно. В течение жизни в нашем организме образуется
огромное разнообразие клонов Т-лимфоцитов с различными
R, каждый из которых потенциально способен распознать
определенную молекулу антигена (точнее, ряд сходных мо
лекул) в составе комплекса MH
(major histocompatibility
complex), презентирующего этот антиген на поверхности за
раженных или опухолевых клеток для Т-киллеров либо на по
верхности антигенпрезентирующих клеток для Т-хелперных
клеток (рис. 1 на обложке).
По современным оценкам, разнообразие репертуара T
наивных Т-лимфоцитов для одного человека может состав
лять более 100 млн уникальных вариантов. Большая часть
R остается незадействованной на протяжении всей жиз
ни. Однако именно большое разнообразие служит залогом
того, что для новой инфекции или опухоли найдутся вари
анты Т-лимфоцитов, специфично распознающие антигены,
характерные для данного патогена или патологических кле
ток. Чем больше вариантов T
R организма, тем выше его
шансы выработать эффективный иммунный ответ, а также
посредством регуляторных функций Т-лимфоцитов обеспе
чить сбалансированную и адекватную работу всей иммунной
Наивные Т-лимфоциты, распознавшие свой антиген,
активно размножаются и атакуют зараженные или злокаче
ственные клетки, а также инструктируют другие клетки им
мунной системы. В то же время Т-клетки памяти — клоны
эффекторных Т-лимфоцитов, участвовавших в каждом им
мунном ответе, сохраняют высокую численность на многие
годы и даже десятки лет. Они защищают нас от повторного
заболевания наряду и во взаимодействии с B-лимфоцитами,
производящими антиген-специфичные антитела и также об
разующими клональные популяции клеток памяти.
Таким образом, текущий индивидуальный репертуар
R определяет эффективность иммунной защиты, диапа
зон распознаваемых антигенов, а также особенности патоло
гических состояний иммунитета. Более того, репертуар T
подобно библиотеке содержит в себе потенциально читае
мую информацию о многих заболеваниях человека, а также
об эффективности прошедшей вакцинации и последствиях
проведенной терапии [1, 2].
Сегодня с помощью технологий массированного секвени
рования мы научились читать «книги» в этой библиотеке —
идентифицировать геномные последовательности для сотен
тысяч и даже миллионов вариантов T
R в образце крови или
исследуемой ткани [3—5] (рис. 2 на обложке).
Антигенная специфичность абсолютного большинства
вариантов T
R остается неизвестна. Однако технологии
идентификации антиген-специфичных T
R активно развива
ются; копится и систематизируется информация о таких ре
цепторах, в том числе относительно часто встречающихся у
разных людей. Таким образом, в будущем станет возможным
использовать информацию, содержащуюся в индивидуаль
ных репертуарах T
R, для диагностики многих инфекцион
ных, а возможно, также и онкологических и аутоиммунных
заболеваний.
Кроме того, уже сегодня мы получили возможность де
тально исследовать «структуру текста» — проводить сравни
тельный анализ репертуаров T
R по широкому спектру пара
метров, таких как меры разнообразия репертуаров, частоты
использования генных сегментов T
R, кластерный анализ
близости репертуаров с использованием визуализации в виде
дендрограмм и многомерного пространства, сравнение сред
ней длины гипервариабельного участка (
DR3), количества
случайно добавленных «
» нуклеотидов, конвергенции (ко
личества нуклеотидных вариантов, кодирующих одну и ту
же аминокислотную последовательность), относительной
силы взаимодействия и других биофизических параметров
аминокислот в составе
Стало возможным исследовать, как структура иммун
ного репертуара меняется с возрастом в ответ на проводи
мую терапию, после иммуносупрессии, трансплантации
клеток крови, вакцинации; как различается состав и струк
тура репертуара T
R для различных функциональных суб
популяций Т-лимфоцитов. Уже сегодня этот подход может
рассказать нам очень многое о фундаментальной природе
адаптивного иммунитета и находит все большее применение
в клинических исследованиях и практических медицинских
приложениях.
Здесь мы остановимся на основных фундаментальных
находках и практических приложениях, ставших возможны
ми благодаря анализу репертуаров T
Формирование исходного репертуара TCR на этапе ре
комбинации.
Огромное разнообразие вариантов Т-клеточных
рецепторов, как и разнообразие антител, формируется в ре
зультате относительно случайной «сборки» — событий ре
комбинации, в ходе которых из имеющегося в геноме набора
так называемых
, D и J сегментов выбирается по одному
варианту.
Относительно произвольная комбинация этих сегментов
собирается в новый ген, причем до сшивания двуцепочечных
разрывов ДНК на стыке сегментов происходит дополнитель
ное случайное удаление и добавление нуклеотидов. На стыке
- и J-сегментов альфа- и гамма-цепей T
R и на протяжении
участка от конца
-сегмента до начала J-сегмента, включая
D-сегмент между ними для бета- и дельта-цепей T
R, фор
мируется наиболее вариабельный регион —
DR3. Именно
DR3 альфа-цепи и бета-цепи T
R (или гамма- и дельта-
цепей) формируется поверхность, распознающая эпитоп ан
тигена в бороздке молекулы MH
Однако после первичной сборки T
R большая часть
(95—98') Т-лимфоцитов погибает в тимусе в результате по
зитивной и негативной селекции, направленной на то, чтобы
отобрать из множества случайно генерируемых последова
тельностей T
R работоспособные и безопасные для организ
ма варианты. Эту жесткую селекцию пройдут только те T
которые, с одной стороны, принципиально способны распо
знавать антигены в контексте MH
, а с другой — не проявля
Immunology. 2016; 37(6)
ют сильного взаимодействия с MH
, несущими собственные
пептиды организма. Такой отбор необходим для того, чтобы
избежать аутоиммунных реакций — атаки Т-клеток на соб
ственные клетки хозяина.
Интересно, что существенная часть зрелых Т-лимфоцитов
помимо функциональных T
R несет на второй, гомологич
ной, хромосоме также и нефункциональные цепи T
R, со
сбитой рамкой считывания либо стоп-кодоном, нарушающи
ми синтез белка. Такие T
R не экспрессируются на поверх
ности клеток, а значит, и не проходят позитивную и негатив
ную селекцию в тимусе. Таким образом, эти на первый взгляд
бесполезные последовательности могут нам многое расска
зать о процессе рекомбинационных событий, в ходе которых
рождается преселекционный репертуар T
R [6—10]. Сюда
можно отнести и частоты используемых генных сегментов,
из которых происходит не вполне случайная сборка T
число случайно добавленных и удаленных нуклеотидов в
местах соединения сегментов и некоторые другие характери
стики, определяющие исходную структуру репертуара T
для каждого человека и в популяции.
На основе данных по репертуарам нефункциональных
вариантов T
R была построена вероятностная модель сбор
ки [9] и установлено нуклеотидное разнообразие уже для
рабочих, функциональных вариантов преселекционного ре
пертуара бета-цепей T
R, составившее у людей (в целом как
популяции) порядка 10
что существенно ниже, чем пред
сказания более простых моделей, считающие процессы вы
бора сегментов и каждый случайно вставленный нуклеотид
независимыми событиями [6] (рис. 3). Создание такой моде
ли позволяет исследователям генерировать искусственные
репертуары T
R на компьютере, практически точно копируя
поведение реальной рекомбинационной машинерии в тимо
цитах человека.
Интересно, что преселекционный репертуар T
R одно
яйцевых (генетически идентичных) близнецов характеризу
ется практически идентичными частотами выбора генных
сегментов [10], что указывает на решающее влияние инди
видуальных генетических особенностей на статистику собы
тий рекомбинации. В то же время, например, в парах мама/
свой ребенок основные характеристики преселекционного
репертуара T
R не ближе, чем таковые для пар мама/чужой
ребенок [8].
Селекция Т-клеточного репертуара в тимусе.
ние репертуаров нефункциональных и функциональных T
наивных Т-лимфоцитов позволяет достаточно точно опреде
лить последствия давления отбора в тимусе. Такие исследо
вания показывают, что тимусная селекция сопровождается
выраженным изменением частот встречаемости генных сег
ментов, из которых собраны T
R. Однако в отличие от собы
тий рекомбинации направленность этих изменений в целом
сходна как у близнецов и родственных индивидуумов, так и
у неродственных, указывая на то, что общепопуляционные
эволюционные факторы доминируют здесь над изменчиво
Подтверждая предыдущие работы [11, 12], такой ана
лиз показывает, что селекция в тимусе преимущественно
оставляет более короткие варианты T
R с низким числом
случайно встроенных нуклеотидов [6, 8, 9] и демонстрирует
определенные аминокислотные предпочтения в специфиче
ских позициях [9], что в целом приводит к существенному
упрощению пост-селекционного репертуара. Тем не менее
оставшееся разнообразие достаточно велико, чтобы охватить
практически весь спектр возможных угроз.
Индивидуальное разнообразие репертуаров функцио
нальных TCR.
В 1998—1999 гг. на основании экстраполяции
данных клонирования и секвенирования буквально несколь
ких десятков последовательностей T
R [13], а также с ис
пользованием метода предельного разбавления [14] индиви
дуальное разнообразие бета-цепей T
R в одном взрослом
человеке было с удивительной точностью оценено в не менее
вариантов.
В 2009 г. индивидуальное разнообразие вариантов бета-
цепей T
R впервые оценили на основании данных массиро
ванного секвенирования. Нижняя оценка составила Б3 • 10
нуклеотидных вариантов [3], позднее эта цифра была увели
чена до Б9 • 10
[15]. Наша текущая оценка достигает 1,2 • 10
для здоровых детей и, возможно, еще вырастет с использова
нием более глубокого секвенирования репертуаров T
Теоретически, учитывая, что общее число Т-клеток в ин
дивидууме достигает триллиона, а также учитывая клональ
ность наивных лимфоцитов ввиду их экспансии в тимусе,
верхнюю границу возможного разнообразия бета-цепей T
можно оценить как Б10
нуклеотидных вариантов (см. рис.
3). Однако каждый вариант бета-цепи T
R может сочетаться
с несколькими вариантами альфа-цепи [13] при образовании
функционального T
R в силу того, что независимая реком
бинация альфа-цепи проходит после нескольких раундов
деления тимоцита, удачно завершившего перестройку бета-
R. Таким образом, максимальное индивидуальное нуклео
тидное разнообразие альфа-бета T
R может составлять по
рядка Б10
При анализе данных массированного секвенирования
репертуаров T
R, как и вообще при анализе данных масси
рованного секвенирования, следует учитывать реальный раз
мер анализируемого образца и ограничения в точности ПЦР
и самого секвенирования [16]. Действительно, если исходная
последовательность нуклеотидов T
R будет прочитана при
секвенировании с ошибками, мы увидим вместо одного ис
ходного клона несколько похожих друг на друга. В то же
время высокогомологичные варианты T
R действительно
присутствуют в реальных образцах. Таким образом, для точ
ной оценки разнообразия нужно уметь видеть и исправлять
ошибки ПЦР и секвенирования, при этом сохраняя реальное
разнообразие библиотеки. В противном случае мы рискуем
либо во много раз переоценить реальное разнообразие, либо,
напротив, потерять реально существующие варианты после
довательностей T
Кроме того, технически возможно провести анализ репер
туара T
R лишь для нескольких миллионов Т-лимфоцитов
[15], а это только вершина айсберга из триллиона Т-клеток
человека. В результате оказывается изученным только «топ»
репертуара Т-лимфоцитов, разнообразие наиболее вероят
ных по событиям сборки и селекции T
R. Таким образом,
характеристики анализируемой части репертуара не впол
не точно отражают характеристики полного репертуара
Т-лимфоцитов, как будет видно из следующего раздела.
Пересечения между индивидуальными репертуарами
Казалось бы, если мы случайно зачерпнем два раза
по 10
вариантов бета-цепей T
R из общего теоретическо
го объема вариантов Б3 • 10
[9], отобранные репертуары не
будут значительно пересекаться между этими двумя вооб
ражаемыми людьми. Однако сравнение полученных высоко
производительным секвенированием реальных репертуаров
R доноров обнаружило одинаковые варианты определен
ных T
R Т-клеток памяти, встречающиеся у многих людей
в популяции [18—20]. Вдобавок обнаружилось неожиданное
сходство репертуаров T
R наивных Т-клеток неродственных
людей [6, 8, 21].
Подобные «общественные», или публичные (public), вари
анты T
R возникают в репертуарах в результате часто повто
ряющихся или конвергентных (разных по природе, но ведущих
к той же нуклеотидной последовательности T
R) событий
рекомбинации. Определенные варианты T
R генерируются,
проходят селекцию в тимусе и встречаются в анализируемом
репертуаре с большей вероятностью, чем остальные [3, 9, 22,
23]. Таким образом, репертуары T
R имеют выраженную ие
рархическую структуру: есть варианты T
R, которые встреча
ются у большинства, если не у всех, людей, бывают варианты,
Иммунология. 2016; 37(6)
ОБЗОРЫ
распространенные в популяции, есть редкие варианты, и нако
нец, существуют уникальные рецепторы, присущие, возмож
но, только одному конкретному человеку.
Кроме того, конвергентная рекомбинация также проду
цирует варианты T
R с разными нуклеотидными последова
тельностями, но с одинаковой последовательностью амино
кислот [20, 22]. Это существенно сокращает функциональное
разнообразие репертуара T
R и увеличивает межиндивиду
альное пересечение репертуаров на аминокислотном уровне.
Непосредственно наблюдаемое пересечение аминокислот
ных репертуаров бета-цепей T
R между двумя индивидуу
мами уже превысило 10
общих вариантов [21]. Более того,
экстраполяция данных глубокого секвенирования на общее
разнообразие рецепторов предполагает примерно в 40' со
впадение общих аминокислотных репертуаров бета-цепей
R между двумя неродственными людьми [21].
Наиболее распространены те последовательности T
которые близки к структуре исходно используемых генных
сегментов (характеризуются минимальным числом случай
но удаленных и добавленных нуклеотидов). Вероятно, такие
R являют собой эволюционно выработанные варианты,
важные для эффективного ответа иммунной системы против
наиболее распространенных инфекций, а также, возможно,
выполнения определенных регуляторных функций [24]. Этот
же эволюционный механизм, по всей видимости, определяет
низкое разнообразие репертуаров T
R у
KT и MAIT кле
ток, находящихся функционально где-то между врожденным
и адаптивным иммунитетом [25, 26].
Как ни странно, общее пересечение репертуаров T
практически не различается у неродственных людей, гаплои
дентичных и HLA-индентичных родственников [6], в парах
мама/родной ребенок [8] и между генетически идентичными
близнецами [10]. Это показывает, что влияние наследствен
ных факторов на формирование репертуаров T
R наивных
Т-лимфоцитов не выходит далеко за рамки использования
схожих частот генных сегментов в ходе рекомбинации.
Получается, что иммуном (так можно обозначить сово
купность генов T
R и антител человека) гораздо более ин
дивидуален, чем геном или транскриптом. Действительно,
геномы и транксриптомы близнецов идентичны, а репертуар
R индивидуален.
И тем не менее, если посмотреть на самую вершину айс
берга, несколько тысяч самых часто встречаемых в перифе
рической крови вариантов T
R, окажется, что пересечение
этой части репертуаров для однояйцевых близнецов значи
тельно выше, чем для неродственных индивидуумов [10].
Наиболее вероятным объяснением этого служит частая анти
гензависимая селекция Т-лимфоцитов, несущих идентичные
варианты T
R, в одинаковых генетических, инфекционных
Пересечения репертуаров между функциональными
субпопуляциями Т-лимфоцитов.
В зависимости от выпол
няемых функций и молекулярных маркеров Т-лимфоциты
подразделяют на большое количество субпопуляций. Не
смотря на ключевую роль в формировании иммунного от
вета и развитии патологических состояний, взаимодействие
этих субпопуляций, степень их родства, а также способности
Т-лимфоцитов к временному или необратимому переходу из
одной функциональной субпопуляции в другую до сих пор
плохо изучены.
Современное программное обеспечение для анализа дан
ных секвенирования репертуаров T
R позволяет проводить
сравнение интересующих функциональных или тканеспеци
фичных субпопуляций Т-лимфоцитов по широкому спектру
характеристик [27, 28]. Такие факторы, как относительное
разнообразие репертуара T
R и клональность, то есть объ
ем, занятый в субпопуляции пролиферировавшими крупны
ми клонами, может отражать статус и степень вовлеченности
субпопуляции в активный иммунный ответ. В то же время
пересечения репертуаров Т-клеточных рецепторов позволя
ют количественно оценить возможные пути перехода клонов
Т-лимфоцитов между функциональными субпопуляциями,
этиологическую близость субпопуляций, влияние внешних и
генетических факторов на формирование разнообразия T
внутри субпопуляций.
Этот подход уже был использован в целом ряде работ
[29—33] и позволил ответить на множество запутанных во
просов. Однако, по большому счету, его потенциал остается
практически не раскрытым современной иммунологией. В
ближайшие годы можно ожидать появления значительного
числа работ, в которых анализ репертуара T
R будет исполь
зован как основной инструмент выявления взаимосвязей и
характеристических изменений в функциональных субпопу
ляциях Т-лимфоцитов.
Анализ репертуаров TCR в медицине.
Массированное
секвенирование репертуаров T
R и антител уже применяют
для детекции злокачественного клона (минимальной оста
точной болезни, МОБ) после проведенной противоопухоле
вой терапии у пациентов с лимфоидными опухолями. Здесь
уникальную последовательность гена иммунного рецепто
ра используют в качестве генетического маркера лейкемии
или лимфомы [34—38]. Измерение уровня МОБ позволяет
определить эффективность воздействия химиотерапии и
прогноза вероятности рецидива и, значит, важно для выбора
стратегии дальнейшей терапии [38—41], такой как аллоген
ная (от другого донора) трансплантация гематопоэтических
стволовых клеток (ТГСК). Первый диагностический набор
для оценки минимальной остаточной болезни в качестве про
гностического маркера при множественной миеломе должен
получить одобрение Food and Drug Association (организации,
обеспечивающей в том числе контроль и надзор за качеством
лекарственных средств и медицинских приборов в США)
уже в 2016 г.
Оценка последствий аллогенной ТГСК, с точки зрения
динамики последующего восстановления Т-клеточного
иммунитета и возможных реакций «трансплантат против
хозяина», также очень важна для рационального совершен
ствования терапевтических протоколов [42] и в ближайшем
будущем может начать применяться для индивидуального
мониторинга лечения каждого пациента.
Рис. 3. Популяционное и индивидуальное разнообразие β-цепей
R человека.
Immunology. 2016; 37(6)
Другой тип трансплантации гематопоэтических ство
ловых клеток — аутологичная пересадка (небольшой части
предварительно забранных собственных клеток пациента) —
используют в сочетании с химиотерапией для лечения тя
желых аутоиммунных заболеваний [43, 44]. В этой области
большой интерес представляет посттрансплантационная
судьба клональных популяций Т-лимфоцитов [45]. Неожи
данно для исследователей анализ репертуаров T
R показал,
что очень большое число клонов Т-лимфоцитов (как мини
мум сотни тысяч) переживает процедуру трансплантации,
но происходят выраженные изменения в их относительной
представленности [46, 47]. При этом популяция
D4 (так
называемые Т-хелперы) все же существенно обновляется, а
вот популяция
D8 (так называемые Т-киллеры) преимуще
ственно формируется из активно размножающихся клонов
памяти, детектируемых до терапии [48]. На основании этих
данных исследователи сегодня ведут усовершенствование
методов трансплантационной терапии аутоиммунных забо
леваний и заболеваний крови.
Еще одним практическим применением анализа им
мунных репертуаров служит количественное определение
клональности и состава проникающих в солидную опухоль
Т-лимфоцитов (Tumor in�ltrating lymphocytes, TILs). Так, не
давние исследования показали, что репертуары TIL относи
тельно гомогенны, если сравнивать первичные и метастиче
ские опухоли, но при этом они отличаются от репертуаров
периферической крови [49]. Такой анализ также потенциаль
но позволяет предсказать ответ на иммунотерапию. Пред
варительные данные для различных типов рака, включая
колоректальный рак, рак яичников и глиобластому, показы
вают, что выраженное присутствие размноженных клонов
Т-лимфоцитов в опухоли может коррелировать с лучшим
прогнозом для пациента.
Мониторинг изменений Т-клеточного репертуара в пери
ферической крови также представляет интерес с точки зре
ния иммунологии опухолей. Так, исследования, отслежива
ющие изменения репертуара T
R, вызванные анти-
терапией, показали, что лучший прогноз реакции на терапию
связан со стабильностью репертуара [50].
Важно, что последовательности антиген-специфичных
R часто совпадают у разных людей. T
R предпочтитель
но распознают определенные мотивы [51, 52], и в контексте
ограниченного разнообразия иммуногенных пептидов это
ведет к возможности использования анализа индивидуаль
ных репертуаров T
R для диагностических целей. По мере
накопления информации о специфичности различных T
и встречаемости конкретных вариантов T
R («слов») и их
паттернов («предложений») при различных заболеваниях
возможности для диагностического использования информа
ции о последовательностях T
R при инфекционных, онко
логических и аутоиммунных болезнях должны существенно
Накопленные сведения об антигенной специфичности
конкретных T
R (а в перспективе, возможно, и алгоритмы
предсказания их специфичности
in silico
) также могут быть
применены для терапии аутологичными T-клетками или ген
ной терапии с использованием T
R для лечения онкологи
ческих [53—55] и инфекционных [56] заболеваний. В то же
время слежение за судьбой введенных клонов Т-лимфоцитов
с помощью анализа репертуаров T
R может помочь в разра
ботке более эффективных терапевтических протоколов.
Потенциально интересный подход к лечению аутоиммун
ных заболеваний может быть основан на том, что идентифи
цированные по последовательности аутоиммунные клоны
Т-клеток могут оказаться избирательно элиминированы на
ряду с Б1/30 общего количества Т-клеток с использованием
антител, специфичных с конкретному сегменту T
R, либо
с использованием генноспецифичных подходов, таких как
морфолины или
RISPR-технологии. Анализ репертуаров
R также, возможно, станет полезен для разработки и
усовершенствования методов вакцинации, а также для диа
гностической оценки эффективности ранее проведенной
вакцинации — с использованием мониторинга динамики ин
дуцированного Т-клеточного ответа.
Наконец, анализ репертуаров T
R позволяет точно оце
нить степень старения адаптивного иммунитета [15], послед
ствия проведенной химиотерапии, полученного облучения,
воздействия факторов окружающей среды, влияния меди
каментов (в том числе иммуномодуляторов и иммуностиму
ляторов). Такой анализ важен для системной оценки приме
няемых методов лечения, разработки более эффективных и
щадящих для адаптивного иммунитета вариантов терапии и
медикаментов, а также методов поддержания функции адап
тивного иммунитета в пожилом возрасте.
Современные методы массированного анализа репертуа
ров T
R, а также антител [57] формируют новое направле
ние в исследованиях адаптивного иммунитета. Уже сейчас
видны потенциальные клинические приложения, и, возмож
но, в ближайшие 5—10 лет мы станем свидетелями вхожде
ния массированного секвенирования репертуаров T
R в еже
дневную медицинскую практику.
Финансирование.
Работа поддержана Российским науч
ным фондом, грант № 14-14-00533. Е.В. Путинцева поддержа
на индивидуальным грантом РФФИ № 16-34-60178.
Конфликт интересов.
Авторы заявляют об отсутствии
конфликта интересов.
ЕРА
РА
V
., Rudd B.D., Davenport M.P. Speci�city, promiscuity, and
precursor frequency in immunoreceptors.
Curr. Opin Immunol.
2013;
W
oodsworth D.J.,
astellarin M., Hol R.A. Sequence analysis of
T-cell repertoires in health and disease.
Robins H.S. et al.
omprehensive assessment of T-cell receptor beta-
chain diversity in alphabeta T cells.
2009; 114: 4099—107.
Freeman J.D.,
arren R.L.,
ebb J.R.,
elson B.H., Holt R.A.
Pro�ling the T-cell receptor beta-chain repertoire by massively
Mamedov I.Z. et al. Preparing unbiased T-cell receptor and antibody
A libraries for the deep next generation sequencing pro�ling.
Front. Immunol.
Robins H.S. et al. Overlap and effective size of the human
D8 - T
Sci. Transl. Med.
Murugan A., Mora T.,
alczak A.M.,
.G., Jr. Statistical
inference of the generation probability of T-cell receptors from
sequence repertoires.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2012; 109:
Putintseva E.
. et al. Mother and child t cell receptor repertoires:
deep pro�ling study.
Front. Iimmunol.
., Murugan A.,
.G., Jr., Mora T.,
alczak A.M.
Quantifying selection in immune receptor repertoires.
Proc. Natl.
2014; 111: 9875—80.
Zvyagin I.
. et al. Distinctive properties of identical twins’ T
repertoires revealed by high-throughput sequencing.
Proc. Natl.
2014; 111: 5980—5.
11.
Y
assai M., Gorski J. Thymocyte maturation: selection for in-frame
R alpha-chain rearrangement is followed by selection for shorter
R beta-chain complementarity-determining region 3.
J. Immunol.
N
ishio J., Suzuki M.,
anki T., Miyasaka
., Kohsaka H. Development
of T
DR3 length repertoire of human T lymphocytes.
Arstila T.P. et al. A direct estimate of the human alphabeta T cell
receptor diversity.
W
agner U.G., Koetz K.,
.M., Goronzy J.J. Perturbation of
the T cell repertoire in rheumatoid arthritis.
Proc. Natl. Acad. Sci.
Britanova O.
. et al. Age-related decrease in T
R repertoire diversity
measured with deep and normalized sequence pro�ling.
J. Immunol.
Иммунология. 2016; 37(6)
ОБЗОРЫ
Bolotin D.A. et al.
ext generation sequencing for T
R repertoire
pro�ling: platform-speci�c features and correction algorithms.
Eur.
Shugay M. et al. Towards error-free pro�ling of immune repertoires.
Nature Meth.
2014; 11: 653—5.
Turner S.J., Doherty P.
., Mc
luskey J., Rossjohn J. Structural
determinants of T-cell receptor bias in immunity.
Nature Rev.
V
. et al. Sharing of T cell receptors in antigen-speci�c
responses is driven by convergent recombination.
Proc. Natl. Acad.
V
., Price D.A., Douek D.
., Davenpor, M.P. The molecular
basis for public T-cell responsesA
Nature Rev. Immunol.
2008; 8:
Shugay M. et al. Huge Overlap of Individual T
R Beta Repertoires.
Front, Immunol
Quigley M.F. et al.
onvergent recombination shapes the clonotypic
landscape of the naive T-cell repertoire.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
Li H. et al. Recombinatorial biases and convergent recombination
determine interindividual T
Rbeta sharing in murine thymocytes.
W
allace M.E. et al. Junctional biases in the naive T
R repertoire
control the
TL response to an immunodominant determinant of
Immunity.
Greenaway H.
. et al.
KT and MAIT invariant T
sequences can be produced ef�ciently by
J gene recombination.
Immunobiology.
Lepore M. et al. Parallel T-cell cloning and deep sequencing of
human MAIT cells reveal stable oligoclonal T
Rbeta repertoire.
Nature Communicat.
Shugay M. et al.
DJtools: unifying post-analysis of T cell receptor
2015; (11): 1004503.
N
.I. et al. tcR: an R package for T cell receptor repertoire
V
. et al. A mechanism for T
R sharing between T cell subsets
and individuals revealed by pyrosequencing.
J. Immunol.
2011; 186:
Henderson L.A. et al. A119: deep sequencing analysis of the T
regulatory and T effector repertoire in juvenile idiopathic arthritis.
Arthr. and rheum.
2014; 66(Suppl. 11): 156.
Fohse L. et al. High T
R diversity ensures optimal function and
homeostasis of Foxp3 - regulatory T cells.
Eur. J. Immunol.
2011; 4:
Y
e L. et al. T
R usage, gene expression and function of two distinct
P3 - Treg subsets within
D25 T cells identi�ed by
expression of
D39 and
Immunol. Cell. Biol.
2015; 15.
. et al. A mechanism for expansion of regulatory T cell
Nature.
Faham M. et al. Deep-sequencing approach for minimal residual
disease detection in acute lymphoblastic leukemia.
2012; 120:
W
u D. et al. High-throughput sequencing detects minimal residual
disease in acute T lymphoblastic leukemia.
Sci. Transl. Med.
2012;
Martinez-Lopez J. et al. Prognostic value of deep sequencing method
for minimal residual disease detection in multiple myeloma.
Ladetto M. et al.
ext-generation sequencing and real-time
quantitative P
R for minimal residual disease detection in B-cell
Logan A.
. et al. Immunoglobulin and T cell receptor gene high-
throughput sequencing quanti�es minimal residual disease in acute
lymphoblastic leukemia and predicts post-transplantation relapse and
Biol. Blood Marrow Transplant.
Logan A.
. et al. High-throughput
DJ sequencing for quanti�cation
of minimal residual disease in chronic lymphocytic leukemia and
immune reconstitution assessment.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
2011;
108: 21194—9.
W
.K. et al. Minimal residual disease monitoring with high-
throughput sequencing of T cell receptors in cutaneous T cell
Sci. Transl. Med.
Logan A.
. et al. Minimal residual disease quanti�cation using
consensus primers and high-throughput IGH sequencing predicts
post-transplant relapse in chronic lymphocytic leukemia.
van Heijst J.
. et al. Quantitative assessment of T cell repertoire
recovery after hematopoietic stem cell transplantation.
Nature Med
Farge D. et al. Autologous hematopoietic stem cell transplantation for
autoimmune diseases: an observational study on 12 years’ experience
from the European Group for Blood and Marrow Transplantation
orking Party on Autoimmune Diseases.
2010; 95:
44.
Snowden J.A. et al. Haematopoietic S
T in severe autoimmune diseases:
updated guidelines of the European Group for Blood and Marrow
Transplantation.
Bone Marrow Transplant.
Muraro P.A., Douek D.
. Renewing the T cell repertoire to arrest
Trends Immunol.
Mamedov I.Z. et al. Quantitative tracking of T cell clones after
haematopoietic stem cell transplantation.
EMBO Mol. Med.
2011; 3:
Britanova O.
. et al. First autologous hematopoietic S
T for
ankylosing spondylitis: a case report and clues to understanding the
therapy.
Bone Marrow Transplant.
Muraro P.A. et al. T cell repertoire following autologous stem cell
transplantation for multiple sclerosis.
J. Clin. Invest.
2014; 124:
1168—72.
Emerson R.O. et al. High-throughput sequencing of T-cell receptors
reveals a homogeneous repertoire of tumour-in�ltrating lymphocytes
in ovarian cancer.
C
ha E. et al. Improved survival with T cell clonotype stability after
TLA-4 treatment in cancer patients.
Sci. Transl. Med.
2014;
W
ooldridge L. et al. A single autoimmune T cell receptor recognizes
more than a million different peptides.
J. Biol. Chem.
2012; 287:
1168—77.
Birnbaum M.E. et al. Deconstructing the peptide-MH
speci�city of
T cell recognition.
Dudley M.E. et al.
ancer regression and autoimmunity in patients
after clonal repopulation with antitumor lymphocytes.
2002;
., Mezzadra R., Schumacher T.
. T
R repertoires of
intratumoral T-cell subsets.
Immunol. Rev.
Gros A. et al. PD-1 identi�es the patient-speci�c
D8(-) tumor-
reactive repertoire in�ltrating human tumors.
J. Clin. Invest.
2014;
Lam S., Bollard
. T-cell therapies for HI
Immunotherapy.
2013; 5:
Boyd S.D., Joshi S.A. High-throughput D
A sequencing analysis
of antibody repertoires.
Microbiol. Spectrum.
2014; 2. doi: 10.1128/
Поступила 01.06.16
Принята в печать 07.06.16

Приложенные файлы

  • pdf 4350534
    Размер файла: 2 MB Загрузок: 0

Добавить комментарий